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食品中转基因成分检测第12章ELISA方法定量检测抗农达® (RoundupReady®) 转基因大豆F．Eyquem食品中转基因成分检测 第12章2ELISA 方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆 目 录第12章ELISA 方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆引言 3酶联免疫吸附分析 (ELISA) 技术 7 实验部分 10参考文献 20食品中转基因成分检测 第12章3ELISA 方法定量检测抗农达® (Roundup Ready®) 转基因大豆 引言本章介绍一种用免疫学技术检测转基因植物的方法，这种方法是基于对转化事件中转入基因产生的新蛋白的检测。
但是，值得注意的是，基因修饰并不总是直接特异地对应于产生新蛋白，蛋白表达量水平也并不总是足够用于检测的目的。
另外，某些蛋白可能仅在植物的特定部位表达 (如：组织特异性启动子)，或者在不同部位或不同生理时期其表达量水平也不一样。
有报道称植物中转基因产物表达量水平占总可溶性蛋白的0~2%，甚至在一些强启动子植物中也是如此 (Longstaff ，1995)。
然而，在许多情况下，文献资料报道的转入基因蛋白表达量水平 (如：批准的GM 作物) 一般低于2%的表达上限 (henner ，1997)。
免疫学分析是一种用抗体作为检测试剂的分析测定系统。
抗体是一种从动物血清中分离得到的特异性蛋白，它可特异性地结合于诱导它们产物的底物，即抗原。
抗体的制备是通过将待检测的底物 (如：CP4 EPSPS ，是一种产生农达除草剂抗性的蛋白) 注射到动物如兔子或者老鼠体内，然后动物体内的细胞会将此底物识别为外来物质并产生抗体与之对抗。
抗体经过纯化，并用可检测的标记与之连接，然后可作为检测目标底物的试剂。
免疫学检测方法发展和应用的先决条件是：得到可直接和待检测新蛋白作用的高特异性抗体。
实验四、转基因大豆GTS-40-3-2的PCR检测一、实验目的：利用PCR技术检测混合大豆样品中是否含有转基因大豆GTS-40-3-2成分。
二、实验原理：1、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。
PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的反应动力学：PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
转基因耐除草剂大豆 ZH10-6多重 PCR检测方法的建立摘要本研究通过利用多重PCR(multiplexPCR，MPCR)技术，检测ZH10-6的4个边界序列，建立其分子特征转化体特异性鉴定方法，为该转化体的生物安全评价研究以及知识产权保护和市场行政监管提供重要的基础技术支撑。
关键词：转基因耐除草剂大豆ZH10-6；多重PCR；检测方法1、材料与方法1.1材料转基因耐除草剂大豆(Glycinemax)ZH10-6，非转基因大豆受体ZH10，用于特异性测试的样品有：转基因玉米(Zeamays)混样(MON810，MON863，Bt11，Bt176，GA21，T25，NK603，TC1507，MON88017，3272，MON87427，MON87460，MIR162，MIR604，DAS40278-9，MON89034，4114，59122，5307，BVLA430101每种转化体含量分别为1%，以非转基因玉米作为填充物)；转基因大豆混样(MON87701，MON89788，GTS40-3-2，A2704-12，A5547-127，CV127，356043，305423，MON87769，MON87705，MON87708，FG72，DAS44406-6和SYHT0H2每种转化体含量分别为1%，以非转基因大豆作为填充物)；转基因油菜(Brassicanapus)混样(包括RT73，MS1，MS8，T45，RF1，RF2，Topas19/2，RF3，Oxy235，MON88302，每种转化体含量分别为1%，以非转基因油菜作为填充物)。
1.2仪器和主要试剂LEGENDMICRO21R高速冷冻离心机Ther‐mo；Nanodrop1000核酸定量仪NanoDrop；Veriti96WellPCR仪ABI；电泳仪BIO-RAD；C150凝胶成像系统AzureBiosys‐tems。
植物基因组DNA提取试剂盒DP305；PCR试剂2×GoTaqGreenMasterMix;DL1000DNAMarker;琼脂糖;SuperGelred10000×inwater；引物由GE‐NEWIZ合成。
