下载文档原格式
丝状真菌（霉菌）分离筛选方法霉菌生长在偏酸性有机质丰富的环境中，种类多，形态各异，细胞结构多样。
霉菌是一些丝状真菌统称，同酵母菌一样不是分类学的名词。
一.丝状真菌（霉菌）分离筛选1.培养基：1.1 PDA 培养基： 马铃薯一葡萄糖培养基（同酵母）并添加80%乳酸数滴（5mL/L ）或0.05 %去氧胆酸钠以抑制细菌生长，葡萄糖改为蔗糖。
注：土壤适于马丁或马玲薯一葡萄糖培养基 ，河泥 霉变材料 生物膜适用于查氏 马丁培养基或PDA 培养基1.2 察氏培养基：蔗糖30g/L FeSO 4 0.01g/L NaNO 32.0g/L MgSO 4 0.5g/L KC1 0.5g/L K 2HPO 4 1.0g/L PH6.7-7.01.3马丁培养基： 葡萄糖10g/L 蛋白胨5g/L KH 2PO 41g/L MgSO 40.5g/L 孟加拉红（0.1%）3.3mL 灭菌后使用前加入。
临用时每升培养基加入 1.0%链霉素 3.0mL PH 自然。
1.4特定培养基：橘皮培养青霉 甜酒曲培养根霉。
2.分离纯化：混菌和涂布法将样品梯度稀释（10-4、10-5、10-6），混菌和涂布于平板，25-28℃倒置培养3-7d ， 挑取不同典型单菌落孢子或菌丝进行反复划线纯化。
据菌落质地、颜色是否纯培养物，若有杂菌重复纯化一次。
对于形成固定菌落的（青霉 曲霉等）可用稀释平板混菌法分离纯化，菌落不定型蔓延繁殖的（根霉 毛霉），两菌落及易接触混杂，分离时采取较高稀释度或以培养16-24h 内生长菌丝接种。
根霉菌分离筛选：属于毛霉目，蔓延繁殖，没有一定的菌落形态，易与其他霉菌混生，故分离时采取大稀释度，早移植，可在培养基添加0.1℅去氧胆酸钠，防止蔓延。
可利用形态特征鉴别。
样品：酒药 培养基：葡萄糖豆芽汁培养基（豆芽汁100mL ，酵母膏2g 葡萄糖3g PH 自然。
豆芽汁制备：黄豆100g ，加水1000mL ，煮30-40min ，取汁备用）。
临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求【专家共识】近年来侵袭性真菌感染呈持续增多趋势，准确、早期诊断是治疗疾病的关键。
然而，目前我国临床实验室真菌检测能力离临床诊治需求尚有较大差距，亟待改进。
国家卫生计生委办公厅于2016年底发布了《关于提高二级以上综合医院细菌真菌感染诊疗能力的通知》（国卫办医函[2016]1281号），要求在2020年以前加强临床细菌真菌感染诊疗体系的建设，促进抗菌药物的合理应用，维护人民群众健康。
本共识的制定旨在建立临床微生物实验室真菌检测能力基本要求，推动真菌检测技术的普及和人员能力的提升，从而提高综合医院真菌感染诊疗能力。
一、术语和定义（一）酵母菌单细胞真菌呈圆形或卵圆形，以出芽方式繁殖，称为酵母菌（yeast）。
临床致病的酵母菌主要包括念珠菌、隐球菌、毛孢子菌等。
（二）丝状真菌多细胞真菌有菌丝和孢子，菌丝延长分枝，交织成团，称为丝状真菌（filamentous fungi）。
又称霉菌（mold）。
临床重要的丝状真菌包括曲霉菌、毛霉菌、镰刀菌等。
（三）双相型真菌有些真菌可因环境条件（如营养、温度、氧气等）改变，由一种形态转变为另一种形态，称为双相型真菌（dimorphic fungi），如球孢子菌、组织胞浆菌、芽生菌、孢子丝菌、马尔尼菲篮状菌等。
这些真菌在体内或在含动物蛋白的培养基上，37 ℃培养时呈酵母相；而在普通培养基，25 ℃培养时呈霉菌相。
二、环境和设施要求真菌实验室环境和设施的设计应确保实验的质量和生物安全。
（一）环境要求真菌实验室应与细菌、病毒等实验室区分，以防发生交叉污染。
其面积以满足工作和安全要求为宜，合理布局。
在建设实验室或开展实验活动之前，应进行生物危害评估。
（二）基本设施设置防飞虫纱窗和门禁，有充足的照明、应急灯、通风、供水、供电、紧急疏散标识及信息系统，工作区设有洗手池、应急淋浴和洗眼装置；门外有生物安全级别标识[1]。
配置生物安全柜和不同温度培养箱（至少包括25~30 ℃以及35~37 ℃）。
丝状真菌的快速鉴定及药敏试验彭阳;许超;王玉月;何彩珍;许昕;毛易捷;史伟峰【摘要】Objective To evaluate the application of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) technology in the identification of filamentous fungi,and analyze the susceptibility of filamentous fungi to commonly used antibiotics.Methods A total of 100 strains of filamentous fungi were collected and identified rapidly by MALDI-TOF MS.The obtained results