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2007锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用_范万红

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锦鲤疱疹病毒病的研究进展

锦鲤疱疹病毒病的研究进展

锦鲤疱疹病毒病的研究进展作者：吕大成来源：《吉林农业》2011年第09期我国是水产养殖大国，近30年来水产业发展尤为迅速，目前水产养殖产量已经超过捕捞产量，约占养殖业的70%以上。

但是，随着水产养殖业的迅速发展，一些水产疾病的爆发也越来越频繁。

据统计，至2002年全国水产病害达到185种，直接造成经济损失141亿元。

目前，水生动物疾病种类繁多，且发病时间延长、传播速度快，危害程度大，发病后死亡率高。

更严重的是已经有所控制的严重疾病有返强趋势，近年来，在吉林、辽宁等地区的网箱养殖发展迅速。

随着淡水养殖业的迅速发展，各种疾病造成的损失也迅速上升。

尤其是近年来发生的锦鲤疱疹病毒病，给鲤鱼养殖业带来了巨大的经济损失。

2007年，我国质检总局要求停止从日本和印尼进口锦鲤和鲤鱼，将锦鲤疱疹病毒作为必检项目。

锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒（KHV）引起的锦鲤、鲤鱼及其普通变种发生鳃坏死和间质性肾炎的一种高致病性和高死亡率的疾病。

该病多发生在水温为18℃～28℃的春秋季节，但目前有低温下发病的趋势。

该病具有高度传染性，发病率和死亡率均高达80%～100%。

在锦鲤和鲤鱼的国际贸易中，由于缺乏相关的检疫制度，促使了该病在世界范围内暴发性流行，给锦鲤和鲤鱼养殖业带来了破坏性影响。

1.国内外流行现状自从锦鲤疱疹病毒病暴发以来，各个国家和地区几乎每年都发生。

2003年以来，我国东北地区的框镜鲤和普通鲤鱼发生暴发性疾病，死亡率高达80~90%，经PCR检测为KHV阳性；近两年来，KHV检测也均为阳性。

另外，有报道，近年来在菲律宾非法进入的锦鲤中检测到KHV。

2008年，中国台湾地区检测KHV阳性率为7%；据2010年鱼病统计结果显示，泰国也有KHV的发生。

锦鲤疱疹病毒病的全球性暴发，给锦鲤观赏业、鲤鱼养殖业以及国际贸易等造成了极大的经济损失，并引起了各国的高度重视，因此，各国家和地区应加强合作，严格控制KHV的发生与流行。

PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因

PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因

PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因乌日琴;刘中勇;黄宝春【期刊名称】《检验检疫学刊》【年(卷),期】2005(015)002【摘要】[目的] 建立锦鲤疱疹病毒的PCR检测方法,并提高检测的准确率和简化操作程序.[方法] 分别利用蛋白酶K-酚/氯仿抽提、异硫氰酸胍(GuScN)抽提法从组织样品中提取KHV病毒DNA,并设计两对特异性引物进行PCR检测.[结果] 异硫氰酸胍抽提法可以有效地去除样品中的影响因素,而蛋白酶K-酚/氯仿抽提法提取的DNA中不能检测到病毒的DNA片段.同时评价了两对特异性引物,选择灵敏性高和操作简便的引物PQDS和PQDV作为快速检测的引物.[结论] 本实验初步建立了快速、灵敏和操作简便的KHV病毒的PCR检测方法.【总页数】3页(P6-8)【作者】乌日琴;刘中勇;黄宝春【作者单位】广州白云机场出入境检验检疫局;广东出入境检验检疫局;广州白云机场出入境检验检疫局【正文语种】中文【中图分类】S9【相关文献】1.多重PCR方法快速检测牛乳中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型 [J], 李荔枝;张军;胡萍;周国君;王晓静;朱建荣2.快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的PCR方法学评价 [J], 陈宇明;胡婷婷;倪洁;王蓓;蒋晓飞;关明;徐峰;刘维薇3.快速检测肺炎链球菌recA、ply及16S rRNA基因的多重降落PCR方法建立及应用 [J], 侯艳娇;罗欲承;邵晨;倪颖;邵世和4.多重PCR方法检测锦鲤疱疹病毒基因 [J], 乌日琴;陈芳;张艺宜;刘芸莉;刘中勇;林志雄5.利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因 [J], 孟庆峰;张琼;宋战昀;肖成蕊;刘阳;蔡阳;张艳;钱爱东;王伟利因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

