两性小鼠核移植胚胎干细胞系的建立及其在胚胎干细胞多能性评估中的研究
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高中生物 第一单元 生物技术与生物工程 第2章 第4节 干细胞工程教案 中图版选修3-中图版高中选修
第四节干细胞工程1．描述干细胞分类。
(重点)2．举例说出胚胎干细胞的移植。
(难点)干细胞的概念及其分类1．干细胞具有自我更新和分化发育潜能的原始细胞。
2．干细胞分类(依据分化潜能的大小)(1)全能干细胞：具有形成机体的任何组织或器官直至形成完整个体的潜能，如受精卵。
(2)多能干细胞：具有分化成多种组织的潜能，但不能发育成完整的个体，如骨髓造血干细胞。
(3)专能干细胞：只能分化成某一类型的细胞，如神经干细胞。
[合作探讨]探讨1：全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞全能性的大小顺序为？提示：全能干细胞＞多能干细胞＞专能干细胞。
探讨2：各类干细胞都能形成一个完整个体吗？提示：各类功能干细胞都具有发育的全能性，即可以分化为成年动物体内任何一种组织细胞，但只有全能干细胞才具有发育成完整个体的潜能。
探讨3：胚胎发育过程中不同干细胞之间存在怎样的关系？提示：受精卵→全能干细胞→多能干细胞→专能干细胞。
[思维升华]1．对干细胞的理解(1)干细胞是机体内未分化或未完全分化的细胞，它们的增殖和分化，可以实现机体组织细胞的更新，也可以发育成某一组织、器官。
(2)机体内的一般体细胞已经发生了分化，而这种分化一般是不可逆的，所以分化了的体细胞一般失去了分裂增殖能力，即细胞的自我更新能力。
2．干细胞类型比较名称全能干细胞多能干细胞专能干细胞特点具有形成机体的任何组织或器官直至形成完整个体的潜能具有分化成多种细胞或组织的潜能，但不能发育成完整的个体只能分化成某一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞举例受精卵、胚胎干细胞造血干细胞神经干细胞应用用于病人的器官移植等造血干细胞移植是治疗血液系统疾病、遗传性血液病等的有效手段通过神经干细胞移植治疗脑瘫、头颅外伤等病症1．下列关于胚胎干细胞的叙述，哪项是不正确的( )A．动物胚胎的每一个细胞都是胚胎干细胞B．胚胎干细胞具有分化为动物各种组织的潜能C．胚胎干细胞的遗传物质在质和量上与受精卵相同D．胚胎干细胞在体外可被诱导分化为不同的组织类型【解析】胚胎干细胞主要来源于囊胚期的内细胞团；由于其分化的全能性，也可在体外培养时诱导为不同的机体组织；细胞分化是基因选择性表达的过程，细胞中的遗传物质并不发生改变。
小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
第七章用于组织工程的种子细胞(2010)
小鼠体细胞核移植技术的初步研究
引言
体细胞核转移是治疗性克隆的关键技术, 体细胞核转移是治疗性克隆的关键技术 , 建立和掌握成熟的体细胞核移植技术， 建立和掌握成熟的体细胞核移植技术 ， 对在 临床上成功地进行治疗性克隆的应用非常重 临床上成功地进行 治疗性克隆的应用非常重 要。
本研究以小鼠卵丘细胞为核供细胞， 本研究以小鼠卵丘细胞为核供细胞 ， 卵母细 胞为核受体组成重构胚 , 分别进行了卵丘细 胞的分离、 分裂中期卵母细胞的去核、 胞的分离 、 分裂中期卵母细胞的去核 、 供体 细胞核的注射、 细胞核的注射 、 重构胚的电融合以及卵母细 胞的活化等研究， 胞的活化等研究 ， 以 建立和掌握成熟的体细 胞核移植技术。 胞核移植技术。
干细胞的定义
简单的讲，干细胞是一类具有无限的或者永生 简单的讲， 的自我更新能力的细胞， 的自我更新能力的细胞，能够产生至少一种类 型的、高度分化的子代细胞。 型的、高度分化的子代细胞。 从功能上讲，干细胞是一类具有多向分化潜能、 从功能上讲，干细胞是一类具有多向分化潜能、 自我更新能力的细胞， 自我更新能力的细胞， 是处于细胞系起源顶端 的最原始的细胞， 的最原始的细胞，在体内能够分化产生某种特 定组织类型的细胞。 定组织类型的细胞。
2胞的共同特性， 骨髓细胞有着干细胞的共同特性，可通过体外贴壁 培养， 培养，或根据细胞表面的特异表达的分子来获得相 对较纯的间充质干细胞群，对其进行体外定向诱导， 对较纯的间充质干细胞群，对其进行体外定向诱导， 研究它的发育机制或用于临床。 研究它的发育机制或用于临床。 骨髓间充质干细胞取材方便且对机体无害， 骨髓间充质干细胞取材方便且对机体无害，简单的 骨髓穿刺即可获得， 骨髓穿刺即可获得，理论上可以分化为所有的间充 质组织类型： 软骨、肌肉、肌腱、真皮等。 质组织类型：骨、软骨、肌肉、肌腱、真皮等。骨 髓间充质干细胞由于以上特性而成为基因治疗的良 好载体。 好载体。
2024年统编版2024选修3生物下册月考试卷578
2024年统编版2024选修3生物下册月考试卷578考试试卷考试范围：全部知识点；考试时间：120分钟学校：______ 姓名：______ 班级：______ 考号：______总分栏题号一二三四五六总分得分评卷人得分一、选择题(共9题，共18分)1、关于桑椹胚和囊胚的比较，下列叙述正确的是A. 桑椹胚的内细胞团将来可发育成胎儿的各种组织B. 囊胚的滋养层细胞具有发育的全能性C. 囊胚期细胞分化是由于遗传物质突变引起的D. 囊胚的进一步扩大会导致透明带的破裂2、人类13号染色体上Rb基因突变是导致视网膜母细胞瘤的原因之一。
已知Rb基因表达产物pRb蛋白可与调控因子E2F结合，进而抑制E2F的功能。
E2F可与靶基因结合启动靶基因的表达，最终能促进细胞分裂，过程如图所示。
