ELISA实验步骤

ELISA试验方法ELISA试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），也称酶联免疫吸附试验，是一种常用于检测抗原或抗体的敏感且特异性的实验方法。

ELISA试验既可以用于研究基础科学，也可以应用于诊断医学、生物制药、科研开发等领域。

第一步：固相吸附首先，将特异性抗原或抗体加入固相载体，如微孔板或磁珠，通过吸附作用将其固定在载体上，形成固相。

然后，将未被吸附的地方进行阻断，例如使用牛血清蛋白（BSA）或胸腺素等阻断剂来封闭非特异性结合位点，减少非特异性结合。

第二步：样品加入将待检样品加入固相，并充分与特异性抗原或抗体反应。

如果待检物是抗原，则待检样品中存在的特异性抗体会与固相上的抗原结合。

如果待检物是抗体，则待检样品中存在的抗原会与固相上的抗体结合。

第三步：洗涤通过反复洗涤固相，去除非特异性结合的物质，确保只有特异性结合物留在固相上。

典型的洗涤液包括缓冲盐水或洗涤缓冲液。

第四步：二抗加入将经过酶标记的二抗加入固相，使其与特异性结合的抗原或抗体结合。

酶标记的二抗可以与特异性结合物形成二抗-抗原或二抗-抗体复合物。

第五步：洗涤再次进行洗涤步骤，去除非特异性结合的酶标记的二抗，确保只有特异性结合的复合物留在固相上。

第六步：底物加入将含有底物的反应物加入固相，使其与酶标记的二抗发生反应。

底物与酶标记的二抗之间的反应产生颜色变化，即可定性或定量检测待检物质的存在和浓度。

第七步：反应停止通过加入反应停止剂，停止酶反应，阻止进一步的底物转化为产物。

产物的生成量与待检物质的浓度成正比。

最后，通过光度计或酶标仪等检测设备，测量产生的颜色变化的光密度，可以定性或定量计算待检物质的存在和浓度。

ELISA试验具有高度的敏感性和特异性，能够检测低浓度的抗原或抗体。

它的操作简单、重复性好，广泛应用于生物医学研究、临床检测、植物检测、食品检测等领域。

不过需要注意的是，ELISA试验的结果受到很多因素的影响，如抗体的质量和纯度、试剂的质量和保存条件等，因此在进行ELISA试验时需要严格控制实验条件，保证结果的准确性和可重复性。

操作步骤1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。

2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。

3. 加封闭液200微升，37℃放置一小时。

4. 洗涤同2。

5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。

同时作稀释液对照。

37℃放置2小时。

6. 洗涤同2。

7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃1小时。

8. 洗涤同2。

9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10--15分钟。

10. 加终止液：每孔50微升。

11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。

操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。

在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

(简称洗涤，下同)。

2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。

然后洗涤。

(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。

37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。

也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

ELISA步骤试剂及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种广泛应用于生命科学、医学和工业领域的实验技术，用于检测和测定生物样本中的抗原或抗体。

以下是ELISA的一般步骤、试剂及注意事项的详细介绍。

一、ELISA步骤：1.样品制备：首先，需要将待测样品（血清、细胞上清、组织提取物等）制备成特定体积的稀释液，以便进行ELISA实验。

2.涂布：将测定物（抗原或抗体）加入固相（例如，微孔板或磁珠）上，使其与固相表面发生特异性结合。

3.阻断：将非特异性结合位点阻断，以降低假阳性结果。

常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）和干奶粉等。

4.孵育：将样品（稀释液）加入到涂布的微孔板孔中，与固相上的结合位点结合，并孵育一定时间，促使特异性结合反应进行。

5.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。

6.探针反应：加入特定的称量标记的抗体或标记化的抗原，使其与待测样品特异性结合，并与固相上的结合位点结合。

7.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。

8.显示：加入染色剂或底物，使其与标记物发生特异性反应，并显示颜色或荧光。

9.终止反应：加入终止液停止底物与染色剂的反应。

10.读板：使用酶标仪或光度计测量吸光度，在特定波长下测量显示产物的光密度，并根据标准曲线或控制组数据计算待测样品中特定抗原或抗体的浓度。

二、常用ELISA试剂：1.涂布缓冲液：主要用来将测定物溶解在其中，涂布在微孔板或磁珠上。

2.试样稀释液：用于制备待测样品的稀释液。

3.标准物：用于制作标准曲线，以确定待测样品中抗原或抗体的浓度。

4.阻断剂：用于封闭非特异性结合位点，以降低假阳性结果。

5.洗涤缓冲液：用于去除孔内非特异性结合物质。

6.探针：用于特定抗体或抗原的检测，通常经过标记，如HRP（辣根过氧化物酶）或荧光染料等。

7.显示试剂：用于显示标记物与底物的特异性反应，如碱性磷酸酶底物或H2O2和TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二唑基）等。

ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验方法，用于检测和定量分析特定抗原或者抗体的存在。

本操作规程旨在提供一套标准化的ELISA实验步骤，以确保实验的准确性和可重复性。

二、实验材料1. 96孔ELISA板2. 酶标仪3. 微量移液器和相应的可调移液器架4. 基质溶液（PBS等）5. 抗原或者抗体样品6. 酶标记的二抗7. 洗涤缓冲液8. 底物溶液9. 住手液三、实验步骤1. 准备工作a. 将96孔ELISA板放置在可调移液器架上。

b. 准备基质溶液，并将其加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。

c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，以避免溶液的蒸发。

2. 样品处理a. 将待测样品加入ELISA板的相应孔中，每孔100μL。

b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使样品均匀分布。

c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。

3. 一抗孵育a. 将酶标记的一抗加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。

b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使一抗均匀覆盖样品。

c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。

4. 洗涤步骤a. 将洗涤缓冲液加入ELISA板的每一个孔中，每孔200μL。

b. 轻轻拍打ELISA板，使洗涤液充分覆盖孔底。

c. 倒掉洗涤液，重复以上步骤3次。

5. 二抗孵育a. 将酶标记的二抗加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。

b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使二抗均匀覆盖样品。

c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。

6. 洗涤步骤a. 重复步骤4中的洗涤步骤，以去除未结合的二抗。

7. 底物反应a. 将底物溶液加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。

b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使底物均匀覆盖样品。

c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。

8. 反应住手a. 在适当的反应时间后，将住手液加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。

1.包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度(一般所需抗原包被量为每孔20-200μg),每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体.(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)2.封闭酶标反应孔:5%小牛血清置37℃封闭40min.封闭时将封闭液加满各反应孔,并去除各孔中的气泡,封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍,每遍3min.洗涤方法:吸干孔内反应液,将洗涤液注满板孔,放置2min略作摇动,吸干孔内液,倾去液体后在吸水纸上拍干洗涤次数3次3.加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl.将稀释好的样品加入酶标反应孔中,每样品至少加双孔, 每孔100μl,置于37℃,40-60min.用洗涤液满孔洗涤3遍,每遍3min.4.加入酶标抗体:酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考工作稀释度进行. 37℃,30-60min之间.短于30min往往结果不稳定.每孔加100μl.洗涤同前。

5.加入底物液(现用现配):首选TMB-过氧化氢尿素溶液,OPD-过氧化氢底物液系统次之.底物加入量:每孔100μl,置37℃避光放置3-5分钟,加入终止液显色.6.终止反应:每孔加入终止液50μl终止反应,于20min内测定实验结果.7.结果判断:OPD显色后采用492nm波长,TMB反应产物检测需要450nm波长.检测时一定要首先进行空白孔系统调零.用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示,当P/N大于2时作为抗体的效价.(数值的大小依具体检测要求而定.)。

ELISA试剂配制及实验流程一、ELISA试剂配制1.涂膜溶液配制a.取一定量的涂膜缓冲液（常用PBS缓冲液），加入所需量的涂膜抗原（常用蛋白质），使其稀释至适当的浓度（一般为1-10μg/mL）。

