ELISA实验原理,方法,仪器,流程图和注意事项分析

ELISA原理方法操作及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测目标分子的存在和浓度。

ELISA方法基于抗原-抗体反应的原理，通过酶标记的二抗或底物来标记和检测特定抗原或抗体的结合。

1.涂覆：将特异性抗体或抗原溶液加入微孔板的孔中，使其在孔壁上吸附，形成“涂覆抗原”或“涂覆抗体”的微孔板。

孔顶部通常需要使用一个覆膜或负压干燥来防止蒸发。

2.阻断：将孔中添加阻断剂如牛血清白蛋白（BSA）或乳糖，以防止非特异性结合。

3.样品加入：将待测样品加入微孔板，并充分搅拌孔内溶液，以使潜在的目标分子与涂覆的抗原或抗体结合。

4.洗涤：使用缓冲溶液洗涤孔内溶液，以去除未结合的物质。

5.次级抗体加入：加入酶标记的二抗，以与结合到涂覆抗原或抗体的目标分子结合。

这种二抗可以是对目标物质抗体的抗体，也可以是对使用的抗原的抗体。

6.洗涤：使用缓冲溶液洗涤孔内溶液，以去除未结合的物质。

7.底物加入：加入底物（通常为染色底物），以使酶标记的二抗产生可观察的信号。

底物反应产生的颜色或荧光强度与目标分子的浓度成正比。

8.停止反应：加入停止剂如酸，以停止底物反应，并防止进一步的信号增加。

此步骤通常在一定时间后进行。

1.注意对ELISA试剂的保存和使用条件，避免试剂的过期或不适当的保存导致结果偏差。

2.样品收集和处理方面要仔细。

避免样品的污染和交叉污染。

根据检测的目标分子选择适当的样品收集方法和处理方法。

3.在操作过程中，严格控制操作温度和时间。

不同的ELISA方法和试剂可能需要不同的温度和时间条件。

4.遵循相关的操作规程和实验室安全准则，使用个人保护装备，确保实验室安全。

5.在操作过程中，要准确记录每个步骤的时间、温度和取样量等信息，以便进行准确的数据分析和结果解释。

6.ELISA的结果通常是通过测量光密度或荧光强度来表达的，因此在结果分析时需要针对每个样品和对照进行准确的光度或荧光测量。

ELISA的概念、原理、操作步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。

它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。

此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。

(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。

即：用于检测抗体的间接法(图a) 、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。

比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

(二) 操作步骤方法一：用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。

在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

(简称洗涤，下同)。

2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。

然后洗涤。

(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。

37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。

ELISA原理及步骤ELISA，即酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay），是一种常见的免疫学实验技术，在生物医学研究和临床诊断中广泛应用。

它基于抗原与抗体的特异性结合，在酶的催化下，通过颜色的变化来检测和定量分析目标分子的存在。

一、ELISA原理1.包被：将抗原或抗体固定在微孔板表面。

2.孵育：加入待测标本，使抗原和抗体充分结合。

3.清洗：去除未结合的物质。

4.检测：加入酶标记的抗体或底物，与已结合的抗原或抗体反应。

5.测定：加入底物后，产生可测量的信号，如颜色变化。

6.分析：对信号进行测量和定量分析。

二、ELISA步骤1.准备试剂和材料：-抗原或抗体：根据需要选择合适的抗原或抗体。

-微孔板：常用的是96孔或384孔微孔板。

-缓冲液：包括洗涤缓冲液、稀释缓冲液等。

-酶标记二抗和底物：根据需要选择适合的酶标记二抗和底物。

2.包被抗原或抗体：-将抗原或抗体稀释至合适的浓度。

-加入微孔板孔中，使其吸附在孔底。

-孵育在4℃或37℃下，一般需要数小时或过夜孵育。

3.添加标本和控制样品：-将待测标本和控制样品逐孔加入微孔板中。

-孵育一段时间，使抗原和抗体发生特异性结合。

4.洗涤：-倾倒试剂，并洗涤孔内的非特异性吸附物。

-重复该步骤2-3次，以确保洗涤干净。

5.加入酶标记二抗：-将酶标记的二抗加入每个孔中。

-孵育一段时间，使其与已结合的抗原或抗体结合。

6.洗涤：-倾倒试剂，并洗涤孔内的非特异性吸附物。

-重复该步骤2-3次，以确保洗涤干净。

7.加入底物：-加入适合的底物。

-孵育一段时间，使底物与酶发生反应。

8.反应停止：-加入适当的溶液，停止底物酶反应。

9.测定信号：-使用光密度测定仪读取每个孔的吸光度。

-记录吸光度值，用于后续数据分析和定量结果。

三、ELISA的注意事项-实验过程中需严格控制温度和时间，尤其是孵育和洗涤步骤。

-各个试剂需事先准备好，避免其中一步骤时间过长导致信号的变化。

ELISA原理方法操作及注意事项酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测特定物质的存在和浓度。