下列分析不合理的是（）A. Rb基因可能是一种与癌变有关的抑癌基因B. Rb基因突变产生的新基因是其等位基因C. E2F通过调控DNA聚合酶的合成促进细胞分裂D. 可以通过修复造血干细胞中的Rb基因治疗该病3、CD47是一种细胞膜表面糖蛋白，可与巨噬细胞结合，从而抑制巨噬细胞的吞噬作用。
为验证抗CD47的单克隆抗体可以减弱CD47对巨噬细胞的抑制作用，科学家按照如下流程进行了实验，下列叙述错误的是（）A. 实验流程中CD47充当抗原的作用B. 融合、筛选得到的杂交瘤细胞不一定能产生抗CD47的单克隆抗体C. 对照组应设置为：巨噬细胞+正常细胞共培养体系+单克隆抗体D. 预期实验结果为：实验组的巨噬细胞的吞噬能力高于对照组4、中国科学院孙强团队对一流产雌性猕猴进行克隆；成功获得“中中”和“华华”两姐妹，突破了现有技术无法体细胞克隆非人灵长类动物的世界难题，为建立人类疾病的动物模型，研究疾病机理，研发诊治药物带来光明前景。
下图为“中中”和“华华”培育的流程，相关叙述正确的是（）A. 过程①将成纤维细胞注射在放射冠和透明带间，可降低对卵细胞的损伤B. 过程②在培养基中加入动物血清，可为激发成纤维细胞核的全能性提供物质条件C. 过程③进行同步发情处理，可降低代孕母猴对“中中”、“华华”的免疫排斥反应D. 与模型小鼠相比，模型猴更适合于研究人类疾病的发病机理、研发诊治药物5、“筛选”是生物工程中常用的技术手段，下列关于筛选的叙述错误的是（）A. 基因工程中通过标记基因筛选出的细胞不一定含重组质粒B. 在小鼠胚胎细胞培养过程中，需要通过筛选才能获得具有无限分裂能力的细胞C. 植物体细胞杂交过程中，原生质体融合后获得的细胞需要进行筛选D. 单克隆抗体制备过程中，第二次筛选出的细胞既能无限增殖又能产特定抗体6、下图为受精作用及胚胎发育示意图，a、b代表两个发育时期；下列叙述不正确的是（）A. ①过程发生了基因自由组合，增加了后代的多样性B. ②过程通过有丝分裂增殖C. a时期可分离得到胚胎干细胞D. ②→④过程，细胞分化程度逐渐增大7、在实验室内利用胚胎干细胞（ES细胞）制作小鼠胚胎模型，探究人类某些疾病的发病机制。
干细胞治疗胚胎干细胞途径与法律限制问题评估
干细胞治疗胚胎干细胞途径与法律限制问题评估干细胞治疗作为一种新兴的治疗方法，给人们带来了希望。
其中，胚胎干细胞被认为具有巨大的潜力，可以用于治疗一系列严重疾病和损伤。
然而，胚胎干细胞的使用涉及到诸多道德和法律限制问题。
本文就干细胞治疗胚胎干细胞途径和法律限制问题进行评估。
首先，我们需要了解胚胎干细胞的来源。
胚胎干细胞可以从早期胚胎中获得，这意味着胚胎会被摧毁。
这给了人们道德上的困扰。
在不同国家和地区，对胚胎干细胞的使用存在着不同的规定和约束。
在美国，胚胎干细胞的研究受到了限制。
2001年，美国国家卫生研究院批准了对一部分胚胎的研究使用，但对于新鲜的胚胎的使用是被禁止的。
这一政策限制了胚胎干细胞的研究进程，并引发了伦理上的争议。
然而，近年来，新兴的诱导多能性干细胞技术为该领域带来了曙光。
这项技术使得科学家可以从成人细胞中重新编程获得类似于胚胎干细胞的多能性干细胞，从而避免了涉及胚胎的伦理和法律问题。
在欧洲，对胚胎干细胞的使用存在着更为严格的限制。
欧盟立法将胚胎生命的保护置于优先地位，因此，使用新鲜胚胎的研究是被禁止的。
只有存在合法的尸胎的情况下，才能获得胚胎干细胞。
这一法律限制引发了科学界和道德界之间的激烈争议。
尽管如此，欧洲在干细胞领域的研究卓有成效。
中国是世界上最活跃的干细胞研究国家之一。
中国的法规相对宽松，允许胚胎干细胞和成人干细胞的使用。
在中国，可以通过捐赠冷冻胚胎、人类胚胎核移植和克隆技术等多种途径获得胚胎干细胞。
这使得中国成为干细胞研究和临床应用方面的领导者。
然而，也必须注意到，胚胎干细胞的使用需要受到严格的监管，以确保伦理和法律的合规性。
当前，随着干细胞技术的飞速发展，越来越多的国家和地区开始制定相关法律规定，以保护科学研究的合法性和伦理性。
这些法律限制主要是为了平衡科学研究和伦理价值观之间的关系，避免滥用和伦理冲突的发生。
可以预见，未来的法规可能会更严格并逐渐与国际接轨，以便更好地管理胚胎干细胞的使用。
动物克隆 第三章胚胎干细胞分离培养
第三章胚胎干细胞分离培养1981年，Evens等首次发现小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在体外具有稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特性，并成功建立小鼠ESCs系[1]。
由于ESCs独特的生物学特性，ESCs方面的研究迅速成为生命科学研究领域的热点之一，1999年－2000年连续两年被评为世界十大科技新闻。
ESCs已成为分子遗传学、发育生物学、细胞工程、组织工程等研究的重要工具，在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因等方面有着重要的意义。
随着对干细胞研究的不断深入，人们将逐渐掌握和利用干细胞，还将推动相关学科的发展。
文章综述了ESCs的研究概况、体外分离培养、生物学特性、鉴定方法、影响ESCs分离培养的因素、存在问题以及应用前景等。
1 胚胎干细胞研究概况ESCs的研究最早要追溯到畸胎瘤细胞的发现，但真正意义上的开始却是1981年Evens等首先从延缓着床的胚泡分离培养到小鼠的ESCs，并建立小鼠的ESCs系，之后ESCs研究迅速发展，已在大鼠、仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊、绵羊、恒河猴和人等多种哺乳动物上建立了类ESCs系[2]。
近几年来，ESCs研究在ESCs来源与培养方法、探索建立和维持ESCs系的条件、定向诱导分化、遗传操作、疾病动物模型的治疗等方面取得了一定的进展。
