用VRA-GlcNAc为底物测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶

N-乙酰-β-D-氨基葡糖糖苷酶测定试剂盒（比色法）阳性判断值或参考区间确定资料1.阳性判断值或参考区间确定的依据根据《临床检验质量管理技术基础》，如何确定临床检验的参考值（参考范围）：批准指南（2000）文件。

该文件是确定定量临床检验项目的参考值（参考范围）的指南。

另根据《全国临床检验操作规程（第3版）》中，按N-乙酰-β-D-氨基葡糖糖苷酶含量的国际单位计算参考值（参考范围）为：（0.3-12）U/L。

2. 阳性判断值或参考区间确定的方法2.1检测数据疑似离群点的判断将疑似离群点和其相邻点的差值D和数据全距R相除，D/R若小于或等于1/3不考虑为离群点；D/R若＞1/3，考虑为离群点。

若有两个或以上疑似离群点，可将最小的疑似离群点作如上处理，若D/R都＞1/3，则须将所有疑似点都剔去；若都＜1/3，则保留所有数据。

注：为保证参考值数据的可靠性，剔除离群点后的数据量不应少于120个，若还需分组统计，则每个分组应至少有120个数据。

如果剔除离群点后的数据量小于120个，应即将其他数据补上。

2.2 数据分布判断绘制分布图，了解数据的分布特性，并进行正态检验。

数据量≤2000时，以Shapiro-Wilk（W检验）为准；数据量＞2000时，以Kolmogorov-Smirnov（D检验）为准。

2.3阳性判断值或参考区间确定的方法x±s 若数据呈高斯正态分布，或者数据经转换后亦呈高斯分布，参考值可按 1.96x±s表示(99%数据分布范围)。

表示(95%数据分布范围)，或者 2.58若数据不呈高斯正态分布，则可用非参数法处理。

最常见的是以百分数法确定2.5%和97.5%位数的参考限，以确定95%参考值（参考范围）。

百分位数法的计算公式为：()C rn fW L -⨯+=100Pr 式中：Pr ——为第r 百分位数；L ——为第r 百分位数所在组的下限； W ——为第r 百分位数所在组的宽度； f ——为第r 百分位数所在组的频数； N ——表示总频数；C ——为第r 百分位数所在组的前一组的累计频数。

Food Science And Technology And Economy粮食科技与经济2023 年4月第48卷 第2期Apr. 2023Vol.48, No.4随着世界人口的日益增长，粮食的需求量随之上升，导致农作物在全球的种植面积需求越来越大，而农作物病虫害的发生是造成农作物产量和质量降低的最主要因素，每年因病虫害造成粮食（农作物）减产20％～40％，直接损失超过2 000亿美元[1]。

目前在病虫害防治方面，主要还是依靠化学防治的方式和手段[2]，然而过度依赖化学防治方式会造成环境生态污染。

为了生态环境的可持续发展，降低化学试剂对土壤环境的影响，生物技术在农业建设过程中的应用逐渐被重视。

将生物技术应用于农业病虫害防治中，能够有效减少传统的化学农药防治方法给环境带来的负面影响，推动绿色农业的可持续发展[3]，而几丁质酶在农作物生物防治方面具有巨大的潜在应用价值。

几丁质酶（Chitinase, EC 3.2.1.14）是水解几丁质的酶，能够催化几丁质的β-1,4-糖苷键，将其降解成N -乙酰葡糖胺（N -actyl glucosamine, NAG ），并能由各种微生物，包括病毒、细菌和真菌，以及昆虫、高等植物和动物合成[4]。

几丁质由β-1,4-糖苷键将N -乙酰-D -氨基葡萄糖（Be -ta -1,4-linked Repeating N-acetylaminoglucose Units, GlcNAc ）分子连接而成，以结构多糖的形式存在于真菌细胞壁、节肢动物的外骨骼、甲壳纲动物的外壳以及寄生线虫的外壳中，但尚未在植物体内鉴定出几丁质的存在[5]。

几丁质酶能够通过降解真菌性病毒细胞壁中的几丁质和破坏昆虫及线虫的消化膜等方式达到抗病虫害的效果，且不会对植物体产生伤害。

同时，几丁质酶也是植物防御系统中重要的防卫因子，可以增强植物的防御系统，在抵御病原真菌以及病虫害中发挥着重要作用[6]。

β-N-乙酰葡萄糖苷酶检测试剂盒(PNP 比色法)简介：β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)可水解β-N-乙酰氨基葡萄糖苷，也能水解β-N-乙酰氨基半乳糖苷，该酶广泛存在于多种组织、体液、细胞，是溶酶体中的一种酸性水解酶，其测定方法有比色法和荧光光度法。

Leagene β-N-乙酰葡萄糖苷酶检测试剂盒(PNP 比色法)(NAG Colorimetric Assay Kit)检测原理是在酸性条件下NAG 可使底物对硝基酚-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷水解，释放出游离的对硝基酚(p -nitrophenol ，PNP)，在碱性条件下p -nitrophenol 呈黄色产物，产物黄色越深，说明β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性越高，反之则酶活性越低，通过分光光度比色法测定吸光值，据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。