锦鲤疱疹病毒囊膜蛋白ORF132的克隆及分析

锦鲤疱疹病毒囊膜蛋白ORF132的克隆及分析

锦鲤疱疹病毒囊膜蛋白ORF132的克隆及分析刘振兴;柯浩;孟轩;林敏;陈棠堂;颜远义【摘要】提取感染锦鲤疱疹病毒(KHV)的锦鲤(Cyprinus carpio koi)肾脏组织DNA,通过PCR扩增了KHV ORF132基因.该基因全长513 bp,所编码的蛋白包含170个氨基酸,分子量18.5 ku,等电点8.11,有信号肽以及2个潜在的O糖基化位点.应用DNA Star程序,通过综合分析二级结构柔性区、蛋白的亲水性、表面可能性、抗原性指数,预测KHV ORF132蛋白主要B细胞表位区段位于Leu40～Ala45、Asn53～Pr066、Arg97～Thr 118、Ala125～Pr0136、Glu140～Arg145、Asn160～Arg170.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2011(038)006【总页数】3页(P134-136)【关键词】锦鲤疱疹病毒;囊膜蛋白;B细胞表位【作者】刘振兴;柯浩;孟轩;林敏;陈棠堂;颜远义【作者单位】广东省农科院兽医研究所,广东广州510640;广东省兽医公共卫生公共实验室,广东广州510640;广东省农科院兽医研究所,广东广州510640;广东省兽医公共卫生公共实验室,广东广州510640;广东省农科院兽医研究所,广东广州510640;广东省兽医公共卫生公共实验室,广东广州510640;广东省农科院兽医研究所,广东广州510640;广东省兽医公共卫生公共实验室,广东广州510640;中山市海洋与渔业局,广东中山528400;广东省水生动物疫病预防控制中心,广东广州510222【正文语种】中文【中图分类】S965.116;Q785锦鲤疱疹病毒（Koi Herpesvirus，KHV）即鲤科疱疹病毒 3（Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3）, 是一种双链、线性DNA病毒，基因组大小295 kb，最外层为囊膜结构[1-2]。

单纯疱疹病毒2型ICP4基因荧光实时定量PCR检测方法的建立

单纯疱疹病毒2型ICP4基因荧光实时定量PCR检测方法的建立

单纯疱疹病毒2型ICP4基因荧光实时定量PCR检测方法的建立刘继峰;关翠萍;唐旭;徐田红;许爱娥【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2008(37)12【摘要】目的建立实时荧光PCR定量检测单纯疱疹病毒2型(HSV2)ICP4基因的方法.方法依据HSV2 ICP4基因序列设计引物.PCR纯化后克隆到pMD-18T载体上进行测序,抽提重组质粒作为标准品.根据测序结果设计荧光定最PCR的引物和探针,质粒标准品10倍稀释后进行扩增,建立标准曲线,并进行灵敏度和可靠性分析.结果测序结果显示在扩增的PCR片段中有在A-G无和T-C的无义突变.标准品101以下没有检测信号,101具有明确的检测信号,因而检测的灵敏度为10.可靠性测定结果:107-101进行10次重复Ct值的平均值分别为14.275±0.137、17.988±0.162、22.081±0.259、25.957±0.345、29.565±0.203、33.269±0.287、37.737±0.698,变异系数分别为0.965%、0.902%、1.174%、1.329%、0.686%、0.862%、1.851%.Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系.回归系数为0.998.结论成功建立了HSV2 ICP4基因实时定量荧光PCR 检测的方法,灵敏度高,重复性好,可用于HSV2 ICP4基因的定量分析.【总页数】3页(P36-38)【作者】刘继峰;关翠萍;唐旭;徐田红;许爱娥【作者单位】310009,浙江省杭州市第三人民医院皮肤科;310009,浙江省杭州市第三人民医院皮肤科;310009,浙江省杭州市第三人民医院皮肤科;310009,浙江省杭州市第三人民医院皮肤科;310009,浙江省杭州市第三人民医院皮肤科【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.荧光实时定量PCR检测尼罗罗非鱼GH、GHR、IGF-I基因方法的建立及初步应用 [J], 马细兰;易诗白;张勇;李云;黄卫人;刘晓春;林浩然2.沙眼衣原体、单纯疱疹病毒2型、人乳头瘤病毒16型多重荧光定量PCR检测方法的建立及其应用 [J], 胡天;卓永光;樊祖茜;黄永霞3.沙眼衣原体、单纯疱疹病毒2型双重荧光定量PCR检测方法的建立 [J], 卓永光;田龙;樊祖茜;胡天4.鸭病毒性肠炎病毒荧光实时定量PCR检测方法的建立和应用 [J], 郭宇飞;程安春;汪铭书;贾仁勇;文明;周伟光;陈孝跃5.转基因豆粕中内源基因和外源基因检测方法的建立 [J], 于忠娜;苗向阳;单虎;李建霞;丁兆忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