研究人员利用体细胞核移植技术进行胚胎重建，从克隆胚胎中成功得到小鼠、兔和人等多种哺乳动物ESCs[3-5]；利用孤雌激活技术建立小鼠和非人灵长类孤雌激活胚胎源的ESCs系[6]，这些为ESCs的分离克隆开辟了新的途径。
利用定向诱导分化技术成功将ESCs分化为造血细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成骨细胞，甚至滋养层细胞和生殖细胞等所有3 个胚层的细胞类型[7-13]。
试验表明，人ESCs 能有效治疗心肌梗死、糖尿病、中风等疾病。
国内在ESCs方面的研究起步较晚，但发展迅速，在相关领域做了大量的研究。
哺乳动物胚胎干细胞多能性和全能性研究进展
包头师范学院本科学年论文论文题目：哺乳动物胚胎干细胞多能性和全能性研究进展院系：生物科学与技术学院专业：生物科学学号：0911370087姓名：李巧英指导教师：图雅撰写学年：2009 至2010 学年二零一零年十二月摘要本文主要介绍了哺乳类动物胚胎干细胞的一些生物学特性，并着重介绍了它的多能性和全能性，以及多能性或全能性的检测技术。
利用此技术制作嵌合体及嵌合体动物可以为人类器官移植提供实验材料。
胚胎干细胞有着极广的应用范围，本文综述了它在基因、遗传、克隆、体外细胞分化及哺乳动物的个体发育等方面的研究。
但是，由于哺乳动物错综复杂的基因调控和环境因素的影响，对于胚胎干细胞的研究还存在诸多问题，还需作更深入细致的研究。
关键词：胚胎干细胞；全能性；嵌合；分化2This article mainly introduced the mammalia animal embryonic stem cell's some biology characteristic, and introduced its pluripotent and the totipotency emphatically, as well as pluripotent or totipotency examination technology. May provide the experiment material using this technical manufacture chimaera and the chimaera animal for the humanity organ transplanting. The embryonic stem cell has the extremely broad application scope, this article summarized it in the gene, the heredity, the clone, in vitro cell differentiation and mammal's aspect and so on ontoge- nesis research. But, as a result of the mammal intriguing gene regulation and environmental factor's influence, also has many problems regarding the embryo stem cell's research, but must do more thorough careful research.Key words：Embryonic stem cell; Totipotency;The Qianmatches ;Divide3中文摘要 (2)英文摘要 (3)引言 (4)1 胚胎干细胞的生物学特性 (5)1.1胚胎干细胞的定义 (5)1.2 胚胎干细胞的形态鉴定 (5)1.3 胚胎干细胞的全能性或多能性 (5)1.4胚胎干细胞的体外分化 (6)1.5胚胎干细胞的遗传稳定性 (6)2．细胞全能性或多能性检测的方法 (6)2.1 原核注射技术 (6)2.2 胚胎嵌合技术 (7)2.2.1嵌合体制作技术 (7)2.2.2检测ES细胞在嵌合体表达的方法 (7)2.3 ES细胞的诱导分化检测技术 (8)2.4 胚胎干细胞核移植技术 (9)2.5 免疫学方法鉴定 (9)3．胚胎干细胞应用前景展望 (9)3.1胚胎干细胞在哺乳动物个体发育中的研究 (9)3.2 生产嵌合体动物 (9)3.3 为发育遗传研究提供实验材料 (9)3.4.胚胎干细胞是研究体外细胞分化的理想材料 (10)3.5胚胎干细胞作为外源基因 (10)3.6克隆动物 (10)3.7胚胎干细胞用于治疗疾病 (11)4、胚胎干细胞应用中的争议 (11)结论 (12)参考文献 (13)致谢 (15)胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES)是从早期胚胎的内细胞团(Inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞(Primordialgerm cells, PGCs)分离出来的具有发育全能性的一种未分化的细胞,它具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能。
小鼠胚胎干细胞自我更新的信号调控机制
小鼠胚胎干细胞自我更新的信号调控机制在生命科学的广袤领域中，小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）自我更新的信号调控机制一直是备受关注的研究热点。
这不仅对于深入理解胚胎发育的奥秘至关重要，还为再生医学和疾病治疗带来了无限的可能。
要明白小鼠胚胎干细胞的自我更新机制，首先得清楚什么是胚胎干细胞。
简单来说，胚胎干细胞是一种具有全能性的细胞，它们有潜力分化成身体内的各种细胞类型。
而自我更新，则指的是这些细胞在保持未分化状态的同时，能够不断地分裂增殖，产生更多的相同类型的胚胎干细胞。
那么，是什么在背后操控着这一神奇的过程呢？其中，一系列的信号通路起着关键的调控作用。