大豆中转基因成分定性PCR 检测一、 实验目的 (1)DNA 的原理和操作技术。
(2)DNA 的纯度、含量与分子大小。
(3)学习PCR 的基本原理和操作方法。
(4)掌握高速冷冻离心机、微量移液枪、水平电泳仪、PCR 仪等仪器设备的使用。
二、 实验原理由于现有的商品化转基因产品中绝大多数含35S 启动子和NOS 终止子。
故转基因食品的检测一般基于聚合酶链式反应(PCR)35S 启动子和NOS 终止子进行筛选。
聚合酶链反应(PCR)是近年来常用的一种快速、灵敏的检测转基因产品的方法,但要求待分析的基因组DNA 样品尽可能纯化。
PCR 技术的基本原理类似于DNA物。
PCR 由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。
三、 PCR 引物设计表1 引物序列及扩增产物长度四、 转基因大豆抗草甘膦转基因大豆品种京引D-1 、京引D-2 、京引D-3 、京引D-4获市面上购买的转基因大豆，万能粉碎机粉碎。
五、 DNA 的提取 1、称取约0.1g 2ml 离心管中；2、加入600μl CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)缓冲液震荡均匀，65℃水浴保温30min；3、加入500μl 酚：三氯甲烷：异戊醇(25:24:1)，振荡均匀，12000r/min离心15min；4、吸取上清液，放入另一新管中加入500ul的异丙醇，12000r/min离心10min。
5、弃去上清液，加入70%乙醇溶液洗涤，12000r/min离心1min。
6、弃去上清液，干燥，用50μl TE缓冲溶液溶解沉淀。
7、加入5μl RNA酶溶液，37℃水浴保温30min。
8、加入400μl的CTAB缓冲溶液，振荡均匀。
9、加入250μl的三氯甲烷：异戊醇(1:1)，振荡均匀，12000r/min离心15min。
10、吸取上清液，放入另一个新管中，加入200μl的异丙醇，12000r/min离心10min。
11、弃去上清液，干燥，用50μl TE缓冲液溶解沉淀。
转基因大豆的检测实验设计生物技术安全评估 092012年5月目录前言........................................................................3. 实验一大豆样品的准备 (4)实验二大豆DNA的提取和纯化 (4)实验三靶标基因的扩增 (6)实验四反应产品检测 (10)实验五结果分析 (12)参考文献 (12)前言随着转基因工程技术的迅速发展与在生物改良及遗传育种中的大规模应用，转基因生物（Genetically Modified Organism）及其产品的种类越来越多，含有的外源基因类型也越来越多。
抗草甘膦（glyphosate）大豆（商品名，roundup ready soybean）是在传统大豆株Variety A5403中转入外源基因CAMV-35S启动子、抗草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS终止子而得到。
它是目前使用最广的转基因作物之一，每年至少有800万吨转基因大豆进入我国市场。
因此，研究抗草甘膦大豆的快速检测方法具有重要意义。
基于核酸的检测技术主要有PCR 方法和基于PCR 原理的其他检测方法如多重PCR、巢式PCR 等等。
普通PCR 方法已经成为转基因检测中常用的方法，通常是作为定性检测方法，早在2003 年就成为出入境检验检疫系统的行业标准。
这些标准涉及的转基因作物有大豆（SN/T 1195-2003）、玉米(SN/T 1196-2003)、棉花(SN/T 1199-2003)、油菜籽(SN/T 1197-2003)、烟草(SN/T 1200 -2003) 和马铃薯(SN/T 1198 -2003)。
目前广泛应用于进出口商品的转基因成分检测。
随后在2004 年又制定了转基因定性检测的国标(GB/T 19495.4-2004)，该国标中用的方法还是普通PCR。
因此，普通PCR 方法的研究主要在于新的转基因作物的鉴定研究。
转基因大豆的检测实验设计生物技术安全评估 092012年5月目录前言........................................................................3. 实验一大豆样品的准备 (4)实验二大豆DNA的提取和纯化 (4)实验三靶标基因的扩增 (6)实验四反应产品检测 (10)实验五结果分析 (12)参考文献 (12)前言随着转基因工程技术的迅速发展与在生物改良及遗传育种中的大规模应用，转基因生物（Genetically Modified Organism）及其产品的种类越来越多，含有的外源基因类型也越来越多。