TaqMan荧光定量PCR快速检测锦鲤疱疹病毒方法的建立与应用

TaqMan荧光定量PCR快速检测锦鲤疱疹病毒方法的建立与应用

TaqMan荧光定量PCR快速检测锦鲤疱疹病毒方法的建立与应用摘要：本研究采用一步DNA提取法快速提取锦鲤组织样品中的DNA，利用针对锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）TK基因保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，经反应体系优化，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过对荧光信号的实时监测实现对KHV的定量检测。

整个过程快速、简捷，操作简单，可对KHV进行快速有效的诊断，具有一定的应用价值。

关键词：锦鲤疱疹病毒；荧光定量PCR；TaqMan；一步法中图分类号：S941.41+9文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）07-0125-04锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）引起的一种传染性疾病。

KHV能够感染锦鲤、鲤鱼和剃刀鱼，其鱼苗、幼鱼、成鱼均可感染。

锦鲤疱疹病毒病多发于春、秋季，潜伏期两周左右，鱼发病并出现症状24～48 h后开始死亡，2～4 d内死亡率可迅速达到80%～100%[1，2]。

此病首先在以色列暴发，接着美国、欧洲（如英国、德国、比利时）及亚洲一些国家均有此病发生，给锦鲤和鲤鱼养殖业造成重大经济损失[3，4]。

锦鲤疱疹病毒颗粒呈球状，有囊膜，直径约170～230 nm，其核衣壳为对称十面体，直径为100～110 nm，该病毒由31种病毒多肽组成，遗传物质为双链DNA，基因组大小约为277 kb[5，6]。

目前锦鲤疱疹病毒病的检测方法有电镜检测、ELISA、普通PCR和荧光定量PCR等[7]。

TaqMan荧光定量PCR是在PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一种特异性荧光探针，该探针为一段寡聚核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′→3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步[8～11]。

锦鲤疱疹病毒病免疫学检测方法——单克隆抗体技术研究进展

锦鲤疱疹病毒病免疫学检测方法——单克隆抗体技术研究进展

锦鲤疱疹病毒病免疫学检测方法——单克隆抗体技术研究进展于慧;袁海延;金晔;黄冬冬【期刊名称】《科学养鱼》【年(卷),期】2016(000)003【总页数】2页(P54-55)【作者】于慧;袁海延;金晔;黄冬冬【作者单位】吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118【正文语种】中文锦鲤疱疹病毒病（KHVD）是由锦鲤疱疹病毒（KHV）引起的一种非常严重的、法定的传染病。