b.将混合物加入ELISA板的每孔中，保持在4℃下过夜（或在37℃下孵育1-2小时），使抗原吸附在孔壁上。

2.阻断缓冲液配制a. 取一定量的阻断缓冲液（常用5%BSA或5%milk），加入适量的Tween-20洗涤缓冲液（0.05%-0.1%）。

b.润湿涂膜孔的孔板，将混合物加入孔中，孔板搅动或在37℃孵育一段时间，使孔壁均匀吸收。

c. 抽去孔内的混合物，加入洗涤缓冲液（常用PBS或Tween-20），重复操作2-3次。

3.抗体或抗原标记物配制a.将适量的一抗或二抗稀释至适当浓度，并加入适量的酶标记物（如辣根过氧化物酶HRP）。

b.在预先涂有抗原的涂膜孔中加入混合物，搅动或在37℃孵育一段时间，使抗体或抗原与涂膜孔中的抗原结合。

c.抽掉孔内的混合物，加入洗涤缓冲液，重复操作2-3次。

4.底物溶液配制a.溶解适量的底物（如TMB）在底物缓冲液中。

b.在孔中加入适量的底物混合物，孔板搅动或在37℃孵育一定时间，使酶作用使底物产生可测量的光信号。

c.添加停止液（如1M盐酸），停止底物的反应。

二、ELISA实验流程1.样本准备a.收集样本（如血清、尿液、细胞上清等）。

b.对样本进行预处理，如离心、稀释等。

2.取样a.取出所需ELISA板，记住样品所在位置。

b.加入样本和常规对照，同时加入阳性和阴性对照。

3.孵育a.将孔板密封或盖好，放在恒温培养箱中进行孵育，一般温度为37℃，时间为1-2小时。

4.洗涤a.将孔板倒扣，用洗涤缓冲液充分洗涤，去除非特异性结合物质。

b.记录洗涤次数，至少重复3次。

5.加荧光素底物a.配制底物溶液，均匀加入到每个孔中。

b.出于对照的需要，每一相邻行的第一孔加入底物，其他孔则不加底物。

ELISA实验步骤及所需试剂耗材第一步：涂布抗原1.96孔酶联免疫板（ELISA板）2.定性或定量的抗原或抗体溶液将所需的抗原溶液均匀涂布在ELISA板的孔中，通常使用100μL的抗原溶液加入每个孔，并在4℃下孵育过夜。

第二步：阻断1.阻断缓冲液（例如，3%牛血清蛋白）使用200μL的阻断缓冲液加入到每个孔中，并在室温下孵育2小时，以阻止非特异性结合。

第三步：添加抗体1.目标抗原特异性抗体2.酶标记的二抗（例如，HRP-抗鼠抗体，HRP-抗人抗体）分别添加100μL的抗体溶液和酶标记的二抗溶液到每个孔中，并在室温下孵育2小时，使抗体与抗原结合。

第四步：洗涤1.洗涤缓冲液（例如，PBS-T）使用洗涤缓冲液洗涤ELISA板的孔，将洗涤缓冲液加入孔中，静置2分钟，然后丢弃液体。

重复此步骤3次，以确保除去非特异性结合的物质。

第五步：酶底物添加1.酶底物（例如，TMB底物）添加100μL的酶底物到每个孔中，使其与酶标记的二抗反应，产生可检测的颜色反应。

第六步：反应终止1.停止溶液（例如，2M的硫酸）加入50μL的停止溶液到每个孔中，终止酶活性，使产生的颜色反应停止。

第七步：测定1.ELISA板读取仪使用ELISA板读取仪测量每个孔的吸光度，通常在450nm波长下测量，以确定抗原或抗体的浓度。

除了上述试剂和耗材外，还有一些其他重要的试剂和耗材也是需要的，例如：1.样品或标准物质：用于建立浓度标准曲线和样品浓度测量。

2.缓冲液：用于制备反应液和洗涤缓冲液。

3.小型离心机：用于混合和离心试管或孔板。

4.显微镜和玻片：用于观察ELISA结果和图像记录。

5.吸管和移液器：用于取样和溶液转移。

6.温度控制设备：用于控制实验过程中的温度。

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实验步骤
1.试剂准备：阳性对照品，酶标抗体，底物，
2.样品提取：所需工具（研钵）
3.设计酶标板布局；设两个阳性对照，两个空白对照(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同)，样品孔。

4.加样品到反应孔；每个孔100ul
5孵育（室温下2小时）一般均采用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板
底应贴着水面，使温度迅速平衡。

为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。

若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。

湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。

无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。

室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。

室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。

应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。

为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。

6酶标抗体的制备
7洗板；孵育结束后，将反应孔中试剂倒出，加入250ul的1倍PBST 缓冲液，之后快速倒出，重复2次。

8加酶标抗体；每孔100ul
9孵育；室温2小时
10PNP底物的制备
11洗板
12加底物
13孵育；30到60分钟
14终止反应；50ul 3摩尔的氢氧化钠（选作）。

ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析生物样本中的特定抗原或者抗体。

本操作规程旨在提供详细的步骤和指导，确保ELISA实验的准确性和可重复性。

二、实验材料准备1. 缓冲液：根据实验需求选择合适的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）或者TBS（三氯甲烷缓冲液）。

2. 抗原或者抗体：根据实验目的选择合适的抗原或者抗体，并进行适当的稀释。

3. 酶标记的二抗：根据实验需求选择合适的酶标记的二抗，如HRP（辣根过氧化物酶）或者AP（碱性磷酸酶）。

4. 底物：选择合适的底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）或者ABTS（2,2'-联氨基二乙基三乙酸）。

5. 住手液：根据实验需求选择合适的住手液，如2M硫酸或者2M盐酸。

三、ELISA实验步骤1. 板涂覆a. 取ELISA板，将每一个孔加入适量的抗原或者抗体，通常为100-200ng/mL。

b. 将板封闭剂（如BSA或者牛血清白蛋白）加入每一个孔中，封闭非特异性结合位点。

c. 在4℃下孵育过夜，或者在室温下孵育2小时。

2. 样本处理a. 采集待测样本，如血清或者细胞上清。

b. 根据实验需求对样本进行适当的稀释。

c. 加入样本到孔中，每一个孔加入适量的样本，通常为50-100 μL。

d. 在室温下孵育1小时。

3. 二抗结合a. 弃去孔中的样本，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次，每次洗涤时间为1-2分钟。

b. 加入酶标记的二抗到每一个孔中，每一个孔加入适量的二抗，通常为100-200 ng/mL。

c. 在室温下孵育1小时。

4. 底物反应a. 弃去孔中的二抗，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次。

b. 加入适量的底物到每一个孔中，通常为100-200 μL。

c. 在室温下孵育适当的时间，观察颜色的发展。

5. 反应终止a. 加入适量的住手液到每一个孔中，通常为50-100 μL。

b. 轻轻摇晃板，确保住手液均匀混合。

【检验方法】1.试验前准备（1）缓冲液使用前用蒸馏水或去离子水5倍稀释每瓶样本浓缩缓冲液，最终稀释体积为100ml。

冷藏存储：配好的溶液在2-8℃放置，30天内有效，或标签标注的有效期。

（2）洗液使用前用蒸馏水或去离子水50倍稀释每瓶洗板浓缩缓冲液，最终稀释体积为1000ml。

冷藏存储：配好的溶液在2-8℃放置，30天内有效，或标签标注的有效期。

（3）样本检测前，将所有病人的样本用样本缓冲液1:100稀释。

因此在聚苯乙烯板上应混有10μl的样品和990μl的样品缓冲液。

质控品不需要稀释。

2.试验步骤（1）按需要准备好足够微孔反应板条。

（2）用100μl移液器把质控品和稀释后的病人样本加入到微孔中。

（3）在室温（20-28℃）温育30分钟。

（4）吸取300μl洗液冲洗微孔物质，冲洗3次。

（5）吸取100μl每份酶结合物分加到微孔中。

（6）在室温下温育15分钟。

（7）吸取300μl洗液冲洗微孔物质，冲洗3次。

（8）吸取100μl TMB底物溶液加入到微孔当中。

（9）在室温下温育15分钟。

（10）在每个微孔中加入100μl终止液，在室温下温育5分钟。

（如果酶标仪为读数之前震荡方式可不经5分钟温育后直接进行读数）（11）在450nm波长读取光密度读数并计算结果，如果采用双波长测定，参考波长为600-690nm。

3.程序注意事项（1）试剂的组分应在有效期内使用。

（2）试剂盒各组分不能互换。

（3）所有的实验材料应在室温（20-28℃）下操作。

（4）为了得到稳定和连续性的结果，在测试之前要准备好所有的检测样本，一旦测试开始就不要中断。

（5）严格按标准检测顺序进行检测分析。

（6）使用刚稀释的新鲜样本。

（7）所有的试剂和样本都要加入到微孔底部。

（8）不同样品和不同试剂之间要更换枪头以避免污染。

（9）彻底清洗微孔、除去最后的洗涤缓冲液对得到一个良好结果是非常重要的。

（10）所有的温育过程必须精确计时。

（11）质控品要定期进行检测以保证试剂和检测结果的可信性。