纯泰GST(GSH)亲和层析介质使用说明书

人谷胱甘肽（GSH）酶联免疫分析试剂盒使用说明书厦门慧嘉生物科技有限公司本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中谷胱甘肽（GSH）的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人谷胱甘肽（GSH）水平。

用纯化的人谷胱甘肽（GSH）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入谷胱甘肽（GSH），再与HRP标记的谷胱甘肽（GSH）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽（GSH）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人谷胱甘肽（GSH）的含量。

样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。

通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。

加入一定量的PBS，PH7.4。

用液氮迅速冷冻保存备用。

标本融化后仍然保持2-8℃的温度。

加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。

谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B （GST 标签纯化树脂）说明书货号：P2020规格：5mL/10mL/25mL/50mL保存：4℃保存，有效期至少一年。

产品简介：pGEX 载体表达的外源蛋白与谷胱甘肽S-转移酶融合，因此可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。

GSTs 是一类以谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）作为底物，通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。

由于GST 对底物的亲和力是亚毫摩尔级的，因此谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST 及其融合蛋白的纯化效率很高。

可以用含游离谷胱甘肽的缓冲液洗脱结合GST 融合蛋白。

树脂用3mol/L NaCl 的缓冲液再生。

谷胱甘肽琼脂糖对GST 融合蛋白的结合能力很强（每毫升柱床体积的树脂能结合8毫克融合蛋白）。

特性:粒度：45-165µm流速：75cm/h 工作PH ：4-10耐压：0.3Mpa载量：＞5mg 谷胱甘肽S-转移酶使用说明：谷胱甘肽树脂的处理:1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆。

2.取部分匀浆放入15mL 聚丙烯管（每100mL 细菌培养物大约需要2mL 匀浆）。

3.4℃500g 离心5分钟，小心去掉上清。

4.在树脂中加入10倍柱床体积预冷的PBS ，颠倒数次混匀，4℃500g 离心5分钟，小心去掉上清。

5.每毫升树脂加入1毫升冷的PBS ，制成50%匀浆，颠倒数次，混合均匀，悬液冰上放置待用。

制备细胞抽提物：6.每100毫升培养物的细胞沉淀重悬于4mL PBS 缓冲液中。

7.加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL,冰上放置30分钟。

8.用针筒将10mL 浓度为0.2%的TritonX-100强行注入黏稠的细胞裂解物中，剧烈振动数次混匀。

加入DNase 和RNase 至终浓度5ug/mL,4℃振动温育10分钟，4℃3000g 离心30分钟，去除不溶性细胞碎片，上清转移到一只新管中，加入DTT 至终浓度1mmol/L 。

GST蛋白纯化简介谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）是一种常用的亲和标签，用于在分子生物学研究中用于蛋白质纯化和蛋白质亲和结合实验。

GST蛋白被广泛应用于蛋白质结构和功能研究、酶学研究、蛋白质互作研究等领域。

本文将介绍一种常见的方法来纯化GST蛋白，该方法主要包括以下步骤：细胞裂解、亲和层析、洗脱和纯化。

方法细胞裂解首先需要将GST蛋白表达在适当的宿主中，例如大肠杆菌。

在细胞达到适当的生长阶段后，使用合适的方法将细胞裂解，使得目标蛋白释放到溶液中。

一种常用的裂解方法是超声波裂解，通过超声波震荡将细胞破碎。

亲和层析经过细胞裂解后，将得到的细胞裂解液通过亲和层析柱。

亲和层析柱通常使用含有还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）结合物质的树脂，例如glutathione agarose beads。