它通过锦鲤、鲤鱼的贸易传播。

该病死亡率高达80%～100%。

被感染的鱼常见的临床症状为有白色斑，眼凹陷，脾脏和肾脏肿大，鳃部坏死。

CyHV-3在温度15～25℃易感染，可从死鱼的肾、鳃、脾、小肠、肝脏和大脑中分离，其基因组包含约29.5万个碱基对（kb），编码156个开放性阅读框。

目前还没有有效的药物和疫苗可以抑制锦鲤疱疹病毒的感染。

因此控制该病原的流行主要依靠检验、检疫和隔离等手段。

现在针对KHV检测方法的研究主要包括分子生物学技术和细胞培养法。

细胞培养法检测流程至少需要2周，敏感细胞系繁殖难度大、灵敏度低；分子生物学方法除OIE列举的PCR方法外，还先后建立了4种环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）的检测方法，我国的科研工作者也建立了两种荧光定量PCR检测方法。

不过分子生物学方法只能检测病毒核酸，不能直接检测活病毒，且容易产生DNA污染，导致检测结果呈假阳性。

免疫学技术作为一种可以检测到活病毒的技术，弥补了以上方法的不足。

该技术的研究需要以抗原和抗体为基础。

对于CyHV-3，目前已经有几项研究利用免疫化学技术的抗体对抗原亲和力。

在2005年Adkinson Oren和Hendrick成功用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测CyHV-3，在最近的一项研究中，CyHV-3的多克隆抗体被用于检测目的病毒，研究表明该技术可能比其他传统PCR方法更敏感。

PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因

待检样品组织 50 ~ l00mg，加入 300!L 裂解液，将 组织捣碎充分溶解，离心 l2000 r / min，离心 5min，取上 清液置于 l.5mL 离心管中，加入 l0 ~ l5!L GOIden bead （上海 申 能 博 彩）充 分 摇 匀，室 温 放 置，并 使 充 分 混
匀。l2000 r / min，离心 lmin。弃去上清，加入 200!L 70%乙醇，反复洗涤 2 次。弃去上清，50C 条件下干 燥 l0min。30!L 灭菌水溶解，充分摇匀。l2000 r / min， 离心 lmin，上清液即为待测样品 DNA。 2 . 2 . 2 蛋白酶 K - 酚 / 氯仿抽提法：见文献［2］。 2.3 引物设计及序列
引物进行筛选，确定了快速检测中应用的一对引物。
2 材料和方法 2 . l KHV 病毒株
本室自存，在水族箱内感染健康锦鲤至出现发
病症状取患病组织作为待测样品。
2 . 2 DNA 提取方法比较 2.2.l 异硫氰酸胍抽提法：
裂解液：异硫氰酸胍（GLSON）6 mOI / L、N - 十二 烷基酰基氨酸（N - LaLrOyI SarOOSine）0 . 5% 、二硫苏 糖醇（DTT）lmmOI / L、醋酸钠 300 mmOI / L、糖原 20!g。
图 l 是分别利用 2 种不同的 DNA 制备方法从 病鱼组织中分离锦鲤 KHV 病毒 DNA 进行 PCR 检测 的结果。结果显示利用蛋白酶 K - 酚 / 氯仿抽提法 不能检测患病锦鲤体内的 KHV 病毒，而利用异硫氰 酸胍抽提 法 可 以 有 效 地 从 患 病 锦 鲤 的 组 织 中 制 备 DNA，病毒浸染组织 PCR 检测呈阳性，PCR 产物大小 和预期一致。 3 .2 两种不同核酸制备方法在 KHV 的 PCR 检测 中敏感性的比较

