葡萄糖氧化酶活力测定(分光度法)

邻联茴香胺分光光度法测定饲料添加剂中葡萄糖氧化酶活力1 引言葡萄糖氧化酶是一种绿色饲料添加剂，在饲料和畜牧生产中可作为抗氧化剂减缓饲料氧化变质[1]，改善动物肠道微生物平衡[2]，提高饲料利用率[3]，促进动物生长，降低中毒反应更在一定程度上替代抗菌药物和抗球虫病药物，具有广泛的应用前景。

由于葡萄糖氧化酶的高度专一性，基于不同的酶活定义而建立的检测方法主要有电化学法、测压法、凝胶电泳法、滴定法、分光光度法和傅立叶变换红外光谱法等[4]。

电化学法、测压法、凝胶电泳法存在方法操作复杂，要求严格，有很强的仪器依赖性；滴定法存在工作量大、样品需要量大、人工读数导致的测量精度低，尤其在混合型饲料添加剂的检测中不能排除酸性、碱性载体干扰的缺点。

傅立叶变换红外光谱法是较新开发的一种检测方法，优点为检测速度快，试剂用量少。

缺点为仪器要求和模型建立需要前期投入太大，限制了其使用范围。

因此寻找一种简便，快捷，灵敏的高的酶活力检测方法很有意义。

本研究采用邻联茴香胺分光光度法测定葡糖糖酶活力。

反应机理为：葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。

在一定的pH、温度、浓度及反应时间内通过测定产物吸光度在460nm 波长下的变化速率定量计算出酶活力。

基本反应式为：β-D-葡萄糖+H20+O2 δ-D-葡萄糖基-1，5-内酯+H2OH2O2+邻联茴香胺氧化型邻联茴香胺+2H2O1实验部分1.1仪器设备北京瑞利仪器XX公司UV-2600型紫外可见分光光度计；北京中兴伟业仪器XX公司DZKW-2型电热恒温水浴锅；赛多利斯科学仪器XX公司BSA224S型分析天平。

1.2实验试剂和材料标示含量为40GODU/g的葡萄糖氧化酶饲料添加剂；辣根过氧化物酶（上海蓝季生物）；邻联茴香胺（sigma，D9143）；磷酸二氢钠（国药试剂）；磷酸氢二钠（国药试剂）；葡萄糖（国药试剂）。

测定葡萄糖氧化酶活力的一种简便方法周建芹 , 陈韶华 , 王剑文( 1. 苏州大学医学部药学院 , 江苏苏州215123; 2. 苏州大学医学部实验中心 , 江苏苏州215123 )摘 : 利用靛蓝胭脂红褪色分光光度法测定葡萄糖氧化酶催化葡萄糖溶液产生的过氧化氢浓度 , 经过标要准曲线转换得到葡萄糖氧化酶的活力。

研究了缓冲液 pH 值、水浴温度、靛蓝胭脂红用量等对葡萄糖氧化酶活力测定的影响。

结果表明 : 利用靛蓝胭脂红褪色分光光度法测定葡萄糖氧化酶活力时 , 缓冲液最佳 pH 值为 4、最佳水浴温度为100 ℃、靛蓝胭脂红最佳用量为 1.3 mL。

此方法的重现性较好 , 反应系统较稳定。

葡萄糖氧化酶在自然界中普遍存在 , 在食品、医药和发酵等工业生产及分析检测中用途广泛 , 是高等院校生物化学、酶学和酶工程等相关实验课程中经常选用的一种重要的模式酶。

在有氧情况下 , 葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化产生葡萄糖酸和过氧化氢 : 葡萄糖 + O2 葡萄糖酸 + H2 O2 。

测定葡萄糖氧化酶活力常用的方法有 2 种。

一种是滴定法 , 即用碱滴定葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产生的葡萄糖酸 , 这种方法误差比较大 , 灵敏度比较低 , 尤其是葡萄糖含量比较低时。