这种树脂与GST标签结合，使得GST标签的融合蛋白能够特异性地结合于柱子上。

通过洗脱液去除非特异结合蛋白，将目标蛋白纯化。

洗脱洗脱过程是将结合于柱子上的目标蛋白从固定相洗净。

一般采用含有高浓度还原型谷胱甘肽的洗脱液，例如50 mM GSH。

洗脱液中的还原型谷胱甘肽与柱子上的结合物质竞争与GST标签结合，以此达到将GST蛋白洗脱下来。

纯化经过洗脱后，蛋白溶液中的GST蛋白含量较高。

为了进一步提高纯度，可以通过对溶液进行浓缩、去除低分子量杂质、调整溶液pH值等方法进行纯化。

常用的纯化方法包括丙酮沉淀法、离子交换柱层析法等。

注意事项•在实验过程中应严格操作，避免任何可能导致目标蛋白污染的情况发生。

•选择合适的表达宿主，不同的宿主可能会对GST蛋白的表达量和可溶性产生影响。

•在细胞裂解过程中，避免样品受到温度、剧烈振荡等因素的影响。

•注意亲和层析柱的操作方法，避免破损或污染。

•洗脱过程中注意还原型谷胱甘肽浓度和洗脱液的pH 值。

结论GST蛋白纯化是一种常见的蛋白质纯化方法，通过亲和层析技术可以实现对GST蛋白的高效纯化。

GST亲和层析介质使用说明书一、简介GST亲和层析介质（GST Agarose）是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。

本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶，具有优良的物理和化学稳定性，使用寿命长，操作方便，批次重复性好，易于放大，是研发与生产的理想选择。

二、性能参数三、适用范围分离谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。

四、操作说明1. 缓冲液配制缓冲液A（平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，调节pH值至8.0。

缓冲液B（洗脱缓冲液）：10mM Glutathione（还原型），50mM Tris-HCl，调节pH值至8.0。

因Glutathione易氧化，需现用现配。

（注：各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45 μm滤膜过滤备用)。

2. 样品预处理：按每克湿重菌体/2~5ml平衡缓冲液的比例充分悬浮离心收集的菌体；600w功率，每循环超声3s，冷却3s，循环99×3次,破碎菌体；4℃、15000rpm离心15m，收集上清液，或用0.45μm滤膜过滤。

3. 装柱：聚苯乙烯层析柱1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。

2) 打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。

3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片与介质接触面滞留气泡（如对实验结果要求不严，也可不放入上垫片，以提高流速）。

三．GST融合蛋白纯化（1）GST亲和纯化1．介质保存：20％乙醇2．所需试剂：①10×PBS（1L）：pH7.4 (4℃)150mM NaCl（87.75g），16mMNa2HPO4(57.3g)，4mM NaH2PO4(6.24g)②10×洗脱前buffer（100ml）：pH8.0 (25℃)50mM Tris（6.1g），100mM NaCl(5.8g)③洗脱buffer即凝血酶酶切buffer(500ml)：pH10.0 (25℃)加入谷胱甘肽后pH变为8.050mM Tris（3.035g），100mM NaCl(2.925g)洗脱前加1M CaCl2至终浓度2.5mM，加还原型谷胱甘肽（干粉）至终浓度20mM也有文献使用谷胱甘肽终浓度为10mM，未对比过。

8ml介质结合的融合蛋白一般用30ml洗脱buffer（加75μl CaCl2和0.12g还原型谷胱甘肽）④3M NaCl3．纯化步骤及注意事项：①PBS平衡柱子：至少5个柱体积②上样：经对比发现，上样流速需极慢才能结合，一般上样过夜（纯化原理是谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白对谷胱甘肽的亲和力）③PBS洗杂蛋白：洗到紫外监测基线平，至少1小时，时间充分的话最好用较慢流速洗2到3小时，这样洗脱下来的目的蛋白中杂蛋白较少。

④洗脱前buffer换体系：至少2个柱体积，8ml介质一般用20ml⑤洗脱buffer洗脱蛋白：洗脱速度很快，一般第2、3管浓度最大，注意收峰⑥3M NaCl再生柱子：一般会洗出一个小盐峰，再生时间不可过长，否则对柱子有伤害，5个柱体积即可（2）凝血酶酶切融合蛋白（以NGB为例）先后使用过sigma和鼎国的凝血酶，sigma的酶效率更高。