利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因_孟庆峰


细胞悬液，提取 DNA，根据 GenBank 中登录的 KHV 基因序列及出入境检验检疫行业标准推荐的基因(ORF7)，设
计合成 3 对特异性引物，针对胸苷激酶基因(TK)、聚合酶基因(Sph)和 ORF7 基因进行 PCR 检测。通过优化后的
反应体系进行特异性、敏感性试验和样品检测。结果表明：3 对引物能够分别特异性扩增出 409 bp、292 bp 和 484 bp
孟庆峰 1,2，张 琼 3，宋战昀 2，肖成蕊 2，刘 阳 2，蔡 阳 2，张 艳 1，钱爱东 1*，王伟利 2*
(1. 吉林农业大学 动物科技学院，吉林 长春 130118；2. 吉林出入境检验检疫局，吉林 长春 130062； 3. 辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116001)
摘 要：为建立锦鲤疱疹病毒(KHV)多靶基因 PCR 检测方法，本实验将 KHV 接种鲤鱼鳍条细胞，收获病变
2 结果与讨论
2.1 3 个基因 PCR 检测结果 分别采用设计的 3 对 引物以 KHV DNA 为模板进行扩增，扩增产物用 1 % 琼脂糖凝胶进行检测，分别在大约 409 bp、484 bp、 292 bp 位置出现目的条带(图 1)。将测序结果进行分 析表明 3 段基因均为目的基因。
本研究基于 TK 基因、Sph 基因和出入境检验检 疫 行 业 标 准 推 荐 的 ORF7 基 因 [6]的 保 守 序 列 设 计 合 成 3 对 特 异 性 引 物 ， 以 KHV 标 准 株 核 酸 为 模 板 ， 利用优化的反应体系对 KHV 3 个主要基因进行 PCR 扩增(表 1)。结果表明，应用 3 个反应体系均能扩增 出目的条带，无杂带产生，具有较好的特异性。 2.2 KHV P CR 检测特异性试验结果 以优化的反 应体系及反 应条件对 KHV、SVCV、IHNV 和 CHV 进行扩增。结果显示，仅 KHV 核酸扩增 出目 的 条 带，其他病毒株及阴性对照均未扩增出条带(图 2)。 表明 PCR 检测 KHV 特异性好，无交叉反应。 2.3 KHV P CR 检测敏感性试验 利用建立的方法对 不同稀释倍数的模板进行扩增，经过计算，ORF7 基 因、Sph 基因和 TK 基因的 PCR 最低检测病毒核酸拷 贝数分别为 1.6×107 copies/μL、2.66×106 copies/μL 和 1.9×106 copies/μL，敏感性较好(图 3～图 5)。敏感 性试验表明 TK 基因的 PCR 最低检测病毒核酸拷贝 数最低，同时有研究表明 TK 基因在致病性中发挥 着作用[7]，在该病毒种属中也相对保守，所以利 用 TK 基 因 进 行 鉴 定 比 用 另 两 种 基 因 进 行 确 证 效 果 好。

锦鲤疱疹病毒病简述

锦鲤疱疹病毒病简述段宏安;周毅;徐晔;姚燕林;丁超;曹洁;范广宇;孟祥龙【摘要】锦鲤疱疹病毒病是一种危害严重，尚无有效治疗方法的高致病性传染病。

本文汇集大量科研成果，从病原学、流行病学、病理学三个角度对该病毒的特性进行简述，在此基础上，推荐了实验室检测技术，提出了防控建议。

%Koi herpesvirus disease(KHVD)is a serious and highly infectious disease and there is still no effective treatment for it at home and abroad. In the paper,the characteristics of the virus were described based on research findings from its etiology,epidemiology and pathology. Laboratory test techniques were recommended and prevention and control measures were proposed.【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2015(000)006【总页数】5页(P48-51,52)【关键词】锦鲤疱疹病毒病;KHV;病原学;流行病学;病理学;预防与控制;检测技术【作者】段宏安;周毅;徐晔;姚燕林;丁超;曹洁;范广宇;孟祥龙【作者单位】连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042;连云港出入境检验检疫局，江苏连云港 222042【正文语种】中文【中图分类】S943锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease，KHVD）是由锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）感染鲤鱼及锦鲤等变种而引起的一种高致病性急性传染病。

