紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性

用常规法，即有机质用硫酸重铬酸钾外加热容量法， 三角瓶中、无基质对照加酸后过滤和无基质对照直接
碱解氮用碱解扩散法，速效磷用钼锑抗显色分光光度 过滤到盛有 5 ml 酸的三角瓶中。表 4 表明，硫酸加入
法，土壤 pH 用电位法 (水土比 2.5∶1)，阳离子交换量 顺序对溶液吸光度有显著影响。在加酸后过滤的条件
有效磷 Available P
(mg kg-1) 11.94 5.46 0.50 2.53
CEC pＨ (Cmol(+) kg-1)
5.58 12.34 5.76 10.73 4.47 15.72 4.20 27.42
1.2 所用试剂与仪器 （1）0.3%的 H2O2：取 30%的 H2O2 试剂稀释 100 倍
土壤酶活性是土壤生物活性和土壤生化反应强 度反映[1]，也是土壤肥力水平的反映，土壤中的生化反 应过程和养分形态的转化一般都是在土壤酶的参与 下进行的。土壤酶主要来源于土壤微生物的活动和植 物分泌物，土肥力水平[2]、土壤污染状况[3, 4]以及土壤对 环境变化的响应[5]都会影响土壤酶活性。通过分析土 壤酶活性可以评价土壤土壤微生物活性、生物化学反 应程度、土壤肥力水平和土壤污染状况。过氧化氢酶 是生物呼吸、生物代谢过程，以及土壤动物、植物根系 分泌及残体分解[6, 7]中的重要酶类，在生物体(包括土 壤)中，过氧化氢酶的作用在于破坏对生物体有毒的过 氧化氢[8]。因此无论研究土壤、植物，还是动物过氧化 氢酶都具有重要意义。一种快速、简便、准确测定过氧 化氢酶活性的方法无疑对过氧化氢酶的研究具有促 进作用。测定土壤过氧化氢酶活性主要是基于测定过 氧化氢与酶作用后释放出的氧和测定剩余的过氧化 氢两方面。利用紫外分光光度法直接测定土壤过氧化 氢酶活性的方法目前尚未见报道。本试验探索一种利 用紫外分光光度法直接测定土壤过氧化氢酶活性的 方法，本方法的成功将有助于土壤过氧化氢酶分析和 研究。
表 2 两种方法测定的红壤过氧化氢酶活性 (mg H2O2 g-1) Table 2 Catalase activity in red soil measured by two methods
方法 Method
紫外光度法 钾容量法
重复次数 The number
of repeat 10 10
酶活性均值 Mean of
称取土壤 2.00 g 于 100 ml 三角瓶中，加入 40 ml 蒸馏
水，加 5 ml 0.3%的 H2O2 溶液，振荡 20 分钟后加入 1 ml
饱和铝钾矾，立即过滤于盛有 5 ml 1.5 M 硫酸的三角
瓶中，滤干后，吸取滤液 25 ml，用 0.01蚪虔 mol L-1 的高
锰酸钾溶液滴定至紫色，同时做无土对照。
1期
杨兰芳等：紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性
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下，加过氧化氢样品的吸光度已经超出了仪器的读数 范围，无法测得吸光度，无基质对照的吸光度也在 1 以上，这就不能测得土壤过氧化氢酶的活性。这种方 法得到的溶液有颜色，即使用容量法测定也影响终点 判定，在有机质含量高的条件根本就无法滴定。在直 接过滤到盛有酸的三角瓶中的条件下，不管是加过氧 化氢的样品，还是无基质对照，其吸光度均在正常范 围，由此得出的土壤过氧化氢酶活性与用高锰酸钾容 量法测得的酶活性之间无显著差异。
第 42 卷第 1 期 2011 年 2 月
土壤通报 Chinese Journal of Soil Science
Vol . 42 , No . 1 Feb . , 2011
紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性
杨兰芳 1，曾 巧 1,2，李海波 1，闫静静 1
（1.湖北大学 资源环境学院，湖北 武汉 430062；2.中国科学院 寒区旱区环境与工程研究所，甘肃 兰州 730000）
钾 (KMnO4)溶解后定容至 1 L，其准确浓度用标准草酸 钠标定。
（5）紫外分光光度计：UV-9100，北京瑞利分析仪 器有限公司。
（6）震荡器：ZD-8801 回转振荡器，上海康华生化 仪器制造厂。
收稿日期：2009-07-30；修订日期：2009-09-26 基金项目：生物资源保护与利用湖北省重点试验 (湖北民族学院)开放基金项目；湖北省教育厅重点项目(D20081010) 作者简介：杨兰芳 (1964-)，男，博士，副教授，湖北来凤人，研究方向：土壤物质循环及其环境效应。
1 材料与方法
1.1 土壤材料 试验所用土壤材料为红壤 1、红壤 2、山地黄壤和
山地暗黄棕壤。红壤 1 和红壤 2 采自武汉市鲁磨路南
望山山脚的荒芜耕地，山地黄壤采自庐山三宝树附 近，山地暗黄棕壤采自庐山博物馆旁边。土壤采回后 在实验室内挑出根系等植物残体和岩石碎块，自然风 干后过 1 mm 筛备用。所用土壤之基本理化性质如表1。