抗草甘膦（glyphosate）大豆（商品名，roundup ready soybean）是在传统大豆株Variety A5403中转入外源基因CAMV-35S启动子、抗草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS终止子而得到。
它是目前使用最广的转基因作物之一，每年至少有800万吨转基因大豆进入我国市场。
因此，研究抗草甘膦大豆的快速检测方法具有重要意义。
基于核酸的检测技术主要有PCR 方法和基于PCR 原理的其他检测方法如多重PCR、巢式PCR 等等。
普通PCR 方法已经成为转基因检测中常用的方法，通常是作为定性检测方法，早在2003 年就成为出入境检验检疫系统的行业标准。
这些标准涉及的转基因作物有大豆（SN/T 1195-2003）、玉米(SN/T 1196-2003)、棉花(SN/T 1199-2003)、油菜籽(SN/T 1197-2003)、烟草(SN/T 1200 -2003) 和马铃薯(SN/T 1198 -2003)。
目前广泛应用于进出口商品的转基因成分检测。
随后在2004 年又制定了转基因定性检测的国标(GB/T 19495.4-2004)，该国标中用的方法还是普通PCR。
因此，普通PCR 方法的研究主要在于新的转基因作物的鉴定研究。
PCR检测转基因大豆：[目的]定性检测转基因大豆。
[方法]以非转基因大豆和CP4-EPSPS转基因大豆为材料,以大豆内源基因Lectin和外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(CP4-EPSPS)为检测的目的片段,建立PCR反应体系。
采用改进CTAB法提取大豆基因组DNA,并对所提DNA进行PCR扩增和电泳检测,确定转基因大豆的PCR检测限。
实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立：采用实时荧光定量PCR技术,通过使用特异的引物和探针,对大豆中的内源基因Lectin和转基因大豆中的外源基因EPSPS进行了定量检测,建立了Monsanto公司生产的商业化转基因大豆Roundup Ready○R的定量PCR检测方法。
该方法的检测灵敏度<001%,是国际上设定的转基因最低限量的100倍用巢式和半巢式PCR检测转基因大豆Roundup Ready及其深加工食品：用从转基因大豆(Glycinemax )颗粒中提取的DNA作为模板,经过稀释,形成不同浓度梯度的DNA溶液,然后用巢式和半巢式PCR进行扩增反应。
结果表明,巢式和半巢式PCR均可以扩增DNA浓度为10-14g/μL的溶液。
用巢式和半巢式PCR对市场的食品原料和深加工食品进行检测,可以从大豆油、酱油、面酱、大豆磷脂、豆腐、豆浆等食品原料和深加工食品的17个品牌的食品中检测出大豆内标基因(housekeepinggene)。
ELISA方法定量检测转基因大豆及其产品的研究：以美国、阿根廷、巴西转基因大豆等为材料,建立了ELISA法定量检测抗草甘膦转基因大豆CP4 EP- SPS蛋白的方法,成功检测出美国转基因大豆含量为3.768%、阿根廷转基因大豆含量为2.820%、巴西转基因大含量为1.920%,转基因豆粉、转基因豆粕和中国大豆未检测到CP4 EPSPS蛋白。
此方法具有简便、快速、稳定等优点,其检测灵敏度可达到0.0075%,并且稳定性良好,为抗草甘膦转基因大豆中CP4EPSPS蛋白的定量检测提供了有效的手段。
转基因大豆的检测实验设计生物技术安全评估 092012年5月目录前言........................................................................3. 实验一大豆样品的准备 (4)实验二大豆DNA的提取和纯化 (4)实验三靶标基因的扩增 (6)实验四反应产品检测 (10)实验五结果分析 (12)参考文献 (12)前言随着转基因工程技术的迅速发展与在生物改良及遗传育种中的大规模应用，转基因生物（Genetically Modified Organism）及其产品的种类越来越多，含有的外源基因类型也越来越多。
抗草甘膦（glyphosate）大豆（商品名，roundup ready soybean）是在传统大豆株Variety A5403中转入外源基因CAMV-35S启动子、抗草甘膦基因CP4-EPSPS和NOS终止子而得到。
它是目前使用最广的转基因作物之一，每年至少有800万吨转基因大豆进入我国市场。
因此，研究抗草甘膦大豆的快速检测方法具有重要意义。
基于核酸的检测技术主要有PCR 方法和基于PCR 原理的其他检测方法如多重PCR、巢式PCR 等等。
普通PCR 方法已经成为转基因检测中常用的方法，通常是作为定性检测方法，早在2003 年就成为出入境检验检疫系统的行业标准。