另一种是利用葡萄糖氧化酶—辣根过氧化物酶—苯胺衍生物或染料隐性体偶联反应体系测定。

过氧化物酶在有氧存在时 , 催化葡萄糖氧化、生成的过氧化氢分解 , 分解出的氧又将苯胺衍生物或染料隐性体(如邻 - 联二茴香胺 ) 氧化变成红色或棕色物质 , 颜色深浅与葡萄糖氧化酶活性成线性关系。

这种方法非常灵敏 , 但也存在显色物质不稳定、在 1 m in内有明显褪色、数据重复性不好等不足 , 而且因为要与辣根过氧化物酶联用 , 因此这个方法比较昂贵 , 增加了测定成本。

葡萄糖氧化酶活力测定的困难限制了其在学生实验及课外科研项目中的应用 , 因此寻找一种廉价、简便并且灵敏度高的活力测定方法很有意义。

葡萄糖氧化酶的活力测定实验报告葡萄糖氧化酶酶活测定葡萄糖氧化酶酶活测定1 酶活单位与定义pH6.0、30℃的条件下，每分钟能把 1.0μmol 的β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H2O2 的酶量为一个单位。

2 测定原理葡萄糖和氧反应，在葡萄糖氧化酶的作用下，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下，生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。

3 试剂和溶液3.1 磷酸盐缓冲液（pH6.0）称取16.61g 磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O ）和35.82g 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O），溶于无CO2 的水中，稀释到1000ml。

3.2 邻联茴香胺甲醇缓冲液1g 邻联茴香胺加在100ml 甲醇中搅拌溶解备用。

临用时现配，取0.1ml 加入到上述缓冲液12ml 中混匀。

3.3 180g/l 葡萄糖水溶液18g 葡萄糖加适量水溶解，并定容至100ml。

3.4 0.03%辣根过氧化物酶液称取辣根过氧化物酶（HRP,美国Ameresco 公司）10mg，溶于30ml 蒸馏水。

4 仪器设备721-分光光度计、恒温水浴、秒表5 分析步骤5.1 待测酶样品的处理将待测酶样做适当稀释后进行试验，使得测定△A 值在0.25～0.4。

5.2 测定6 结果表示与计算X=[△A÷（11.3×t×0.1）] ×nt—测定时间，min0.1—样品体积，ml11.3—消光系数n—稀释倍数所得结果表示至整数。

篇二：葡萄糖测定-葡萄糖氧化酶法葡萄糖氧化酶法测定血清（浆）葡萄糖【原理】葡萄糖氧化酶(glucose oxidase ，GOD) 利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢。

过氧化物酶(peroxidase ，POD) 在色原性氧受体存在时将过氧化氢分解为水和氧，并使色原性氧受体4- 氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物，即Trinder 反应。

葡萄糖氧化酶法测定血糖含量【目的】1 ．掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的实验方法。

2 ．熟悉葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的实验原理。

【原理】葡萄糖氧化酶（ GA ）对β-D- 葡萄糖的特异性的很强。

溶液中的葡萄糖有α-D- 葡萄糖和β-D- 葡萄糖两型，二者处于动态平衡。

当β-D- 葡萄糖不断受酶催化而减少时，α-D- 葡萄糖便依靠平衡移动，全部转变为β-D- 葡萄糖参与反应。

GA 催化β-D- 葡萄糖分子中的醛基氧化生成葡萄糖酸和 H 2 O 2 ，后者在过氧化物酶（ PA ）作用下放出氧，其可将色原性氧受体“4- 氨基安替吡啉偶联酚” 的酚氧化，并与 4- 氨基安替吡啉缩合生成红色化合物，其反应如下。

于505nm 与同样处理的标准葡萄溶液比色，可测得葡萄糖含量。

【器材】1 ．分光光度计2 ．恒温水浴3 ．微量加样器4 ．刻度吸量管5 ．中号试管【试剂】1 ． 0.01mol/L pH7.0 磷酸盐缓冲液无水 Na 2 HPO 4 18.5g 和 KH 2 PO 4 5.3g 溶于 800ml 蒸馏水中，用少量 1mol/L 的 NaOH 或 HCl 调 pH 至 7.0 ，再加蒸馏水稀释至 1L 。

