第五章色谱原理5.1色谱的原理和分类5.1.1色谱色基本原理色谱技术是一种重要的分离和分析技术，其用于物质的分离始于二十世纪初。
1903年，俄国植物学家Tswett向填充碳酸钙的柱中注入植物色素的石油醚冲洗，发现柱中出现数条相互分离的色带，色谱法的命名就是由此发现开始的。
随后色谱技术得到不断发展。
Martin于1952年因创立气－液色谱分离方法而荣获诺贝尔奖。
气相色谱的出现极大地鼓舞了世界各地的科学工作者，激发了人们对分析色谱技术进行放大，使之用于制备目的和工业生产的研究兴趣。
资料表明，在50和60年代，分析和生产规模的气相色谱分离技术的研究十分活跃。
到了70年代，尤其是在美国制糖工业采用酶法转化技术生产高果葡糖浆以后，液相色谱技术就变成了一个热门的研究领域。
色谱在英文中只有一个名词Chromatography），但在中文中却有色谱和层析的名称。
色谱的主要装置如图所示;图色谱的主要装置图色谱实际是色谱分离精度高，设备简单，操作方便，根据各种原理进行分离的色谱法不仅普遍应用于物质成分的定量分析与检测，而且应用于生物物质的制备分离和纯化，成为生物下游加工过程最重要的纯化技术之一。
5.1．2色谱的分类1)流动相与固定相色谱法根据流动相的相状态分气相色谱法、液相色谱法和超临界流体色谱法，而固定相有固体、液体和以固体为载体的液体薄层。
2)固定相的形状根据固定相或色谱装置形状的不同，液相色谱法又分为纸色谱法（Paper chromatography）、薄层色谱法（Thin－layer chromatography）和柱色谱法（Column chromatography）。
纸色谱法和薄层色谱法多用于分析目的，而柱色谱易于放大，适用于分离大量制备分离，是主要的色谱分离手段。
3)分离操作方式色谱法根据分离操作方式的不同可分为间隙色谱和连续色谱两大类。
间隙色谱技术通过合理选择固定相介质和冲洗剂可以得到广泛应用。
但是，在工业应用中更希望采用连续分离操作，尤其是分离过程必须与其他连续单元操作（如连续生化反应器）同时进行时更是如此。
5.1.3色谱的主要检测器色谱峰的确定完全考检测器,所以检测器的好坏对色谱技术是十分重要的。
气相色谱的检测器主要有以下几种：（1）氢火焰检测器（2）热导检测器（3）离子检测器这些检测器的主要功能如表所示表气相色谱检测器液相色谱的主要检测器有紫外检测器、视差折光检测器、蒸发散射光检测器、等其主要功能如表所示。
表液相色谱检测器的主要功能5.1．4 生物分离制备液相色谱的类型和特点气相色谱主要用于挥发性成分的分析。
在生物产品的分离纯化中主要采用的液相色谱。
液相色谱中有些主要是用于分析如反相色谱。
液相色谱方法的主要特点是：分离效率高，选择性好，适用于各种多元组分复杂混合物的分离；应用范围从无机物到有机物，从天然物质到合成产物，从小分子到大分子，从一般化合物到生物活性物质等，可以说几乎包括了所有类型物质。
表1 适用于大规模生物分子分离纯化的主要色谱方法其实上表只是给出了目前常用的生物产品用液相色谱。
还有许多新的液相色谱。
如分子印迹层析技术，。
5.1．5 液相色谱介质和操作形式液相色谱介质主要是颗粒状、膜状和一体柱形式。
颗粒状介质，包括球星颗粒、无定型颗粒等。
膜状介质是将膜用作介质，一体柱介质又称为连续床或连续棒，即介质单体材料在柱中直接聚合，形成多孔状网，达到吸附分离的目的。
液相色谱的固定相目前主要是颗粒状介质，但颗粒状介质存在内扩散阻力和颗粒分布不均匀的问题，近几年开始研究连续床或大孔灌柱色谱的方法来解决这个问题。
这些会在后面章节中详细讨论。