鼎国凝血酶买来为干粉，3000U每管，溶于1ml凝血酶酶切buffer（补1M CaCl2至终浓度2.5mM），分装至每管10μl共100管，30U/管。

合并GST柱下来的目的蛋白，紫外分光光度计OD595测蛋白浓度。

cytivagst亲和层析柱中文说明书CyTiva GST亲和层析柱是一种常用的色谱柱，用于蛋白质的纯化和分离。

亲和层析是一种基于蛋白质与特定配体之间的非共价相互作用而进行的纯化方法。

本文将详细介绍CyTiva GST亲和层析柱的原理、优点、使用方法和注意事项。

一、原理CyTiva GST亲和层析柱采用谷氨酸-S-转移酶(Glutathione-S-Transferase，GST)作为亲和配体。

GST是从谷胱甘肽(glutathione)中分离得到的一种蛋白质。

该配体与GST融合的蛋白质有很高的亲和力，可被其特异性地捕获。

在层析过程中，样品与柱填料表面的GST结合形成复合物。

通过洗脱缓冲液中pH、盐浓度或添加特定配体等的调节，使复合物分离并得到目标蛋白质。

二、优点1.高选择性：CyTiva GST亲和层析柱具有很高的选择性，可以高效地分离和纯化GST融合的目标蛋白质。

2.高纯度：层析过程中，非特异性结合蛋白质可被洗脱掉，从而得到高纯度的目标蛋白质。

三、使用方法1.准备工作：柱前洗脱，根据柱填料要求进行预处理。

2.样品处理：目标蛋白质表达并纯化后，与GST融合的载体进行融合。

此后，将样品溶液等体积注入已平衡的柱中。

3.洗脱条件的选择：根据样品的属性，选择适宜的洗脱缓冲液，进行洗脱。

可以按照pH、盐浓度、添加特定配体等来调节洗脱条件。

4.目标蛋白质洗脱：将目标蛋白质从柱中洗脱出来，收集洗脱液。

四、注意事项1.样品的处理：目标蛋白质应表达和纯化得到GST融合蛋白质。

2.柱前处理：根据柱填料的要求，进行柱前洗脱处理。

3.洗脱缓冲液的调节：根据样品的特性和所需的洗脱条件进行调节。

常用的洗脱条件包括调节pH、盐浓度、添加特定配体等。

4.洗脱收集：在洗脱过程中，及时收集洗脱液。

总结：CyTiva GST亲和层析柱是一种常用的蛋白质纯化和分离工具，基于GST与目标蛋白质的非共价相互作用。

它具有高选择性和高纯度的优点，可广泛应用于生物医药研究领域。

亲和层析纯化可溶性GST标签重组蛋白的标准操作规程（编号：069）1、目的及适用范围利用GST亲和层析纯化体外表达的带有His标签的可溶性重组蛋白。

2、主要仪器GST柱、真空抽滤泵、超声破碎仪、冷冻离心机3、主要试剂3.1 Binding Buffer：1×PBS3.2 Elution Buffer：20-50mM还原型谷胱甘肽3.3 高pH值缓冲溶液：0.1M Tris，0.5M NaCl，pH 8.53.4 低pH值缓冲溶液：0.1M 醋酸钠，0.5M NaCl，pH4.54、GST柱的预处理用5个柱体积的1×PBS缓冲溶液平衡柱子5、操作步骤5.1蛋白的纯化5.1.1大肠杆菌诱导表达目的蛋白；5.1.2 4500rpm，离心10-15min，弃上清，收集菌体；5.1.3 将收集的菌体用1×PBS重悬，8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体；5.1.4 将菌体用1×PBS重悬，超声破碎菌体；5.1.5 4℃，12000rpm，离心15min，收集超声后上清；6.1.6 将收集的上清加入GST柱子中，4℃结合2h；5.1.7 流出穿透液；5.1.8 用20-30个柱体积的1×PBS冲洗柱子，除去非特异性结合的杂蛋白；5.1.9 用1-3个柱体积的Elution Buffer洗脱目的蛋白；5.1.10将诱导前全菌，诱导后全菌，穿透，洗脱样品进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。