2007锦鲤疱疹病毒病的诊断和应对措施_王玉群

１ 锦鲤疱疹病毒病全球发病情况
１９９８ 年， 在以色列首先暴发锦鲤疱疹病毒病， 使 以色列锦鲤和鲤鱼养殖业遭受到毁灭性的打击。紧接 着， 美国和欧洲一些国家， 如英国、德国、比利时、荷兰， 亚洲一些国家， 如印度尼西亚、日本和南韩养殖的锦鲤 也因锦鲤疱疹病毒病而大量死亡。２００２ 年 ４ 月中旬在 印度尼西亚养殖的锦鲤和鲤鱼中暴发此病， 损失达 ５００ 万美元。２００３ 年 １０ 月日本 １０ 余个县暴发该病， 到 １１ 月份已经造成近千吨的鲤鱼和锦鲤死亡。２００４ 年 ４ 月， 我国的台湾省报道流行锦鲤疱疹病毒（ ＫＨＶ） 病， ＫＨＶ 病毒从 ２００２ 年 １２ 月就已入侵台湾， 由于未 能引起足够重视， 造成了锦鲤的大量死亡， 死亡率高达 ８０％￣１００％。
５ 预防与控制
５．１ 预防 禁止养殖走私苗种； 加强锦鲤进口的检验检疫； 减
少鲤投放和养殖密度， 降低单位面积产量； 进入场地的 交通工具和人员用“金维碘”进行消毒 ， 每个池塘 的生 产用具不要混用， 经常用消毒剂进行消毒； 在易发病前 期， 定期在池埂用“金维碘”进行高浓度泼洒， 减少病毒 互相传播的可能性； 选择适宜饲料， 发病高峰前 １０ ｄ， 减少饵料投喂量至平常投喂量 ４０％； 在鱼 类发病前， 投喂适当药物 （ 每天投喂“应激开胃宝”＋“溃疡平”＋ “肝胆康”） ， 提高鱼体免疫力和提高鱼 体凝血因子含
４ 发病时间
据报到该病毒的试验室最适培养温度是 ２１℃， 发 病水温 １８℃～２９℃， 发病高峰水温为 ２２℃～２８℃， 该病在 春季和秋季多发生， 考虑到我国跨越几个气候带， 所以 国内如果发生锦鲤疱疹病毒病， 大致发生时间如下： 中
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3. 端标记 TA M RA。然后利用梯度稀释的阳性样品克隆质粒进行定量 PCR 反应, 制作标准 曲线, 得到病毒拷 贝数与 Ct 值 的
关系为: Ct = - 3. 45 lgX+ 42. 73( 相关系数 R 2= 0. 989) 。通过试验检测得到实时荧光定量 PCR 对 KHV 的灵敏度为 32 个病 毒核酸拷 贝数, 同时, 设计的引物和探针对于鱼类细胞系和其它鱼类 病毒没有扩 增反应, 表现出 较好的特异 性。实验结果 表
正向引物: 5.- GCT GCAT CGCCGT CAAG- 3. ; 反向引物: 5.- GCT GT GCAT GGCCACCT T- 3. ; 探针: 5.- FAM- ACGCCATAGACCAGCGCTACACCGTAMRA- 3. 。 1. 3 病毒 DNA 提取方法 取鱼的脑、肝、脾和肾脏各 100 mg, 放在 1. 5 m L 的离心管中, 在 10 e 条件下, 按文献[ 14] 的方法抽提核 酸 DNA。 1. 4 DNA 片段的克隆及阳性质粒的制备 设计引物( KHV- T K- F1: 5.- AT G GCT AT G CT G GAA CT G GT G A- 3. 和 KHV- T K- R1: 5.- CCC GT G AGA- CAG GGA CGA CA- 3. ) 扩增 KHV T K 基因 530 bp 的 DNA 片段。选取阳性 PCR 产物进行克隆。制备 10 LL 连接反应液, 其中: pM D18- T Vector DNA 1 LL 、 Cont rol Insert DNA 1 LL 、ddH 2O 3 LL、Solut ion I 5 LL , 16 e 连接 30 min。将 10 LL 连接反应液转化 JM 109 感受态细胞 ( 100 LL ) 。在含有 X- Gal, IPT G, Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养, 形成单菌落。挑选白色菌 落, 并培养菌液。