首先，LIF/STAT3 信号通路在小鼠胚胎干细胞的自我更新中扮演着重要角色。
LIF（Leukemia Inhibitory Factor，白血病抑制因子）与细胞表面的受体结合后，激活了 STAT3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3，信号转导与转录激活因子 3）。
活化的 STAT3 进入细胞核，调控一系列与自我更新相关的基因的表达。
当 LIF 存在时，STAT3 被激活，促进胚胎干细胞的自我更新；而缺乏 LIF 时，STAT3活性降低，胚胎干细胞容易发生分化。
再者，BMP（Bone Morphogenetic Protein，骨形态发生蛋白）信号通路也对小鼠胚胎干细胞的自我更新有着重要影响。
BMP 与相应的受体结合后，通过一系列的信号转导，激活下游的 Smad 蛋白。
这些被激活的 Smad 蛋白会与其他转录因子相互作用，调节与自我更新和多能性相关的基因表达，从而维持胚胎干细胞的未分化状态。
除了上述两条主要的信号通路，还有其他一些因素也参与其中。
例如，Wnt 信号通路在小鼠胚胎干细胞的自我更新中也发挥了一定的作用。
当 Wnt 信号通路被激活时，它可以抑制胚胎干细胞的分化，促进其自我更新。
诱导产生多能性干细胞的研究
4.Klf4
Krueppel-like factor 4， KLF4上皮锌指转录因子 Klf4 (旧称GKLF)调节体外 细胞的增生与分化
iPS细胞诱导机制
已分化的细胞 1 病毒逆转录 3
Ips细胞 5
导入病毒基因
2 Oct3/4、Sox2、cMyc和Klf4
4
胚胎干细胞培养条件和 筛选
诱导多功能细胞
诱导性多能 干细胞用于 治疗小鼠帕 金森病
美国麻省Whitehead生物医学研究的 Wernig等近日报告,通过Oct4、Sox2、 Klf4和c-Myc四种转录因子诱导出的iPS细 胞可分化成神经细胞,可改善帕金森病小鼠的 运动功能。
iPS细胞在体外分化成 神经细胞
未分化的iPS细胞
研究者首先检验了iPS 细胞在体外的分化能力, 发现iPS细胞可以分化 成神经元细胞和神经胶 质细胞,并且能够进一 步生成神经元亚型细胞
Ips细胞系建立的一些重要环节 （几种因子的发现过程）
日本科学家发现ES细胞中那个存在着一些因子，这些因子对于 多能性的建立可能至关重要。科学家对24个与多能性维持相关 的候选基因导入小鼠成纤维细胞中，依次去掉其中一个基因， 最后在得到的10个基因中发现了4个至关重要的基因，其中任 何一个缺失都将导致实验的失败，这4个基因中的任意2个或3 个组合都无法形成具有ES细胞特性的ips细胞。从而确定了： Oct4,Sox2,c-myc和Klf4这4种基因
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Ips细胞研究中存在的问题
一．肿瘤相关基因，如c-myc的使用，有诱发癌 症的可能
二．逆转录病毒转染可能会导致一些癌基因的激 活，也可能导致某些重要基因功能受阻。
三．基因表达模式与ESC还存在一些不同。 四．效率较低，重组率只有0.1%。
干细胞的建系胚胎
建立和维持人胚胎干细胞系的条件 :
• 1 饲养层: • 饲养层是建立和维持人ES细胞系的必要条 件。迄今为止，已分离得到的非人灵长类 和人胚胎干细胞系无一不是在饲养层条件 下建立和维持的。除人EG细胞系是以STO细 胞为饲养层建立的之外，非人灵长类和人 胚胎干细胞系均以小鼠胚胎成纤维细胞 （MEF）为饲养层建立的。在无饲养层的情
• 在小鼠EG细胞的建系和维持过程中，MEF 也是其必 要条件之一。而在仅有的一例关于人EG细胞系的建 系报道中，用MEF 作为饲养层却是不成功的，而 STO饲养层在人EG细胞建系中具有不可替代的作用。 这一结论是很难解释的，因为仅有一例报道，尚不 能确定MEF在人EG细胞建系中的确切作用。
• 2、 培养基组成 • 用于人和其它动物胚胎干细胞分离培养的培养 基的组成大同小异，一般采用DMEM（无丙酮酸钠、 4500mg/L葡萄糖）培养液，补加15%~20%的胎牛血 清（Hyclone）和其它一些微量成分如β-ME、非必 需氨基酸、谷氨酰胺等，如Thomson和Reubinoff所 采用的培养基组成分别为：DMEM+20%胎牛血清 +1mmol/L谷氨酰胺+0.1mmol/L β-ME+1%非必需氨基 酸；DMEM+20%胎牛血清+2mmol/L谷氨酰胺 +0.1mmol/Lβ-ME+1%非必需氨基酸+50IU/mL青霉素 +50µg/mL链霉素+2000IU/mLhLIF。这两组配方并
人胚胎干细胞建系中存在的问题
• 1、与小鼠囊胚不同，人的囊胚在 体外培养情况下不容
• 易自行脱去透明带，用囊胚的免疫 手术法建立人的ES细胞 • 系，如果操作不熟练、去除透明带 和滋养层所用的链酶蛋白 • 酶（Pronase）、抗血清和补体的
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本研究利用遗传突变的两性小鼠心肌成纤维细 胞为核移植供体细胞, 通过核移植技术得到 14 个克 隆囊胚, 建立起 3 株 ntESC 系. 这 3 株 ntESC 系具有 正常小鼠胚胎干细胞系的形态特征, 并且表达正常 小鼠胚胎干细胞的所有多能性与特异性的阳性分子 标记, 如碱性磷酸酶, Oct4, SSEA-1 等, 同时不表达 阴性的分子标记, 如 SSEA-4 等, 并能够在 SCID 小鼠 体内形成具有三胚层分化的畸胎瘤, 证明建立的两 性小鼠 ntESC 系具有多能性. 但是 2 倍体嵌合结果表 明, 两性小鼠胚胎干细胞系不能够生殖嵌合, 因此不 具有全能性. 这也提示我们评估干细胞系多能性的 标准仅仅用畸胎瘤注射的方式是不充分的, 有必要 寻找并建立新的检测方法或技术.