5.2 柱子的再生5.2.1 用3个柱体积的高pH缓冲溶液冲洗柱子；5.2.2 用3个柱体积的低pH缓冲溶液冲洗柱子；141。

gst亲和层析步骤GST（谷胱甘肽S-转移酶）亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，它基于谷胱甘肽S-转移酶与谷胱甘肽结合的高亲和力，可用于纯化含有GST标签的蛋白质。

第一部分：材料准备在进行GST亲和层析之前，需要准备一些实验材料。

以下是常见的实验材料列表：1. 细菌表达系统：常用的细菌表达系统包括大肠杆菌（E. coli）和酵母菌等。

选择适当的表达系统，并确保表达系统中含有GST融合蛋白的基因。

2. 培养基和抗生素：根据表达系统的需求，准备适当的培养基，并添加相应的抗生素以选择含有GST融合蛋白的菌落。

3. 细胞破碎缓冲液：根据实验需求选择适当的细胞破碎缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）或Tris缓冲液，并添加辅助试剂如EDTA（乙二胺四乙酸）和PMSF （苯甲磺酰氟）等。

4. 融合蛋白纯化缓冲液：准备一系列用于融合蛋白纯化的缓冲液，包括洗脱缓冲液、结合缓冲液、平衡缓冲液等。

常用的缓冲液成分包括PBS、NaCl（氯化钠）、DTT（二硫苏糖醇）和Tween-20等。

5. GST树脂：选择合适的GST亲和树脂，如GST-Sepharose或Glutathione Agarose等。

6. 色谱柱：选择合适的色谱柱，如预装的柱子或自制的柱子，并进行消毒和平衡。

7. 蛋白质测定试剂盒：用于测定蛋白质的浓度，如BCA（双硫苏糖酸）蛋白定量试剂盒。

第二部分：GST融合蛋白的表达和纯化1. 转化细菌：将含有GST融合蛋白基因的质粒DNA转化到表达宿主细胞中，如E. coli。

通过热激冷冻法、电穿孔法或化学法等方法将质粒DNA导入细菌细胞内。

2. 培养细菌：将转化后的细菌菌落接种到含有适当抗生素的培养基中，并在适当的条件下培养细菌，如温度、pH值和搅拌速度等。

3. 蛋白表达诱导：当细菌培养达到适当的生长阶段时，添加适当浓度的诱导剂，如IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷），以诱导GST融合蛋白的表达。

4. 细胞收获：在蛋白表达诱导后一定时间，收集细菌细胞。

亲和柱层析操作规程（可溶性蛋白）1.装柱：1.1 取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子；1.2用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水；1.3取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，1.4用去离子水冲洗填料5个柱体积；2.柱的平衡与上样：2.1用0.02M PB bufferA 缓冲液(PH8.0)平衡Ni柱，直至流出液的pH为8.0；2.2对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合；3洗杂蛋白：3.1用0.02M PB bufferA 缓冲液(PH8.0)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含5mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含5mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.3用含10mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.4用含20mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.5用含40mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含40mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.6用含50mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含50mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含100mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）4解离目的蛋白：4.1用含100mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.2 用含200mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含200mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.3 用含500mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含500mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.4用含1000mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含1000mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul 做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）5.柱的清洗与保存：5.1用含500mM咪唑的缓冲液A（pH8.0）以冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.2用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.3用过滤去离子水冲洗50ml；5.4用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910386178.7(22)申请日 2019.05.09(71)申请人 武汉菲恩生物科技有限公司地址 430206 湖北省武汉市东湖高新技术开发区高新大道666号武汉国家生物产业基地项目B、C、D区研发楼B1栋(72)发明人 董垚　(74)专利代理机构 北京汇泽知识产权代理有限公司 11228代理人 张涛(51)Int.Cl.B01J 20/286(2006.01)C12N 9/10(2006.01)B01D 15/38(2006.01)B01J 20/30(2006.01)(54)发明名称一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质及其制备方法和应用(57)摘要本发明属于GST -tag融合蛋白纯化技术领域，涉及一种纯化GST -tag融合蛋白的GSH亲和层析介质，由表面修饰有溴化氰的层析介质和还原型谷胱甘肽通过对氨基化合物和马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物作为连接臂连接而成。