该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中的β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：自备材料：1、 离心管2、 恒温箱3、 比色杯4、 分光光度计或生化分析仪操作步骤(仅供参考)：1、 配制检测工作液：① 配制显色工作液： 取出1支4-NAG ，恢复至室温后溶解于2 ml NAG Assaybuffer ，混匀，冰上预冷备用。

新配制的显色工作液应在10天内用完。

② 配制标准品工作液：取出p -nitrophenol(10mM) 恢复至室温后，取10μl 溶解于编号 名称TE0063 50T Storage试剂(A): NAG Assay buffer 150ml 4℃ 试剂(B): 4-NAG 1支 -20℃ 避光 试剂(C): Alkaline buffer 1ml 4℃ 试剂(D): p -nitrophenol(10mM) 1ml -20℃ 避光 试剂(E): ddH 2O 10mlRT 使用说明书1份ACP Assay buffer，使p-nitrophenol达到3mM。

第3期2020年6月No.3 June，2020葡萄酒是以葡萄为原料，经酵母菌酒精发酵酿造出来的果酒。

葡萄汁中存在多种含氮化合物，可被酵母菌使用的有氨基酸、多肽、铵态氮等，这类氨基酸态氮可称为氨基氮。

氮源是酵母生长发酵所必需的营养物质之一，当葡萄汁中氨基氮质量浓度过高时会抑制酵母菌繁殖，过低时会使酵母菌发酵减慢或停止[1]。

葡萄汁中总酸的质量浓度对发酵后葡萄酒的风味、品质、储存等有较大的影响。

适度的酸味给人带来清新、爽口和愉快的感觉，过酸则使人感到刺口、尖锐、难受，而酸度太低的葡萄酒则易氧化败坏，不耐储存[2]。

因此，在葡萄汁发酵前要对葡萄汁中的总酸及氨基氮进行测量。

传统的方法是分别滴定两者的质量浓度，这种方法效费比低。

经改进后采用连续滴定法，即在进行完总酸测定后，直接进行氨基氮质量浓度的测定，可为葡萄酒的酿造品质的提升提供一定的保障。

1 材料与方法1.1 葡萄汁中总酸的测定利用酸碱中和原理，用NaOH 标准溶液滴定样品中的有机酸，以pH=8.2为电位滴定终点，根据消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，计算样品中总酸质量浓度[3]。

1.2 葡萄汁中氨基氮的测定氨基氮依照《GB/T 12143.2—1989》果蔬汁饮料中氨基态氮的测定方法》[4]测定。

1.3 仪器与设备雷磁PHS-25 pH 酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司；FA214电子分析天平，上海豪晟科学仪器有限公司。

1.4 试剂葡萄样本采自伊犁职业技术学院农业工程学院实训基地，其余试剂均为分析纯。

1.5 分析步骤酸度计的校正：打开电源，将仪器预热15 min ；采用“两点校准法”即选用pH=6.86和pH=4.00或pH=9.18两种标准缓冲溶液对pH 酸度计进行校准。

总酸的滴定：取5 mL 样品置于100 mL 烧杯中，加50 mL 纯水，插入电极，放磁子，并置于电磁搅拌器上搅拌，然后用0.05 mol/L 的NaOH 标准滴定溶液滴定。

用VRA-GlcNAc为底物测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶【摘要】目的应用vra-glcnac为底物建立检测nag活力的方法，用于尿液nag活性测定。

方法对离子强度、ph值、底物浓度等最佳反应条件及各种实验参数进行研究。

用该法在日立7180全自动生化分析仪上进行性能分析并测定多种肾病尿样nag活性，结果该法最低检出限1.5 u/l，线性范围可达200u/l(r=0.9979)，批内cv为＜4％，批间cv＜6％,回收率为101.2％。

结论本法灵敏度高，结果准确，试剂稳定，适用于全自动生化分析仪操作。

【关键词】 vra-glcnac；n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶；动力学法n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶(nag)是一种位于溶酶体内的酸性水解酶，尿中nag主要来源于肾近曲小管上皮细胞，当近曲小管上皮细胞受损时，尿nag活性将显著升高且早于其他尿酶，对肾小管损害的早期诊断有较大价值［1］，且nag上升程度与肾小管损伤程度成正比。

［2］可作为早期诊断肾损害的尿标志性蛋白［3］。

本文基于nag催化vra-glcnac生成红色vra产物，经反复试验确定最佳实验条件，建立检测尿nag活力的动力学分析法，该法用于尿nag 活力测定，均获得满意结果。

1 材料与方法1.1 试剂和仪器 (1)试剂1(r1)：柠檬酸缓冲液150mmol/l、vra-glcnac1.0g/l、稳定剂适量。

(2)试剂2(r2)：ph碳酸钠缓冲液（10.0）。

(3)nag标准酶和质控品，由浙江伊利康生物技术公司提供。

1.2 样本随机中段尿样。

1.3 方法1.3.1 测定原理样本中的nag催化底物vra-glcnac水解糖苷链,，生成产物vra，vra在505nm处有最大吸收峰，通过测定505nm 处每分钟的吸光度变化速率，可计算出nag的活性。

即在最佳实验条件下，1000ml样品中nag每分钟水解1μmol/l 的vra-glcnac 发生转变为1u的nag酶量为1个单位，简称u/l。