were compared with those from microscopic examination.The susceptibility of filamentous fungi was detected by the Etest method.Results Among 100 strains of filamentous fungi identified by MALDI-TOF MS,61 reached to the specieslevel(score≥2.000),36 to the genus level(score between 1.700 and1.999),and 3 failed to be identified (score ＜ 1.700).There was inconsistent results for one strain of filamentous fungi between MALDI-TOF MS and microscopic examination.The MIC90 of amphotericin B against Epidermophytonfloccosum was 0.19 μg/mL,while that against Aspergillus flavus wa s above 32 μg/mL.The MIC90 of itraconazole against Trichophyton tonsurans,Microsporum canis and Epidermophytonfloccosum were all below 0.38 μg/mL,while that against Aspergillus niger was above 32 μg/mL.The MIC90 of fluconazol were above 256 μg/mL for most of strains.The MIC90 of voriconazole and caspofungin against Aspergillus fumigatus,Aspergillus flavus,Aspergillusniger,Trichophyton rubrum,Trichophyton tonsurans and Microsporumcanis were ≤0.38 μg/mL and ≤ 1 μg/mL,respectively.Conclusion The MALDI-TOF MS technology may be used to identify the filamentous fungi isolated from clinical specimens quickly,accurately and high-throughput.Voriconazole and caspofungin have effective anti-filamentous fungi activity.%目的评估基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术在丝状真菌鉴定中的作用,分析常用抗菌药物对丝状真菌的药敏试验结果.方法收集100株丝状真菌,采用MALDI-TOF MS进行快速鉴定,并与显微镜检查结果进行比对;用E-test法进行丝状真菌药敏试验.结果 MALDI-TOF MS对100株丝状真菌鉴定达到种鉴定水平的有61株(得分≥2.000),达到属鉴定水平的有36株(1.700～1.999),未能鉴定的有3株(＜1.700);与镜检结果不一致的有1株.两性霉素B对絮状表皮癣菌的90％最低抑菌浓度(MIC90)为0.19 μg/mL,而对黄曲霉的MIC90＞32 μg/mL.伊曲康唑对断发毛癣菌、犬小孢子菌和絮状表皮癣菌的MIC90均＜0.38 μg/mL,而对黑曲霉的MIC90＞32 μg/mL.氟康唑对大部分受试菌株的MIC90均＞256μg/mL.伏立康唑和卡泊芬净对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、红色毛癣菌、断发毛癣菌和犬小孢子菌的MIC90分别≤0.38μg/mL和≤1μg/mL.结论 MALDI-TOF MS技术可快速、准确、高通量检测临床分离的丝状真菌.伏立康唑和卡泊芬净对丝状真菌具有较好的抗菌活性.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2017(035)007【总页数】5页(P486-490)【关键词】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱;丝状真菌;真菌药敏试验【作者】彭阳;许超;王玉月;何彩珍;许昕;毛易捷;史伟峰【作者单位】苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003【正文语种】中文【中图分类】R446.5近年来，由于器官移植、免疫抑制剂使用、侵入性治疗、恶性肿瘤、HIV感染等患者逐年增多，以及广谱抗菌药物的广泛应用，丝状真菌的感染比例呈上升趋势。