本发明还提供一种纯化GST -tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的制备方法，通过溴化氰活化后的层析介质经对氨基化合物修饰后，再采用马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物进行修饰，最后通过偶联还原型谷胱甘肽形成GSH亲和层析介质。

采用上述制备方法制得的GSH亲和层析介质用于纯化GST -tag融合蛋白。

本发明通过氨基化修饰再偶联马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物合成了高载量、高回收率、制作便捷的GSH亲和层析介质，能够广泛的运用于GST -tag标签融合蛋白的分离和纯化工程。

权利要求书2页 说明书8页 附图2页CN 110090635 A 2019.08.06C N 110090635A权　利　要　求　书1/2页CN 110090635 A1.一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质，其特征在于：是由表面修饰有溴化氰的层析介质和能特异性结合GST-tag融合蛋白的还原型谷胱甘肽连接而成，所述表面修饰有溴化氰的层析介质和所述还原型谷胱甘肽通过对氨基化合物和马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物作为连接臂进行连接；所述层析介质为琼脂糖微球或磁珠；所述对氨基化合物为尿素、乙二胺、丁二胺、己二胺、戊二胺、辛二胺、二氨基癸烷、二氨基十二烷中的任意一种；所述马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物为11-马来酰亚胺基十一烷酸琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺 PEG N-羟基琥珀酰亚胺。

FriendBio,Your Trusted Friend in Scientic research！
GST融合蛋白柱上酶切
1. 试剂准备
缓冲液A（平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，调节pH 值至8.0
缓冲液B（洗脱缓冲液）：10mM Glutathione（还原型），50mM Tris-HCl，调节pH值至8.0。

因Glutathione 易氧化，需现用现配
2. 层析柱准备
2.1. 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm 的去离子水
2.2. 将GST亲和树脂悬浮，取2ml加入层析柱中，连接上恒流泵
2.3. 用5倍柱体积的缓冲液A进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用
3.柱上酶切
3.1. 裂解菌体，充分离心后收集上清
3.2. 取上清加入层析柱，置于旋转培养器上，室温孵育1h，收集流出液，留样待检
3.4. 用5倍柱体积的缓冲液A进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液，留样待检
3.5. 向层析柱中添加适量3C酶，并添加适量体积的缓冲液A，室温下进行柱上酶切~3h
3.6. 分别收集流穿和3倍柱体积缓冲液B清洗的洗脱产物，SDS-PAGE分析结果
3.7. 取上一步骤得到的流穿于新的GST亲和树脂再次进行GST亲和层析，收集流穿，即为酶切后的目的蛋白组分
3.8. 将纯化过程中得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分等）以及原始样品使用
SDS-PAGE 检测纯化及酶切效果
详细步骤可参照GST亲和层析介质使用说明书。

谷胱甘肽亲和层析谷胱甘肽亲和层析（Glutathione Affinity Chromatography）引言：谷胱甘肽（Glutathione，简称GSH）是一种三肽，由谷氨酸（glutamic acid）、半胱氨酸（cysteine）和甘氨酸（glycine）组成。

作为重要的抗氧化剂和细胞内还原剂，谷胱甘肽在细胞内起着重要的生理功能。

谷胱甘肽亲和层析是一种常用的蛋白质纯化方法，利用谷胱甘肽与其结合的特异性，实现对目标蛋白的富集和纯化。

一、谷胱甘肽亲和层析原理谷胱甘肽亲和层析基于谷胱甘肽与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）之间的特异性结合。