(ⅴ) PCR 分析两性小鼠 Y 染色体特异性基因. 从两性小鼠 ntESC 中提取基因组 DNA, PCR 扩增小 鼠 Y 染色体特异性基因 Sry, Zfy1, Rbmy, Ssty1 和 Ssty2 以及常染色体基因 Myog 和 Gapdh[20,21]. PCR 引物序 列如表 1 所示. 取 PCR 产物做凝胶电泳检测基因表达.
关键词 体细胞核移植 胚胎干细胞 治疗性克隆 两性小鼠
治疗性克隆(therapeutic cloning)是指从病人获得 体细胞, 经过体外培养, 应用核移植技术将供体细胞 核移入去核的卵母细胞中, 经过体外培养到囊胚后, 分离内细胞团, 建立胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)系, 然后定向诱导成病人所需要的细胞类型(或 经过 遗 传 修 饰 ), 再 移 植 到 病 人体 内 达到 治 疗 的 目 的[1]. 由于移植细胞的遗传物质来自于病人自身, 这 就解决了免疫排斥与移植物来源的重要问题, 因此 治疗性克隆具有巨大的临床应用价值. 在小鼠模型 上, 已经成功建立起具有全能性的核移植胚胎干细 胞(nuclear transfer embryonic stem cell, ntESC)系[2,3].
论文
2008 年 第 53 卷 第 21 期: 2596 ~ 2603
《中国科学》杂志社
SCIENCE IN CHINA PRESS
两性小鼠核移植胚胎干细胞系的建立及其在胚胎 干细胞多能性评估中的研究
范勇①②③, 佟曼②④, 赵春丽②③, 丁晨晖 , ②③ 郝捷②④, 吕卓 , ②④ 代相鹏 , ②④ 海棠②④, 李雪梅②④, 姚汝强②④, 于洋②④, 李赞东①, 王柳②③, ALICE Jouneau③⑤, 周琪②③*
1 材料和方法
(ⅰ) 卵母细胞和供体细胞准备. 8~12 周龄的 杂交一代 B6D2F1 (C57BL/6 × DBA/2)小鼠腹腔注射 孕马血清促性腺激素 10 U (PMSG, 宁波), 48 h 后腹 腔注射人绒毛膜促性腺激素 10 U (hCG, 宁波), 注射 后 13~15 h 断椎法处死小鼠, 迅速取出输卵管, 放入 HEPES-CZB 液体中, 镜下剥离膨大部, 得到卵丘卵 母细胞复合体. 在 300 U/mL 透明质酸酶中悬浮约 2~3 min, 使卵丘细胞分散, 脱掉卵丘细胞的卵母细 胞在 HEPES-CZB 溶液中洗 3 遍后放入 CZB 溶液中于 37℃, 5% CO2 培养箱中培养备用.
两性小鼠心肌成纤维细胞具体培养方法参照文 献[16], 简述如下: 两性小鼠心肌组织剪成 1 mm3 大 小的组织碎块, 按照组织块方法接种, 培养在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液中. 待细胞长满 90%以上 时, 培养液中血清降至 0.5%, 继续培养 3~5 d 后, 胰
蛋白酶消化成单个细胞作为核移植供体. (ⅱ) 核移植和胚胎移植. 重构胚的显微操作按
利用免疫荧光技术检测小鼠 ESC 多能性与特异 标志分子(Oct4, Nanog 和 SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4) 的表达. 培养小鼠 ESC 于四孔板中, 当细胞达到 80%~90%汇合后, 用 PBS 洗细胞 3 次; 然后用 2%多 聚甲醛(PFA)固定细胞, 室温 30 min; 再用 0.5% Triton X-100, 室温渗透 30 min; 2% PBS-BSA 室温封闭 2 h. 一抗孵育: 用 0.5% PBS-BSA 稀释 Oct4, Nanog 抗体(1∶200, Santa Cruz, USA)或者 SSEA-1, SSEA-3,
(ⅵ) 二倍体嵌合小鼠的制备和生殖系嵌合检测. ICR 受精卵体外培养到囊胚, 使用 Pizeo 辅助打孔, 注射针吸入干细胞 8~12 个, 注入到囊胚腔内, 与内 细胞团紧密接触. 将注射了胚胎干细胞的囊胚移植 到 2.5 d 假孕母鼠的子宫内, 17.5 d 后. 出生的动物 一般具有供体和受体两种遗传物质, 经交配后可确 定胚胎干细胞是否进入种系.