采用碱裂解法提取质粒。 1. 5 灵敏度实验及标准曲线 提取的质粒 DNA 以 10 倍系列稀释, 进行实时荧 光定 量 PCR。用核 酸蛋 白分 析仪 测定 质粒 DNA 的 OD260 吸收值, 计算出 1 LL 质粒的质量。1 对碱基的 质量大约为 10- 15 Lg , 因此质粒拷贝数/ LL = { 总含量 ( Lg/ LL) } / { 质粒分子 碱基数 @ 10- 15 Lg } 。根据 拷贝 数以及对应的 Ct, 利用分析软件得到标准曲线。 1. 6 特异性实验 抽提草鱼性腺细胞( CO) 、鲤鱼上皮瘤细胞( EPC) 、 海水鲤科鱼类细胞( FHM ) 和锦鲤鳍条细胞( KF) 4 种 鱼类细胞系和传染性胰脏坏死病毒( IPNV) 、病毒性出 血性败血症病毒( VH SV ) 、流行性造血器官坏死 病毒 ( EHNV) 、甲鱼虹彩病毒( 9 701 株) 、草鱼 呼肠孤病毒 ( GCRV) 、传染性造血器官坏死病毒( IH NV ) 6 种病毒 核酸进行扩增, 检测引物和探针的特异性。 1. 7 数据分析 定量 PCR 反应结束后, 利用 SDS( Sequence Detect ion System ) 2. 1 软件进行数据分析, 包括查看扩增曲 线、Ct 值。计算质粒不同稀释度拷贝数与 Ct 值的相关
of r ea-l time PCR of KHV
/ mmol# L- 1
组分 Com pon ent
Buffer
试剂浓度 Concentration of
reagent 10 @
终浓度 F inal concentrat ion
1@
M gCl2
25
3
dN T P M ix ture
10
1
正向引物
10
( 1. 深圳出入境检验检疫局, 广东 深圳 518001; 2. 山东出入境检验检疫局, 山东 青岛 266002)
摘 要: 研究建立并完善了 T aqman 实时荧光定量 PCR 检测锦 鲤疱疹 病毒( KHV ) 的方法。 首先通 过选取 KHV 病毒 T K
基因的保守序列( GenBank AB182940) , 利用 PR IM ER EXPRESS 2. 0 设计引物和探针。其中 T aqman 探针的 5. 端标记 FAM ,
锦鲤疱疹病毒病是近年来在锦鲤和鲤鱼养殖生产
中发生的 1 种新病, 但已经显示出对渔业生产的严重 危害性[ 1] 。锦鲤疱疹病毒( Ko i Herpesvirus, KH V ) 是 锦鲤疱疹病毒病的病原, 主要感染锦鲤和鲤鱼, 并使之 大规模突然死亡。1998 年 5 月, 此病毒病在以色列首 先发生暴发, 锦鲤和鲤鱼死亡率高达 75% ~ 95% [ 2- 3] 。 接着, 美国和欧洲一些国家如英国、德国、比利时以及 亚洲一些国家[ 4- 5] , 如印度尼西亚、日本和南韩养殖的 锦鲤也因锦鲤疱疹病毒病而大量死亡[ 6, 8] 。KHV 带来 的严重危害已引起世界动物卫生组织( OIE) 和世界粮 农组织亚洲水产协会的高度关注。国家质检总局发布 警示通报, 要求暂停从日本和印度尼西亚进口锦鲤和 鲤鱼, 将 KHV 作为必检项目, 并加强对从其他国家和 地区进口的锦鲤和鲤鱼的检疫。
1997 年, 美国的研究人员建立了锦鲤鳍条细胞系 ( K F) [ 7] , 1998 年以色列和美国的研究人员从大量死亡 的锦鲤中率先分离出锦鲤疱疹病毒, 并经人工感染试验 证实这种疱疹病毒是引起世界各国锦鲤暴发性死亡的 主要病因[ 9, 11] 。该病毒的适合培养温度是 15~ 25 e , 最 适生长温度是 20 e , 只对锦鲤细胞系敏感, 能引起组织 细胞融合, 细胞质肥大, 产生细胞病变[ 12] 。
KHV 病毒粒子呈对称二十面体, 直径 100~ 110 nm, 成熟的病毒颗粒带有松散的囊膜, 直径 170~ 230 nm。病 毒粒子由 31 个病毒多肽组成, 其中 21 个多肽的分子 量与鲤科鱼类疱疹病毒( H erpesv irus Cyprini, CHV) 相