GST是一种广泛存在于真核生物和原核生物中的酶，可催化谷胱甘肽与多种底物之间的转移反应。

利用GST与谷胱甘肽的结合特性，可以构建谷胱甘肽亲和层析柱，将GST标记的蛋白与目标蛋白结合，并通过洗脱步骤将目标蛋白从柱上洗脱得到纯化的目标蛋白。

1.构建谷胱甘肽亲和层析柱将GST基因克隆到表达载体中，并在其N-或C-末端加入适当的标签，如His标签或Flag标签，以便于后续的检测和纯化。

然后，将重组的GST融合蛋白表达于适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。

细胞经诱导表达后，收获细胞并通过超声波破碎等方法裂解细胞获得细胞裂解液。

接下来，使用谷胱甘肽亲和树脂将目标蛋白与GST融合蛋白结合，通过洗脱步骤将目标蛋白从树脂上洗脱得到纯化的目标蛋白。

2.样品加载与洗脱将裂解液或其它蛋白样品加载到谷胱甘肽亲和层析柱中，目标蛋白与GST融合蛋白结合。

然后，使用洗脱缓冲液进行洗脱，去除非特异性结合的蛋白质。

最后，使用洗脱缓冲液中的高浓度谷胱甘肽竞争结合位点，将目标蛋白从树脂上洗脱得到纯化的目标蛋白。

3.纯化目标蛋白通过洗脱步骤，将目标蛋白从谷胱甘肽亲和层析柱上洗脱得到纯化的目标蛋白。

可以通过检测目标蛋白的光谱特性、活性测定或Western blot等方法确认目标蛋白的纯度和活性。

三、谷胱甘肽亲和层析的应用谷胱甘肽亲和层析广泛应用于蛋白质纯化领域，特别适用于GST标记的重组蛋白的纯化。

GST标记蛋白质微量纯化试剂盒编号名称北京华越洋生物GT172 GST标记蛋白质微量纯化试剂盒GST标记蛋白质微量纯化试剂盒简介：重组蛋白N 端的GST 谷胱甘肽S 转移酶（Glutathione S Transferase）能提高重组蛋白的水溶性，所以常用于蛋白质重组表达。

GST-谷胱甘肽亲和层析是利用GST 标记的蛋白能与谷胱甘肽层析介质结合，并能被还原型谷胱甘肽洗脱的特点而建立，是目前分离纯化GST 标记蛋白质的重要方法。

GST标记蛋白质微量纯化试剂盒规格：成分规格20T 保存条件谷胱甘肽-Agarose 介质，50% 4 ml 4℃10×PBS 缓冲液100 ml RTGST 洗脱缓冲液成分一25 ml RTGST 洗脱缓冲液成分二约80 mg 4℃溶菌酶（20 KU/mg）30 mg -20℃Benzonase（2U/ul）20 ul -20℃PMSF（10 mg/ml）0.5 ml RT6 mL 层析柱(带筛板) 1 套RTGST标记蛋白质微量纯化试剂盒使用方法：注意：1. 每步得到的样品最好都留存少量作为SDS-PAGE 分析的对照，在下面描述中就不再提醒。

2. GST标记蛋白质微量纯化试剂盒实验需要用到的1×PBS 缓冲液可用自备的超纯水稀释本试剂盒提供10×PBS 缓冲液而得。

PBS 缓冲液用超纯水稀释后极其容易长细菌，注意防止污染。

3. GST 洗脱液的配制方法是将约80mg GST 洗脱液成分二干粉全部加入到GST 洗脱液成分一溶液中，摇晃直到干粉全部溶解即得GST 洗脱液，分装成小份放-20℃保存，每次用一管。

一:重组蛋白的表达和细菌收集1. 37℃振荡培养20 mL含表达质粒的细菌到OD600=0.6-0.8。

2. 加IPTG 到终浓度为0.1 mM，30℃振荡培养3 小时或22℃振荡培养8 小时（或过夜）。

3. 4℃ 5000 g 离心10 分钟收集20 mL表达菌液，弃上清。