真菌学实验报告一.实验目的：1.1了解真菌形态的基本特征。
1.2掌握丝状真菌制片方法。
1.3掌握内生真菌的分离方法1.4掌握真菌的鉴定方法。
二.前言：真菌广泛分布于地球表面,从高山、湖泊到田野、森林，从海洋、高空到赤道、两极，到处都有真菌。
真菌虽然不在空气中生长繁殖，但它的孢子却成群的漂浮在天空，只要稍微注意你会发现人类原来生活在真菌的汪洋大海中。
当今世界，生物技术已迈入世界经济的支柱产业，真菌学在生物技术的大潮中得到了长足的发展。
真菌是原始的真核生物，具有广泛的多样性，真菌生长我繁殖迅速，在很短的时间内就可以得到比动物和植物多得多的后代，能够直接、快速地进行遗传性状分离的分析。
因此，真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具，真菌基因的多样性以及真菌分子生物学的发展，为生物技术产业提供了一个广阔的天地。
植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，植物物种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富：抗病原性能越强的植物，其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和G+、G-细菌的抑制实验发现茎，根，花，种子或果实内生真菌的代谢产物具有不同程度的抑菌能力，并且对G+、G-有普片遍的抑菌作用。
研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性物质具有广泛的应用前景。
三.材料与方法：3.1.1材料：在校园内采集银杏、喜树、桂花树样品包括叶、茎、根、花、种子或果实。
3.1.2.药品与试剂：葡萄糖、蛋白胨、KH2P04·3H2O、MgSO4·7H2O，马铃薯、琼脂。
孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。
消毒剂：75%的乙醇，0.1%升汞（HgCl2），次氯酸钠溶液（含活性氯10%），30%双氧水。
双蒸水、琼脂糖，Tris饱和酚、巯基乙醇(β- Mercaptoethanol)，石英砂，Tris饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化钠，盐酸，氢氧化钠，EDTA，CTAB。
微生物的个体生长：指细胞物质有规律地、不可逆地增加，导致细胞体积扩大的生物学过程。
繁殖：引起生命个体数量增加的生物学过程。
微生物细胞数目的检测方法：显微直接计数法：用计数板在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。
活菌计数法：通过测定样品在培养基上形成的菌落数来间接确定其活菌的方法，计数依据是在稀释情况下一个菌落由一个活细胞繁殖形成，又称平板菌落计数法。
微生物生物量的测定方法：1、湿重法将微生物培养液离心，收集细胞沉淀物，然后称重。
2、干重法将离心得到的细胞沉淀物置于100~105℃的烘箱中干燥过夜至水分去除，然后再称重。
3、比浊法细菌培养物在其生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物混浊度的增加。
在一定浓度范围内，悬液中细胞的数量与透光量成反比，与光吸收值成正比。
因此利用分光光度计在450nm~650mn的某一波长可以测定培养物的光吸收值来确定细胞量。
4、生理指标法与微生物生长量相平行的生理指标很多，可根据实验目的和条件适当选用。
一般微生物细胞的含氮量比较稳定，故可用凯氏定氮法等测定其总氮量，再乘以系数6.25即为粗蛋白含量。
蛋白质含量越高，说明菌体数和细胞物质量越高。
1、丝状微生物菌丝长度测定法将真菌接种在琼脂平皿的中央，定时测定菌落的直径或面积。
2、培养料中菌体生长速率测定法主要测定一定时间内固体培养料中菌丝体向前延伸的距离。
3、单个菌丝顶端生长速率测定法可利用湿室培养法对丝状微生物进行培养，定时将湿室中的培养有微生物的载玻片置于显微镜下，借助目镜测微尺测定一定时间内单个菌丝的伸长长度。
微生物的同步生长与同步培养方法同步培养法：使培养物中所有的微生物细胞都处于相同的生长阶段的培养方法。
同步生长：指这种培养物中所有微生物细胞都处于同一生长阶段，并都能同时分裂的生长方式。
获得微生物同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：采用物理或化学因子使微生物细胞生长进行到某个阶段停止下来，使先到该阶段的微生物细胞不能进入下个阶段，待全部群体细胞都到达该生长阶段后，再除去该因子，使全部群体细胞同时进入下个生长阶段，达到诱导微生物细胞同步生长的目的。