尽管治疗性克隆具有很大的应用前景, 但是供 体细胞需要经过细胞重编程的过程, 因此同正常受 精的胚胎或干细胞系相比较, 核移植胚胎或胚胎干 细胞系仍然存在一些表观遗传的差异. 例如, 大部分
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论文
克隆胚胎在植入后死亡, 只有很少一部分胚胎具有 发育到期的能力, 即使出生的克隆动物大多数也存 在异常, 如胎儿过大、胎盘过大、围产期死亡等[10~12]. 同样, 在胚胎干细胞的培养过程中, 很容易出现遗传 或者表观遗传的改变, 进而通过传代的方式保留这 种缺陷模式[13]. 因此, 建立完善的胚胎干细胞的多能 性鉴定标准就显得尤为重要. 由于社会伦理道德的 限制, 人胚胎干细胞只能通过注射 SCID 小鼠的方式 评估干细胞的体内分化能力[14], 但是在小鼠中, 通常 使用生殖系 嵌合的方式 评估小鼠体 内分化能力 [15], 那么在两种评估模式中, 究竟存在怎样的区别还没 有得到清楚的研究. 因此治疗性克隆技术在应用于 临床前还有很多机制和临床应用安全方面的问题需 要解决.
照曾经报道的方法[17]略有改动. 操作如下: 持卵针 吸取卵母细胞, 调整其位置, 使中期纺缍体复合体位 于 4~5 点位置均可, 借助 Piezo 的动力, 用平口针于 3 点位置在透明带上开孔. 然后用注射针抽吸取成纤 维细胞使细胞膜破碎, 穿过透明带上的缺孔把核注 入卵母细胞, 注射完毕吸出卵母细胞的纺缍体复合 物. 重构胚经 HEPES-CZB 溶液洗涤后培养在 CZB 培 养液中 1~3 h, 培养条件为 37℃, 5% CO2 , 饱和湿度. 克隆胚胎培养在含有 10 mmol/L Sr2+和 5 µg/mL 细胞 松驰素 B(cytochalasin B)的无钙 CZB 培养液中激活处 理 6 h.
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2008 年 11 月 第 53 卷 第 21 期
SSEA-4 抗体(1:30, Chemicon International, Temecula CA, USA), 一般每孔加入 200 µL 抗体溶液, 放入 4℃冰箱内孵育过夜, 同时设阴性对照. 次日, 用 PBS 洗涤 2 次, 每次 20 min 或者流水冲洗 1 h; 加入 0.5% PBS-BSA 稀释的二抗, 室温孵育 1 h (避光); 用 PBS 洗 掉 二 抗 , 室 温 避 光 放 置 30 min; 用 PI (Propidium Iodide (10 µg/mL))或 Hoechst33342 复染, 室温孵育 30 min (避光), 然后用 PBS 洗涤 2 次, 每次 10 min; 用激光共聚焦显微镜观察染色结果.
(ⅳ) ntESC 系的鉴定. ESC 多能性鉴定包括碱 性磷酸酶活性(ALP), 免疫荧光染色和拟胚体形成. ALP 鉴定: ntESC 用 2% PFA 或中性福尔马林室温固 定 15~30 min, PBS 洗 3 次, 每次 5 min (或放置室温 15 min), 用 100 mmol/L Tris-HCl (pH 9.5), 100 mmol/L NaCl, 50 mmol/L MgCl2 混合缓冲液洗 5 min, 在 1 mL PBS 加入四氮唑蓝(NBT) (No.N-5514, Sigma) 4.5 µL 和 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)(No.B-0274, Sigma) 3.5 µL, 避光显色 20 min 至 1 h, 随时观察染色情 况[18,19].
这些 ntESC 系或 ESC 系具有相同的体内体外分化能 力[4], 在嵌合体小鼠体内可以分化为精子或卵母细 胞[5], 并且能够改善免疫缺陷或神经退行性疾病的症 状[6~8]. 研究证实, ntESC 分化而来的多巴胺神经元能 够改善帕金森小鼠的症状[9]. Brambrink 等人[2]通过基 因芯片技术证明, ntESC 系和正常受精卵来源的胚胎 干细胞系在基因转录水平和功能上没有差异.
2008-04-27 收稿, 2008-06-20 接受 国家自然科学基金(批准号: 30525040 和 30670229)资助项目
摘要 治疗性克隆的安全性与风险性是阻碍治疗性克隆发展的关键环节之一. 由于受到社会 伦理问题的限制, 人胚胎干细胞的多能性检测只能通过畸胎瘤的方式鉴定, 与传统的小鼠生 殖系嵌合鉴定方式不同. 但是两种多能性检测方式之间的区别还不清楚. 本研究利用遗传突 变两性小鼠心肌成纤维细胞作为核移植供体细胞, 构建核移植胚胎, 经过体外培养获得克隆 囊胚, 建立核移植胚胎干细胞系. 对胚胎干细胞系的鉴定结果表明, 两性小鼠核移植胚胎干 细胞系表达所有小鼠胚胎干细胞系多能性及特异的分子标记, 如碱性磷酸酶活性, Oct4, Nanog, SSEA-1 等, 干细胞注射到免疫缺陷小鼠(SCID)体内能够形成含有三胚层分化附属物 的畸胎瘤组织, 证明两性小鼠核移植胚胎干细胞系具有多能性. 但通过囊胚注射的方式获得 的二倍体嵌合小鼠经过交配不能获得生殖系嵌合的小鼠, 因而两性小鼠核移植胚胎干细胞系 并不具有全能性, 说明体内形成三胚层分化附属物的畸胎瘤组织并不能替代传统的生殖系嵌 合, 提示在人治疗性克隆胚胎干细胞系多能性鉴定中, 仍然需要更多、更严格的标准, 进而最 大程度地降低治疗性克隆临床应用的风险性.