目前颗粒状介质主要是考填充的方式填在柱子中。
5．2．色谱理论5．2．1概论色谱理论是研究色谱过程中分子运动的规律，探讨微观分子运动与色谱分离的内在联系。
色谱学理论研究的三个主要问题是[1]：色谱过程的热力学研究，它是发展高选择性柱的理论基础；色谱过程的动力学研究，它是发展高效能色谱柱与高效能色谱方法的理论基础；色谱分离条件的选择和优化，它是多元混合物分离的理论基础。
5．2.2吸附平衡热力学描述吸附平衡的模型有多种形式，早期经验模型如：亨利（Henry）模型，佛罗因得利希(Freundlich)模型，兰格谬尔(Langmuir)模型和BET （Brunauer-Emmett-Teller ）模型。
最近发展起来的吸附模型有质量作用模型，空间质量作用模型等。
溶质在吸附剂上的吸附平衡关系是指吸附达到平衡时，吸附剂的平衡吸附质浓度q 与液相游离溶质浓度c 之间的关系。
一般q 是c 和温度的函数，既(,)q f c T =（1）但一般吸附过程是在一定的温度下进行，此时q 只是c 的函数，q 与c 的关系曲线称为吸附等温线（adsorption isotherm ）。
当q 与c 之间呈线性函数关系，mcq =（2）时，称为亨利（Henry ）型吸附平衡，其中m 是分配系数。
该式一般在低浓度范围内成立。
当溶质浓度较高时，吸附平衡常呈非线性，该式不再成立，经常利用佛罗因得利希（Freundlich ）经验方程描述平衡行为，既：n kc q 1=（3）其中k 和n 为常数，一般1<n<10。
当吸附剂对溶质的吸附作用非常大时，n 可能大于10，此时游离浓度对吸附浓度影响很小，接近于不可逆吸附，吸附等温线为矩形（rectangular isotherm ，q=常数）。
例如固定化单克隆抗体的免疫亲和吸附剂的吸附等温式中一般n>10，可用矩形吸附平衡关系近似。
5．2.2.1 Langmuir 模型Langmuir 模型是描述吸附过程最简单和最常用的模型，也是第一个有一定理论基础的吸附模型。
它最初源于气体吸附过程,从动力学角度推导出来的,基于以下假设:(1)分子只在固体表面的固定位点吸附;(2)每个吸附位点只能吸附一个分子,吸附分子在固体表面形成单分子层;(3)所有吸附位点的能量相等;(4)吸附分子之间没有相互作用。
基于 Langmuir 单分子层吸附理论，可推导Langmuir 型平衡方程。
m d q cq k c=+ (4)或： cK cK q q b b m +=1 (5)其中，q m 为饱和吸附容量，K d 为吸附平衡的解离常数，K b 为结合常数（=1/K d ）当n 个溶质分子在一个活性点上发生吸附时，可得上式的一般形式：1nm b nb q Kc q K c=+(6) 对于n 个组分的单分子层吸附，又变成另一种形式：1m bj i nbj jj q K c q K c =+∑(7)5．2.2.2 BET 方程如果假设在吸附剂表面吸附的单分子层分子的附着力比吸附质分子之间的内聚力大得多，并在吸附剂表面产生化学吸附形成络合物，可假定分子层在表面不能自由移动。
Brunaur 、Emmett 和Teller 提出的BET 模型认为，被吸附的分子不能在吸附剂表面自由移动，吸附层是不移动的理想均匀表面。
其吸附可以是多层吸附，层与层之间的作用力是范德华力，各层水平方向的分子之间不存在互相作用力，即在第一层吸附层上面，可以吸附第二层，第三层，不等到上一层吸附饱和就可以进行下一层的吸附。
各吸附层之间存在着动态平衡，即每一层形成的吸附速率和解吸速率相等。