ELISA基本原理是利用抗体和抗原之间的特异性结合来检测目标分子，通过酶的催化作用产生可定量的信号，从而实现对目标分子的检测。

ELISA方法操作简单、灵敏度高，广泛应用于医学、生物化学、环境监测等领域。

ELISA方法的基本原理是：首先，在试验板上涂覆抗原或抗体，在特定条件下，待分析的样品中的靶分子与已固定在板上的抗原或抗体发生特异性结合；接着加入配制好的检测抗体，检测抗体中含有特定酶，与靶分子结合形成抗原-抗体-酶复合物；加入底物，酶作用产生信号物质以定量检测目标物质的浓度。

1.准备试验板：将试验板中的孔涂覆抗原或抗体，然后将孔洗涤去除未结合的抗原或抗体。

2.加样：加入待检样品，待靶分子与抗原或抗体结合后，洗涤去除未结合的物质。

3.加检测抗体：加入检测抗体，与已结合的靶分子形成特异性结合，洗涤去除未结合的抗体。

4.加底物：加入底物，酶催化底物形成产物，产物的量与目标物质的浓度成正比。

5.停止反应：加入停止液终止酶的催化作用。

6.读板测定：用酶标仪测定产生的信号物质的光密度，根据标准曲线计算出目标物质的浓度。

1.实验前要认真准备实验物品和试剂，保证试验仪器和试剂的良好状态。

2.试验过程中要注意严格按照操作规程进行，避免污染和交叉污染。

3.操作过程中要注意操作手法轻柔，避免样品的损伤或渗漏。

4.样品处理要小心，确保样品完整性和纯度，避免因样品质量引起误差。

5.洗板操作要彻底，确保去除未结合的物质，避免干扰信号的产生。

6.实验过程中要注意仪器的准确校准，避免因仪器误差导致结果不准确。

7.实验结束后要及时清洗、消毒实验器具和废弃化学品，避免环境污染和安全事故发生。

总之，ELISA方法是一种简单、灵敏和可靠的生物化学分析方法，广泛应用于科研和生物医学领域。

在进行ELISA实验时，要严格按照操作规程进行，注意操作的细节和注意事项，保证实验的准确性和可靠性。

elisa实验报告ELISA 实验报告一、实验目的本次 ELISA 实验的目的是检测样本中特定蛋白质的含量，以评估实验对象的生理或病理状态。

二、实验原理ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种基于抗原抗体特异性结合反应的免疫测定技术。

其基本原理是将已知的抗原或抗体固定在固相载体（如聚苯乙烯微孔板）上，然后加入待检样本，使其中的待测抗原或抗体与固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。

接着，加入酶标记的第二抗体（或抗原），形成抗原抗体酶标记抗体复合物。

最后，通过加入底物，酶催化底物显色，根据显色的强度来定量测定待测抗原或抗体的含量。

三、实验材料1、试剂包被缓冲液（pH 96 碳酸盐缓冲液）洗涤缓冲液（含 005% Tween 20 的 PBS 缓冲液）封闭液（含 5% 脱脂奶粉的 PBS 缓冲液）标准品（已知浓度的待测蛋白质）样本（待检测的生物样本，如血清、血浆、细胞培养上清等）酶标抗体（辣根过氧化物酶标记的特异性抗体）底物溶液（TMB 底物溶液）终止液（2 M 硫酸溶液）2、仪器酶标仪移液器（20 μL、200 μL、1000 μL）恒温箱离心机四、实验步骤（一）包被1、用包被缓冲液将捕获抗体稀释至适当浓度。

2、在聚苯乙烯微孔板中，每孔加入100 μL 稀释后的捕获抗体，4℃过夜包被。

（二）洗涤1、次日，弃去孔内液体，每孔加入300 μL 洗涤缓冲液，浸泡 3 分钟，然后弃去洗涤液，重复洗涤 3 次。

1、每孔加入200 μL 封闭液，37℃孵育 1 小时。

（四）加样1、弃去封闭液，洗涤 3 次。

2、将标准品和样本用稀释液稀释至适当浓度。

3、向孔中分别加入100 μL 标准品和样本，空白对照孔只加稀释液，37℃孵育 1 小时。

（五）洗涤同步骤（二）。

（六）加酶标抗体1、每孔加入100 μL 酶标抗体，37℃孵育 1 小时。

（七）洗涤同步骤（二）。

（八）显色1、每孔加入100 μL 底物溶液，37℃避光孵育 15 30 分钟，直至空白对照孔颜色不再加深。

ELISA实验原理方法仪器流程图和注意事项分析ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay），即酶联免疫吸附法，是一种常用的免疫学检测方法。