(ⅴ) PCR 分析两性小鼠 Y 染色体特异性基因. 从两性小鼠 ntESC 中提取基因组 DNA, PCR 扩增小 鼠 Y 染色体特异性基因 Sry, Zfy1, Rbmy, Ssty1 和 Ssty2 以及常染色体基因 Myog 和 Gapdh[20,21]. PCR 引物序 列如表 1 所示. 取 PCR 产物做凝胶电泳检测基因表达.
关键词 体细胞核移植 胚胎干细胞 治疗性克隆 两性小鼠
治疗性克隆(therapeutic cloning)是指从病人获得 体细胞, 经过体外培养, 应用核移植技术将供体细胞 核移入去核的卵母细胞中, 经过体外培养到囊胚后, 分离内细胞团, 建立胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)系, 然后定向诱导成病人所需要的细胞类型(或 经过 遗 传 修 饰 ), 再 移 植 到 病 人体 内 达到 治 疗 的 目 的[1]. 由于移植细胞的遗传物质来自于病人自身, 这 就解决了免疫排斥与移植物来源的重要问题, 因此 治疗性克隆具有巨大的临床应用价值. 在小鼠模型 上, 已经成功建立起具有全能性的核移植胚胎干细 胞(nuclear transfer embryonic stem cell, ntESC)系[2,3].
论文
2008 年 第 53 卷 第 21 期: 2596 ~ 2603
《中国科学》杂志社
SCIENCE IN CHINA PRESS
两性小鼠核移植胚胎干细胞系的建立及其在胚胎 干细胞多能性评估中的研究
范勇①②③, 佟曼②④, 赵春丽②③, 丁晨晖 , ②③ 郝捷②④, 吕卓 , ②④ 代相鹏 , ②④ 海棠②④, 李雪梅②④, 姚汝强②④, 于洋②④, 李赞东①, 王柳②③, ALICE Jouneau③⑤, 周琪②③*
1 材料和方法
(ⅰ) 卵母细胞和供体细胞准备. 8~12 周龄的 杂交一代 B6D2F1 (C57BL/6 × DBA/2)小鼠腹腔注射 孕马血清促性腺激素 10 U (PMSG, 宁波), 48 h 后腹 腔注射人绒毛膜促性腺激素 10 U (hCG, 宁波), 注射 后 13~15 h 断椎法处死小鼠, 迅速取出输卵管, 放入 HEPES-CZB 液体中, 镜下剥离膨大部, 得到卵丘卵 母细胞复合体. 在 300 U/mL 透明质酸酶中悬浮约 2~3 min, 使卵丘细胞分散, 脱掉卵丘细胞的卵母细 胞在 HEPES-CZB 溶液中洗 3 遍后放入 CZB 溶液中于 37℃, 5% CO2 培养箱中培养备用.
两性小鼠心肌成纤维细胞具体培养方法参照文 献[16], 简述如下: 两性小鼠心肌组织剪成 1 mm3 大 小的组织碎块, 按照组织块方法接种, 培养在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液中. 待细胞长满 90%以上 时, 培养液中血清降至 0.5%, 继续培养 3~5 d 后, 胰
蛋白酶消化成单个细胞作为核移植供体. (ⅱ) 核移植和胚胎移植. 重构胚的显微操作按
利用免疫荧光技术检测小鼠 ESC 多能性与特异 标志分子(Oct4, Nanog 和 SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4) 的表达. 培养小鼠 ESC 于四孔板中, 当细胞达到 80%~90%汇合后, 用 PBS 洗细胞 3 次; 然后用 2%多 聚甲醛(PFA)固定细胞, 室温 30 min; 再用 0.5% Triton X-100, 室温渗透 30 min; 2% PBS-BSA 室温封闭 2 h. 一抗孵育: 用 0.5% PBS-BSA 稀释 Oct4, Nanog 抗体(1∶200, Santa Cruz, USA)或者 SSEA-1, SSEA-3,
(ⅵ) 二倍体嵌合小鼠的制备和生殖系嵌合检测. ICR 受精卵体外培养到囊胚, 使用 Pizeo 辅助打孔, 注射针吸入干细胞 8~12 个, 注入到囊胚腔内, 与内 细胞团紧密接触. 将注射了胚胎干细胞的囊胚移植 到 2.5 d 假孕母鼠的子宫内, 17.5 d 后. 出生的动物 一般具有供体和受体两种遗传物质, 经交配后可确 定胚胎干细胞是否进入种系.