2 ．酶试剂取 GA1200 单位、 PA1200 单位， 4- 氨基安替吡啉 10mg 、叠氮钠 100mg ，加上述磷酸盐缓冲液至 80ml 左右，调 pH 至 7.0 ，再加同上缓冲液至 100ml ，混匀。

冰箱内保存可稳定 3 个月。

3 ．酚试剂酚 100mg 溶于 100ml 蒸馏水中。

因酚易在空气中氧化成红色，可先配制成 50g /dl ，贮棕色瓶中，用前稀释。

4 ．酶 - 酚混合试剂将试剂 2 、 3 等量混合。

冰箱内保存可稳定 1 个月。

5 ．葡萄糖标准贮存液（ 20mg/ml ）无水 D- 葡萄糖于80 ℃ 烤箱内干燥恒重，冷却后，称取 2.0g 以 0.25% 苯甲酸溶解、稀释定容至 100ml 。

葡萄糖氧化酶检测的金标准引言葡萄糖氧化酶是一种重要的酶，在临床诊断和生物化学研究中具有广泛的应用价值。

本文将详细探讨葡萄糖氧化酶检测的金标准，包括其定义、检测方法、应用领域和意义等方面的内容。

什么是葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶是一种催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸的酶，它是细胞内氧化磷酸化过程中不可缺少的催化剂。