摘 要：土壤过氧化氢酶是土壤中非常重要酶类，为了探索一种测定土壤过氧化氢酶活性的简单、可靠而适用的测定方法， 我们进行了利用紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性的方法研究。结果表明，紫外分光光度法重现性优于高锰酸钾容 量法，溶液在 240 nm 处的吸光度可以稳定 11 小时以上，对 4 种土壤分析表明，紫外分光光度法的测定结果与高锰酸钾容 量法之间无显著差异。传统高锰酸钾容量法加酸后再过滤容易导致溶液有颜色，过滤液易浑浊，过滤时间长。本试验表明， 在过滤前加入饱和铝钾矾，然后直接将溶液过滤到盛有酸的容器内，既可以使溶液无色，又能使溶液澄清透明，还能使过滤 速度大为加快。总之紫外分光光度法重现性好、稳定时间长，操作简单，不需要特殊试剂，避免了容量法的滴定误差，是一种 值得推广普及的测定土壤过氧化氢酶活性的好方法。 关 键 词：紫外分光光度法；土壤；过氧化氢酶；容量法 中图分类号：S151.9 文献标识码：A 文章编号：0564-3945（2011）01-0207-04
即可，溶液准确浓度用高锰酸钾标定。 （2）1.5 mol L-1 硫酸：取 42 ml 浓硫酸，稀释后定容
至 500 ml。 （3）饱和铝钾矾：铝钾矾即明矾 (KAl(SO4)2·12H2O)
在 20 ℃溶解度为 10.84 g，30 ℃的溶解度为 15.41g. （4）0.01蚪虔 mol L-1 高锰酸钾：称取 3.16 g 高锰酸
溶液的吸光度，As 是样品溶液的吸光度，Ak 是无基质对
照溶液的吸光度，C 是高锰酸钾的浓度，V 是吸取 V0 ml
的无土对照即空白溶液用高锰酸钾滴定所消耗的高
锰酸钾溶液的体积。
（2）高锰酸钾容量法酶活性的计算：
E=(V-Vs)C× 51 V0
×
17 W
。V 是 V0 体积空白溶液所
表 3 不同放置时间(h)下的吸光度 Table 3 The absorbency in various placing time
下的吸光度，即可得到溶液中过氧化氢的浓度，从而 算两种方法的酶活性。
可计算酶的活性。 （2）测定步骤 称取土样 2.00 g 于三角瓶，加入 40 ml 蒸馏水，加
入 5 ml 0.3%的 H2O2 溶液，在震荡机上震荡 20 分钟。取 下后迅速加入饱和铝钾矾 1 ml，立即过滤于盛有 5 ml 1.5 mol L-1 的硫酸溶液的三角瓶中。滤干后，将滤液直
表 4 硫酸加入顺序对吸光度的影响 Table 4 The addition sequence of sulfate acid
处理 Treatment
有基质 无基质
吸光度 Absorbency
加酸后过滤
过滤于盛有酸容器中
Filtering after acid addition
Filtering into acid
光度相当于过氧化氢的毫克数，A0 是无土对照即空白
由表 2 可见，紫外分光光度法测定的土壤过氧化 氢酶活性与高锰酸钾容量法测定土壤过氧化氢酶活 性的平均值非常接近，t 检验表明，两种方法测定结果 之间无显著差异（P =0.663）。10 次重复的重现性来看， 高锰酸钾容量法的标准差和变异系数大于紫外分光 光度法。说明紫外分光光度法的重现性优于高锰酸钾 容量法。 2.2 稳定性
处理
放置时间 Time
Treatment
0
2
3
4
11
有基质 0.672±0.003 0.672±0.004 0.666±0.006 0.669±0.007 0.676±0.006
无基质 0.104±0.005 0.103±0.003 0.101±0.005 0.104±0.004 0.108±0.005
读数溢出
0.774±0.005
1.139±0.101
0.115±0.004
2.4 铝钾矾的影响 取红壤 2 称取 30 份，每份 2.00 g。设置 6 个处理，
即加过氧化氢的样品和不加过氧化氢的无基质对照。 按振荡前加、振荡后加 1 ml 饱和铝钾矾和不加铝钾 矾，每处理重复 5 次。表 5 可见，铝钾矾的加入与否以 及加入方式对溶液吸光度有显著影响。无论是有基质 的样品还是无基质对照，不加铝钾矾时，过滤速度慢， 且溶液浑浊，所以不加铝钾矾的溶液吸光度显著高于 加铝钾矾的吸光度。铝钾矾的加入顺序对有基质样品 的吸光度有显著影响，振荡前加铝钾矾的吸光度大于 振荡后加铝钾矾的吸光度。无基质对照的吸光度不受 铝钾矾加入顺序的影响，振荡前加和振荡后加二者的 吸光度无显著差异。
enzyme activity 5.19 5.36
标准差 Standard error
0.20 0.27
变异系数 CV
3.85 5.04
接在 240 nm 处用 1 cm 石英比色皿测定吸光度 As。同
时做无土 A0 和无基质 Ak 对照。
1.3.2 高 锰 酸 钾 滴 定 法 测 定 土 壤 过 氧 化 氢 酶 活 性
将红壤 1 称取 10 份，每份 2.00 g，其中 5 份加过 氧化氢，5 份不加过氧化氢用作无基质对照。按操作步 骤测定吸光度，然后分别在放置 2、3、4、11 小时后测 定吸光度。表 3 可见，放置时间对吸光度影响很小，无 论是有基质的样品，还是无基质的对照，各放置时间 之间无显著差异，说明在酸性条件下，过氧化氢很稳 定，放置 11 h 后吸光度无显著变化。