单分子层可由向空的表面吸附或双层分子层解吸产生，吸附速率与吸附有效面积的大小和分子碰击表面的频率有关。
恒温下基于气体动力学理论，得出多层物理吸附等温方程为[2]：00()1(1)m q bPq PP P b P =⎡⎤-+-⎢⎥⎣⎦(8)式中：b 为与吸附热有关的常数； q 表示平衡压力为P 时的吸附容量； q m 饱和吸附容量；P 0为实验温度下溶质的饱和蒸汽压。
5．2.2．3质量作用模型生化分离中经常用色谱法分离纯化生物大分子如蛋白质、多肽。
此时如果用Langmuir 模型来描述吸附平衡，由于模型简单，未能考虑到溶液反离子等因素的影响，往往得不到好的结果。
下面以蛋白质的离子交换为例，介绍近年来常用的质量作用模型和空间质量作用模型。
质量作用模型（Stoichiometric Displacement Model,简称为SDM ）是建立在质量作用定律基础上的非机理模型[3]，常用来描述生物大分子如蛋白质在吸附剂上的吸附平衡。
该模型假设离子交换是吸附过程的唯一机理，离子交换过程用满足质量作用定律的化学计量“反应”来描述，这样，在吸附过程中维持固定相电中性。
蛋白质分子通过与反离子竞争吸附结合到离子交换配基上。
模型假设如下：（1）系统为理想体系，各组分的活度系数为1；（2）与蛋白质分子结合的伴离子(co －ion)分成两类：当蛋白质在离子交换介质上吸附时，第一类伴离子从蛋白质释放出来，而第二类伴离子始终与蛋白质分子相结合。
由此假设，蛋白质可看成中性的盐，在水溶液中电离成多价离子；（３）在恒定的PH 下，蛋白质的性质，如带电荷数、电荷分布、分子结构和大小等，在整个吸附过程不发生变化；（４）固定相均一，孔道形状和尺寸均匀，且孔道直径足够大，不存在尺寸排阻作用；（５）不考虑蛋白质与离子交换剂之间的疏水作用。
离子交换平衡方程如下（以阴离子交换剂为例）：n r m n m r n PB m Y m A n Y PB n m B -++⋅+⋅↔⋅+⋅+⋅⋅m 为特征电荷，即蛋白质吸附时，能替换下来的单价反离子数。
如果P 是碱基数小于１0的寡糖核苷酸，m 等于分子所带的净电荷数；但对于生物大分子，由于其复杂的三维构像是带电残基形成特殊分布，特征电荷数小于其所带的净电荷数。
另外，在静电作用下，蛋白质从流动相向固定转移过程中，由于蛋白质在分子热运动下发生旋转取向，使蛋白质与固定相结合的自由能最小；在一定的操作条件下，如恒定的pH 和盐离子浓度下，可能有多个蛋白质取向存在，蛋白质的取向与吸附蛋白浓度有关。
因此m 代表竞争吸附的平均作用，它的实验值不一定是一个整数。
吸附平衡常数定义为：'[][][][][]n n m mnm r n mr m n Y PB A B K PB Y A -=+=(9) 在吸附过程中，第一类伴离子从蛋白质上释放，即：+-+⋅+↔B m PB PB m rm r上述方程的平衡常数为：]PB []PB [K m r m r ''+-=(10)（9）式、（10）式相结合，可的离子交换的总平衡常数'''/()n K K K =为：[][][][]n n mm r m n mr n Y PB A K PB Y A --=(11)离子交换剂的交换容量q Y 为蛋白质和反离子所占的吸附位之和，即：[][]Y m r n q m Y PB n Y A =+(12)把（12）式代入（11）得：/1/[][][][]m nn m m r r n Y m r Y PB n A PB K q m Y PB --⎛⎫= ⎪-⎝⎭(13)与langmuir 模型相比，SDM 模型更合理的模拟了蛋白质离子交换平衡。