这些标准涉及的转基因作物有大豆（SN/T 1195-2003）、玉米(SN/T 1196-2003)、棉花(SN/T 1199-2003)、油菜籽(SN/T 1197-2003)、烟草(SN/T 1200 -2003) 和马铃薯(SN/T 1198 -2003)。
目前广泛应用于进出口商品的转基因成分检测。
随后在2004 年又制定了转基因定性检测的国标(GB/T 19495.4-2004)，该国标中用的方法还是普通PCR。
因此，普通PCR 方法的研究主要在于新的转基因作物的鉴定研究。
本实验以三种大豆为材料进行比较，通过对其DNA的提取和纯化，靶标基因的获取及琼脂糖电泳分析，从而鉴定所检测大豆样品。
采用PCR检测转基因大豆的方法，主要是采用琼脂糖凝胶电泳法，首先检测CAMV-35S启动子进行筛选，然后检测EPSPS抗草甘膦基因。
实验一大豆样品的准备一样品来源：（原始样品最小质量为：11200克）1、阳性抗草甘膦转基因大豆标准物质（IRMM-410R，Fluka公司）2、进口转基因大豆样品3、非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所提供。
二样品加工过程：1、构成原始样品（原始样品不得低于试验样品的4倍）2、样品的初步处理（去皮、去壳、除水、除油等应记录初步处理前后样品的质量变化）3、破碎和研磨4、缩分5、实验室样品的制备（实验室样品的最小质量不能小于原始样品最小质量的1/16）6、存查样品和式样的制备实验二大豆DNA的提取和纯化（CTAB法）一实验目的掌握用CTAB法提取真核细胞总DNA的原理、步骤和注意事项。
二实验原理1、CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
2、CTAB提取缓冲液各成分的作用：（1）Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏（2）EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性（3）NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中（4）Cβ-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA（5）主要作用物质就是氯仿，所以它占有的比例较大，而异戊醇的主要就是防止起泡泡。
三实验仪器和实验试剂1.仪器：水浴锅离心机 EP管电泳仪研钵2.试剂: 去离子水乙醇氯仿-异戊醇液氮CTAB缓冲液：CTAB 20g/L，Tris-HCI 0.1 mol/L(pH8. 0)， EDTA 0.02 mol/L.TE缓冲液：lo mmol/L Tris.，1 mmol/I, EDTA， pH8.0).酶溶液：5µg/µl.材料：阳性抗草甘膦转基因大豆标准物质（IRMM-410R，Fluka公司）、进口转基因大豆样品和非转基因大豆由国家进出口商品检验研究所提供。
四实验步骤（三种材料分别进行）1、洗干净大豆叶片，用75%的酒精表面消毒3min, 用去离子水冲洗3~4次2. 称取1g叶片放入灭过菌的研体中，加入液氮捣碎，迅速转入2ml离心管中。
3. 加入600µl CTAB缓冲液，震荡均匀，65℃温育30min.4. 加入500ul 酚：三氯甲烷：异戊醇（25:24:1），振荡均匀，12000r/min，离心15min。
5. 吸取上清液，放入另一新管中，加入等体积的异丙醇，12000r/min，离心10min。
6. 弃去上清液，加入70%乙醇溶液洗涤，12000r/min，离心1min。
7. 弃去上清液，干燥，用50µl TE溶液溶解沉淀。
8. 加入5µl RNA酶溶液，37℃温育30min。
9. 加入400µl的CTAB溶液，振荡均匀。
10. 加入250µl的三氯甲烷：异戊醇，振荡均匀，12000r/min，离心15min。
11. 吸取上清液，放入另一个新管中，加入200µl的异丙醇，12000r/min，离心10min。
12. 弃去上清液，干燥，用50µl TE缓冲液溶解沉淀。
五实验结果获取大豆的DNA。
六注意事项1.研磨组织块用于DNA提取的样品,必须是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。
2.整个抽提过程，要尽量避免DNA酶的污染，全程配戴一次性手套，皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染DNA的抽提并成为DNA酶的来源。
培养良好的微生物实验操作习惯，预防微生物污染。
本实验亦可用试剂法。
（takara公司：首页-产品分类目录 -DNA Extraction Kit for GMO Detection）实验三靶标基因的扩增一大豆内源基因lectin的检测1、范围本方法规定了大豆物种特异性单拷贝基因序列的常规检测程序。