尽管治疗性克隆具有很大的应用前景, 但是供 体细胞需要经过细胞重编程的过程, 因此同正常受 精的胚胎或干细胞系相比较, 核移植胚胎或胚胎干 细胞系仍然存在一些表观遗传的差异. 例如, 大部分
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克隆胚胎在植入后死亡, 只有很少一部分胚胎具有 发育到期的能力, 即使出生的克隆动物大多数也存 在异常, 如胎儿过大、胎盘过大、围产期死亡等[10~12]. 同样, 在胚胎干细胞的培养过程中, 很容易出现遗传 或者表观遗传的改变, 进而通过传代的方式保留这 种缺陷模式[13]. 因此, 建立完善的胚胎干细胞的多能 性鉴定标准就显得尤为重要. 由于社会伦理道德的 限制, 人胚胎干细胞只能通过注射 SCID 小鼠的方式 评估干细胞的体内分化能力[14], 但是在小鼠中, 通常 使用生殖系 嵌合的方式 评估小鼠体 内分化能力 [15], 那么在两种评估模式中, 究竟存在怎样的区别还没 有得到清楚的研究. 因此治疗性克隆技术在应用于 临床前还有很多机制和临床应用安全方面的问题需 要解决.
照曾经报道的方法[17]略有改动. 操作如下: 持卵针 吸取卵母细胞, 调整其位置, 使中期纺缍体复合体位 于 4~5 点位置均可, 借助 Piezo 的动力, 用平口针于 3 点位置在透明带上开孔. 然后用注射针抽吸取成纤 维细胞使细胞膜破碎, 穿过透明带上的缺孔把核注 入卵母细胞, 注射完毕吸出卵母细胞的纺缍体复合 物. 重构胚经 HEPES-CZB 溶液洗涤后培养在 CZB 培 养液中 1~3 h, 培养条件为 37℃, 5% CO2 , 饱和湿度. 克隆胚胎培养在含有 10 mmol/L Sr2+和 5 µg/mL 细胞 松驰素 B(cytochalasin B)的无钙 CZB 培养液中激活处 理 6 h.
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2008 年 11 月 第 53 卷 第 21 期
SSEA-4 抗体(1:30, Chemicon International, Temecula CA, USA), 一般每孔加入 200 µL 抗体溶液, 放入 4℃冰箱内孵育过夜, 同时设阴性对照. 次日, 用 PBS 洗涤 2 次, 每次 20 min 或者流水冲洗 1 h; 加入 0.5% PBS-BSA 稀释的二抗, 室温孵育 1 h (避光); 用 PBS 洗 掉 二 抗 , 室 温 避 光 放 置 30 min; 用 PI (Propidium Iodide (10 µg/mL))或 Hoechst33342 复染, 室温孵育 30 min (避光), 然后用 PBS 洗涤 2 次, 每次 10 min; 用激光共聚焦显微镜观察染色结果.
(ⅳ) ntESC 系的鉴定. ESC 多能性鉴定包括碱 性磷酸酶活性(ALP), 免疫荧光染色和拟胚体形成. ALP 鉴定: ntESC 用 2% PFA 或中性福尔马林室温固 定 15~30 min, PBS 洗 3 次, 每次 5 min (或放置室温 15 min), 用 100 mmol/L Tris-HCl (pH 9.5), 100 mmol/L NaCl, 50 mmol/L MgCl2 混合缓冲液洗 5 min, 在 1 mL PBS 加入四氮唑蓝(NBT) (No.N-5514, Sigma) 4.5 µL 和 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)(No.B-0274, Sigma) 3.5 µL, 避光显色 20 min 至 1 h, 随时观察染色情 况[18,19].
这些 ntESC 系或 ESC 系具有相同的体内体外分化能 力[4], 在嵌合体小鼠体内可以分化为精子或卵母细 胞[5], 并且能够改善免疫缺陷或神经退行性疾病的症 状[6~8]. 研究证实, ntESC 分化而来的多巴胺神经元能 够改善帕金森小鼠的症状[9]. Brambrink 等人[2]通过基 因芯片技术证明, ntESC 系和正常受精卵来源的胚胎 干细胞系在基因转录水平和功能上没有差异.
2008-04-27 收稿, 2008-06-20 接受 国家自然科学基金(批准号: 30525040 和 30670229)资助项目
摘要 治疗性克隆的安全性与风险性是阻碍治疗性克隆发展的关键环节之一. 由于受到社会 伦理问题的限制, 人胚胎干细胞的多能性检测只能通过畸胎瘤的方式鉴定, 与传统的小鼠生 殖系嵌合鉴定方式不同. 但是两种多能性检测方式之间的区别还不清楚. 本研究利用遗传突 变两性小鼠心肌成纤维细胞作为核移植供体细胞, 构建核移植胚胎, 经过体外培养获得克隆 囊胚, 建立核移植胚胎干细胞系. 对胚胎干细胞系的鉴定结果表明, 两性小鼠核移植胚胎干 细胞系表达所有小鼠胚胎干细胞系多能性及特异的分子标记, 如碱性磷酸酶活性, Oct4, Nanog, SSEA-1 等, 干细胞注射到免疫缺陷小鼠(SCID)体内能够形成含有三胚层分化附属物 的畸胎瘤组织, 证明两性小鼠核移植胚胎干细胞系具有多能性. 但通过囊胚注射的方式获得 的二倍体嵌合小鼠经过交配不能获得生殖系嵌合的小鼠, 因而两性小鼠核移植胚胎干细胞系 并不具有全能性, 说明体内形成三胚层分化附属物的畸胎瘤组织并不能替代传统的生殖系嵌 合, 提示在人治疗性克隆胚胎干细胞系多能性鉴定中, 仍然需要更多、更严格的标准, 进而最 大程度地降低治疗性克隆临床应用的风险性.