似, 10 个与叉尾 病毒( Channel catf ish virus, CCV ) 相 似。通过病毒多肽和限制性酶切反应试验, 表明分离 到的以色列株、美国株和英国株 KHV 是相同的。而基 因的 限制性片段长 度多态性试验 表明, KHV 不同于 CHV 和 CCV [ 10] 。K HV 基因组大小约为 277 kbp, 而 疱疹病毒 科的病毒基因 组大小通 常为 250 kb。英国 CEFAS 的 OIE 参考实验室对 KHV 约 50 kb 的基因进 行了测定和解析, 发现有许多基因与 CCV 基因有着高 度的同源性[ 13] 。
第 37 卷 第 5 期 2007 年 9 月
中国海洋大学学报
PER IOD ICA L O F O CEAN U N IVER SITY OF CHIN A
37( 5) : 785~ 788 Sept . , 2007
锦鲤疱疹病毒实时荧光定量 PCR 检测方法的建立及应用X
范万红1, 刘 荭1, 岳志芹2, 吕建强1, 何俊强1, 江育林1
收稿日期: 2006-11- 06; 修订日期: 2007-01-04 作者简介: 范万红( 1965-) , 女, 硕士, 兽医师, 主要从事进出境动物病害检疫及病害方面的研究。E-mail: kerryf an65@ yahoo. com. cn
786
中 国 海 洋大 学 学 报
2 00 7 年
0. 2
反向引物
10
0. 2
探针
5
0. 1
模板
5 LL
T aq DN A 聚合酶
5 U / LL
5U
2. 2 定量 PCR 反应的灵敏性实验 将 KHV 质粒进行 10 倍系列稀释, 共 9 个梯度, 为
10- 1~ 10- 9, 进行定量 PCR, 其扩增曲线如图 1。可以看 出, 质粒在 10~ 10- 7稀释度, 共 7 个数量级的范围内有典 型的/ S0型扩增曲线。在 10 稀释度时, Ct 值最小, 约为 12; 在 10- 7稀释度时, 对应的 Ct 值约为 36。在 10~ 10- 7范围 内, 根据质粒拷贝数( X) 与对应的 Ct 值的相关性, 利用软 件分析得到标准曲线: Ct= - 3. 45 lgX+ 42. 73, 相关系数 R2= 0. 989( 见图 2) 。质粒在 10- 8稀释度, 对应为 32 个病 毒拷贝时, 经过 PCR 扩增仍有荧光信号, 其 Ct 值为 37. 5。 因此, 在实际检测中, 以 Ct 值 37. 5 为界限, 则该方法的检
2 结果
2. 1 KH V 荧光定量 PCR 检测方法的优化 将加好样的 PCR 管放在荧光 PCR 仪中, 设置相应
荧光收集条件后进行扩增检测, 反应程序如下: 94 e 3 min; 94 e 15 s 变性, 55 e 30 s 退火, 72 e 1 min 延 伸, 如此重复 5 个循环进行预扩增; 94 e 10 s 变性, 60 e 40 s 退火、延伸, 如此重复 40 盖循环进行目的片段 的扩增, 对试验结果进行实时监测。
10 mmol/ L 以 1 mmol/ L 递增, 经过重复试验选定, 作为
反应体系中的镁离子浓度为 3 mmol/ L, Taq DNA 聚合
酶的用量为 5U, dNT Ps 的用量为Leabharlann 1 mmol/ L( 见表 1) 。
表 1 KHV 实时荧光 PCR 反应中各组分情况
T able 1 T he final concentr at ion of each compo nent in the reaction
在反应体系中其它条件相同的情况 下, 将引物浓
度和探针浓度从 0. 1 Lmol/ L ~ 1. 0 Lmol/ L 作倍比连
续稀释, 互相组合后进行检测, 通过对试验结果的分析
比较, 确定 最 佳引 物终 浓 度和 探 针浓 度 分别 为 0. 2