本方法适用于评价从大豆加工产品中提取的DNA质量，并可判断是否有足量的DNA用于基因成分检测。
2、原理通过PCR扩增的凝胶电泳分离可得到大小为118bp的大豆Lectin基因片段。
3、检测下限本方法能检测0.1ng的大豆DNA。
4、试剂一般要求按照GB/T 19495.1—2004的要求执行。
水10 X PCR缓冲液（不含氯化镁）氯化镁溶液：25 mmol/L.dNTP溶液：各2.5 mmol/L.引物：A、正向引物大豆Lectin基因（GeneBank® 编号：K00821）5’-GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C-3’B、反向引物大豆Lectin基因（GeneBank® 编号：K00821）5’-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG-3’Taq酶：5 IU/μL5、仪器：PCR仪、电泳仪6、PCR扩增PCR反应体系本方法中中，PCR反应的总体积为25μL，反应体系见表A.1。
可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系。
PCR反应参数见表A.2。
使用不同的PCR仪，可对参数作适当地调整。
如果PCR产物通过电泳确证，可表述样品DNA溶液中含有来源于大豆的可扩增的DNA。
二转基因大豆DNA(CaMV 35S启动子)筛选检测方法1、范围本方法规定了CaMV 35S启动子不同拷贝数的定性PCR检测方法。
本方法适用于转基因大豆CaMV 35S启动子的筛选检测。
2、原理通过PCR扩增的凝胶电泳分离可得到大小为195bp的CaMV 35S启动子基因片段。
3、检测下限本方法未确定绝对检测下限。
相对检测下限可以检测含有0.1% (质量分数)转基因抗草甘磷大豆粉(IRMM-410)。
4、试剂一般要求按照GB/T 19495.1—2004的要求执行。
水10 X PCR缓冲液（不含氯化镁）氯化镁溶液：25 mmol/L.dNTP溶液：各2.5 mmol/L.引物：A、正向引物CaMV 35S启动子（GeneBank® 编号：V00141）5’-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3’B、反向引物CaMV 35S启动子（GeneBank® 编号：V00141）5’-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3’Taq酶：5 IU/μL限制性内切酶Xmn I （=Asp 700）5、仪器：PCR仪、电泳仪6、PCR扩增PCR反应体系本方法中中，PCR反应的总体积为25μL，反应体系见表B.1。
可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系。
PCR反应参数见表B.2。
使用不同的PCR仪，可对参数作适当地调整。
如果具备下列条件，就能确定检测到目标序列：——PCR扩增产生195 bp的DNA片段；——经过序列分析，未知样品PCR扩增条带的DNA序列与阳性对照DNA序列一致；——用限制性内切酶Xmn I酶切PCR产物产生115 bp和80 bp两个片段；三抗草甘膦除草剂基因的检测1、范围本方法规定了在原料中加工产品中检测转基因抗草甘膦除草剂（Roundup Ready TM）大豆的定性PCR方法。
本方法适用于对原料和加工产品中转基因成分检测，不适用与对基因堆积品种的转基因成分检测。
2、原理通过PCR扩增的凝胶电泳分离可得到大小为172bp的DNA片段，包括CaMV35S启动子和矮牵牛叶体运输肽部分序列。
3、检测下限根据每个基因组中的结构基因是1个拷贝和每个基因组的大小为1.13X109bp 的假设，PCR检测绝对下限为50ngDNA，相当于40个基因组。
4、试剂一般要求按照GB/T 19495.1—2004的要求执行。
水10 X PCR缓冲液（不含氯化镁）氯化镁溶液：25 mmol/L.dNTP溶液：各2.5 mmol/L.引物：A、正向引物CaMV 35S启动子（GeneBank® 编号：V00141,J02048）5’-TGA TGT GAT ATC TCC ACT GAC G-3’B、反向引物矮牵牛叶绿体运输肽基因（GeneBank® 编号：M21084，J03227）5’-TGT ATC CCT TGA GCC ATG TTG T -3’Taq酶：5 IU/μL杂交探针5’-GGG TCT TGC GAA GGA TAG TG -3’预杂交溶液5xSSC，0.1%N-月桂酰肌氨酸（质量浓度），0.2%SDS（质量浓度），1%终止液。