该方法通过检测抗原与抗体间的特异结合反应来确定样品中特定抗原或抗体的存在与数量。

ELISA技术广泛应用于生物医学和生物化学领域，如病原微生物检测、药物筛选、分子生物学等。

一、ELISA实验的原理方法：1.抗原或抗体的固定：在试验板上的孔中固定特定的抗原或抗体。

这样，待测样品中的特定抗体或抗原与固定的分子结合，形成复合物。

2.特异性抗体或抗原的添加：将待测样品加入试验孔中，特异性的酶标记抗体或抗原与复合物结合形成特异结合。

3.酶标记抗体或抗原的添加：在第二步形成的特异结合物上加入酶标记抗体或抗原，使其与特异结合物再次发生反应。

4.酶标记分子的检测：添加底物，通过底物的转化反应，观察酶标记物的生成并测定其中的酶活性。

底物催化生成的产物含有染色体，可以用光谱仪检测反应的光密度。

5.检测结果的判定：根据光密度的变化来判断待测样品中特定抗体或抗原的含量，常用的方法包括比色法、荧光法和化学发光法等。

二、ELISA实验的仪器：1.酶标仪或光谱仪：用于测定酶标物产生的光密度或荧光信号。

2.孵育箱：提供恒定的温度和湿度条件，进行酶反应过程。

3.洗板机：用于洗涤试验板以去除非特异性结合部分。

4.加液器：用于添加试剂和样品。

5.显微镜：用于观察试验结果。

三、ELISA实验的流程图：1.将特定抗原或抗体固定在试验板上的孔中。

2.加入待测样品，并与固定的抗原或抗体反应。

3.洗涤试验板，去除非特异性结合的物质。

4.加入酶标记抗体或抗原，形成特异结合。

5.洗涤试验板。

6.加入底物，观察酶标物的生成并测定其酶活性。

7.根据底物转化产物的光密度变化，判定待测样品中特定抗体或抗原的含量。

四、ELISA实验的注意事项：1.使用纯净的试剂和无菌的操作条件，以避免实验结果的偏差。

一、ELISＡ旳原理ELIＳA旳基础是抗原或抗体旳固相化及抗原或抗体旳酶标记。

结合在固相载体表面旳抗原或抗体仍保持其免疫学活性, 酶标记旳抗原或抗体既保存其免疫学活性, 又保存酶旳活性。

在测定期,受检标本(测定其中旳抗体或抗原）与固相载体表面旳抗原或抗体起反映。

用洗涤旳措施使固相载体上形成旳抗原抗体复合物与液体中旳其他物质分开。

再加入酶标记旳抗原或抗体, 也通过反映而结合在固相载体上。

此时固相上旳酶量与标本中受检物质旳量呈一定旳比例。

加入酶反映旳底物后,底物被酶催化成为有色产物, 产物旳量与标本中受检物质旳量直接有关,故可根据呈色旳深浅进行定性或定量分析。

由于酶旳催化效率很高,间接地放大了免疫反映旳成果,使测定措施达到很高旳敏感度。

二、EＬISA旳类型ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。

在这种测定措施中有三个必要旳试剂:(1)固相旳抗原或抗体,即＂免疫吸附剂＂（immunoｓorbｅnｔ)；（2)酶标记旳抗原或抗体, 称为“酶联物”、“结合物”（conｊugate）；（3)酶反映旳底物。

根据试剂旳来源和标本旳状况以及检测旳具体条件,可设计出多种不同类型旳检测措施。

用于临床检查旳ELＩS Ａ重要有如下几种类型:（一）双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用旳措施,操作环节如下:(1）将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。

洗涤除去未结合旳抗体及杂质。

（2) 加受检标本,保温反映。

标本中旳抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。

洗涤除去其他未结合物质。

(3) 加酶标抗体,保温反映。

固相免疫复合物上旳抗原与酶标抗体结合。

彻底洗涤未结合旳酶标抗体。

此时固相载体上带有旳酶量与标本中受检抗原旳量有关。

(4) 加底物显色。

固相上旳酶催化底物成为有色产物。

通过比色,测知标本中抗原旳量。

在临床检查中, 此法合用于检查多种蛋白质等大分子抗原, 例如HBｓＡｇ、HBeAg、ＡFＰ、ｈＣG等。

只要获得针对受检抗原旳异性抗体, 就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。