它能将葡萄糖与辅酶NAD+反应，产生葡萄糖酸和还原型辅酶NADH。

葡萄糖氧化酶可以通过可以通过测定还原型辅酶NADH的生成速率来测定葡萄糖的含量。

葡萄糖氧化酶检测的方法葡萄糖氧化酶检测的方法有很多种，常用的方法包括光度法、荧光法和电化学法等。

这些方法基于葡萄糖氧化酶催化反应生成的还原型辅酶NADH的特性，通过测定还原型辅酶NADH的光学或电化学特性来间接测定葡萄糖的含量。

光度法光度法是一种常用的葡萄糖氧化酶检测方法。

它利用葡萄糖氧化酶催化反应生成的还原型辅酶NADH的吸光度变化来测定葡萄糖的含量。

通常使用紫外光谱法或可见光谱法来测定还原型辅酶NADH的吸光度，然后通过与已知浓度的标准葡萄糖溶液比较来计算未知样品中葡萄糖的含量。

荧光法荧光法是另一种常用的葡萄糖氧化酶检测方法。

它利用葡萄糖氧化酶催化反应生成的还原型辅酶NADH的荧光特性来测定葡萄糖的含量。

通过测定还原型辅酶NADH所发射的荧光强度或荧光寿命来计算葡萄糖的含量。

荧光法具有高灵敏度和高选择性的优点，常用于生物医学研究和药物检测等领域。

电化学法电化学法是葡萄糖氧化酶检测的另一种常用方法。

它利用葡萄糖氧化酶催化反应生成的还原型辅酶NADH的电化学特性来测定葡萄糖的含量。

通过将还原型辅酶NADH 在电极上氧化还原的电流变化来计算葡萄糖的含量。

电化学法具有高灵敏度和高选择性的优点，常用于生物传感器和医学诊断等领域。

葡萄糖氧化酶检测的应用领域葡萄糖氧化酶检测在临床诊断和生物化学研究中具有广泛的应用。

它可以用于血糖监测、糖尿病诊断、食品安全检测和生物传感器等领域。

测定葡萄糖氧化酶活力的一种简便方法
周建芹;陈韶华;王剑文
【期刊名称】《实验技术与管理》
【年(卷),期】2008(025)012
【摘要】利用靛蓝胭脂红褪色分光光度法测定葡萄糖氧化酶催化葡萄糖溶液产生
的过氧化氢浓度,经过标准曲线转换得到葡萄糖氧化酶的活力.研究了缓冲液pH值、水浴温度、靛蓝胭脂红用量等对葡萄糖氧化酶活力测定的影响.结果表明:利用靛蓝
胭脂红褪色分光光度法测定葡萄糖氧化酶活力时,缓冲液最佳pH值为4、最佳水浴温度为100℃、靛蓝胭脂红最佳用量为1.3 mL.此方法的重现性较好,反应系统较稳定.
【总页数】3页(P58-60)
【作者】周建芹;陈韶华;王剑文
【作者单位】苏州大学,医学部药学院,江苏,苏州,215123;苏州大学,医学部实验中心,江苏,苏州,215123;苏州大学,医学部药学院,江苏,苏州,215123
【正文语种】中文
【中图分类】R331
【相关文献】
1.一种检测葡萄糖氧化酶活力的新方法 [J], 任婷月;周万里;张利群;毕春元;李敬龙
2.黑曲霉ZM-8菌株菌丝体中葡萄糖氧化酶活力测定 [J], 马建忠;刘金鸽;王永刚;
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3.小檗碱和黄芩苷对葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量干扰作用研究 [J], 涂秀英;李瑛;魏学鑫;于梅;徐国良;章常华
4.葡萄糖氧化酶法用于测定糖尿病患者口服葡萄糖耐量试验的研究 [J], 左晓红;王文
5.一种检测葡萄糖氧化酶活力的新方法 [J], 惠瑶瑶; 郑斐; 王倩楠; 安贤惠
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葡萄糖底物UV分光光度法是一种用于测定酶活的常见方法。

本文将介绍葡萄糖底物UV分光光度法的原理、步骤及其在生物化学和生物医学研究中的应用。

一、原理1. 葡萄糖酶（也称葡萄糖氧化酶）能够催化葡萄糖与氧气在水溶液中发生氧化反应，生成葡萄糖内酯和过氧化氢。

这个氧化反应是可以通过UV分光光度法测定的。

2. 葡萄糖底物UV分光光度法的原理是通过测定在酶催化下葡萄糖与氧气反应所产生的过氧化氢的浓度变化来间接测定酶的活性。

二、步骤1. 样品处理：将待测样品中的葡萄糖与底物混合，使底物的浓度在一定范围内，以确保底物的过量不会影响酶的活性测定。

2. 加入酶液：将一定量的葡萄糖酶加入混合液中，并在一定温度下孵育一段时间，使酶与底物发生反应。

3. 反应停止：加入一种化学试剂使反应停止，同时转化过氧化氢形成一种有色产物。

4. 测定吸光度：使用紫外-可见分光光度计测定产生的有色产物的吸光度，根据标准曲线计算出反应体系中的过氧化氢的浓度。

5. 计算酶活：根据过氧化氢的浓度变化和所加的酶的蛋白质含量等数据，计算出酶的活性。

三、应用1. 生物化学研究中的应用：葡萄糖底物UV分光光度法广泛应用于酶动力学研究中，可以用来测定各种酶的活性及其对底物的亲和力。

2. 生物医学研究中的应用：在生物医学研究中，葡萄糖底物UV分光光度法可以用来研究酶与疾病的关联性，例如糖尿病患者血清中的葡萄糖酶活性与血糖水平的关系。

结论葡萄糖底物UV分光光度法是一种简单、敏感、精确的酶活测定方法，具有广泛的应用前景和重要的科研意义。

通过对葡萄糖底物UV分光光度法的原理、步骤及应用进行了解和掌握，可以更好地指导实验操作并推动生物化学和生物医学领域的研究进展。

近年来，随着生物技术的不断发展，葡萄糖底物UV分光光度法在生物医学研究中的应用越发广泛。

除了用于酶动力学研究和疾病相关性分析外，葡萄糖底物UV分光光度法还在其他领域展现出了巨大的潜力。

1. 新药研发在新药研发过程中，葡萄糖底物UV分光光度法被用于筛选潜在的药物候选化合物。