下载文档原格式
微生物原生质体融合育种技术及其应用摘要：工业微生物菌种选育在发酵工业中占有重要地位。
微生物原生质体融合(microbialprotoplast fusion)技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整等优点,是微生物育种最常用的方法之一。
结合相关研究进展,分析了原生质体融合技术的组成,包括制备、再生、融合的影响因素以及融合子的筛选方法,重点评述了原生质体融合技术应用在微生物育种中的最新进展,以及微生物原生质体融合技术的发展前景。
关键词：微生物原生质体融合遗传育种基因组重组引言：微生物菌种是发酵工业中的一个关键因素,它决定了发酵过程的成败及某一发酵产品是否具有工业化价值。
自然界中的原始菌株大多不具有很高的工业化价值,因此需要对菌株进行选育和改良,以提高产品的质量,降低成本。
原生质体融合技术是起源于20世纪60年代的一项重要的菌种改良技术,是将亲株细胞分别去除细胞壁后进行融合,经基因组间的交换重组,获得融合子的过程。
与其他育种技术相比,原生质体融合技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制等优点,因而被国内外微生物育种学者广泛应用。
1974年,匈牙利的Ferenczy成功将白地霉(Geotrichum candidum)营养缺陷型突变株的原生质体进行融合,使原生质体融合技术首次应用于微生物中。
接下来的几十年,该技术的基本实验方法逐步完善,现已作为一项十分有用的技术广泛应用于工业微生物菌种选育中。
本文就原生质体融合技术的过程及其应用于微生物育种方面的最新进展做了简要综述,并分析了目前存在的问题及未来的发展方向。
1 资料和方法：1.1 资料来源由第一作者在CNKI进行检索。
网址：/。
英文资料的检索时间范围为2007/2012；中文资料的检索时间范围为2007/2012。
英文检索词为“protoplast fusion、research、progressions”；中文检索词为“原生质体融合、应用、研究进展”。
原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。
其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。
在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。
因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。
关键词原生质体制备融合育种原生质体再生融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。
当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。
原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。
[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。
1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。
常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。
其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。
[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。
去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。
[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。
丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。
[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。
原生质体制备的原理原生质体啊，简单来说，就是把植物或者微生物细胞外面那层细胞壁给去掉之后剩下的部分。
那为啥要去掉细胞壁来制备原生质体呢？这就像给细胞做了个“脱壳手术”，让细胞变得更“赤裸裸”，这样就方便我们对细胞进行各种研究啦。
对于植物细胞来说，细胞壁是由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的。
就像一个坚固的小房子，把细胞里的原生质给围在里面。
那怎么把这“小房子”拆掉呢？这就用到了一些特殊的酶。
比如说纤维素酶，它就像一个小小的拆迁队队员，专门针对细胞壁里的纤维素，把纤维素的化学键给切断。
还有果胶酶呢，它也没闲着，负责把果胶分解掉。
这俩酶就这么齐心协力，一点一点地把细胞壁给瓦解掉，原生质体就被释放出来啦。
微生物细胞也类似哦。
不过微生物的细胞壁成分和植物不太一样。
像细菌的细胞壁有肽聚糖，这时候就需要用溶菌酶这样的酶来对付它。
溶菌酶就像一个精准的小剪刀，找到肽聚糖里合适的地方，“咔嚓”一下剪断化学键，细胞壁就开始破掉啦。
原生质体的制备啊，还有很多小讲究呢。
比如说酶的浓度很重要。
如果酶的浓度太低，就像拆迁队的人手不够，拆细胞壁拆得慢吞吞的，效率特别低。
可要是酶的浓度太高呢，就有点像一群莽撞的工人，可能会对原生质体本身造成伤害，把原生质体里面的一些重要结构也给破坏掉了，这可就不好了。
温度也是个关键因素。
就像人干活的时候，温度合适干活才舒服。
对于酶来说也是一样的，不同的酶有它最适宜的工作温度。
在这个温度下，酶的活性最高，拆细胞壁的速度最快，效果也最好。
要是温度不合适，酶可能就会偷懒，不好好干活啦。
而且啊，制备原生质体的时候，还得注意渗透压。
细胞里面是有一定渗透压的，当把细胞壁去掉之后，如果外面的渗透压不合适，原生质体就会像一个被捏扁或者胀大的气球一样。
要是外面的溶液浓度太高，原生质体里的水就会被吸出去，原生质体就会皱缩起来；要是外面溶液浓度太低，水就会大量涌进原生质体，原生质体就可能会胀破。
所以得找到合适的渗透压条件，让原生质体能够舒舒服服地待着。
原生质体制备和再生的影响因素【摘要】以酿酒酵母YS5为出发菌株，经蜗牛酶酶解获得原生质体后，用紫外线进行诱变处理，通过一级筛选得到了61株诱变菌株，将这些诱变株直接进行发酵，利用气相色谱对发酵液酒精产量进行分析。
结果表明，经过紫外线照射30s后，通过筛选获得了一株酒精发酵较高产菌株，酒精产率达到了10.36%（v/v），比出发菌株提高了3.6%。
【关键词】酿酒酵母；原生质体；紫外诱变；甘蔗汁发酵酵母细胞的融合及酵母原生质体的诱变的一个重要前提就是如何制备大量的原生质体，原生质体制备率受到各种条件的影响，如菌龄、酶浓度、温度、预处理等的影响，因此确定不同因素对酵母原生质体的影响及优化不同因素，可以大大提高产率。
1.菌体菌龄对原生质体制备的影响微生物的生理状态是决定原生质体产量的主要因素之一，特别是菌龄，明显影响原生质体释放的频率。
不同时期的菌体，对各种溶壁酶的敏感性不同，原生质体的形成率与再生率也有很大差异。
较年轻的菌体细胞制备原生质体较为容易，而且此阶段的原生质体再生率也较高。
处于对数生长期的菌体代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，生长适应能力强，故通常取处于对数生长期的菌体制备原生质体。
有研究表明对数生长早期形成率最高，对数生长中期时再生率最高，对数生长晚期的再生率也比对数生长中期的低。
这是由于细胞壁越稚嫩，越易被酶破坏，对数生长早期菌体幼小，代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，故生活适应能力强；对数生长中期幼小菌体对不利因素抵抗能力差，一旦失去细胞壁，较难恢复；对数生长晚期的原生质体存在着很大比例的非活性个体。
菌体如果进入稳定期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体，原生质体形成率显著降低，而且再生率也有所下降。
微生物的菌龄是随着菌种和培养条件而异，酵母菌菌液中加入β-巯基乙醇可以破坏细胞壁组分中的二巯基，处于对数生长期的酵母菌菌体代谢极为旺盛，细胞壁易被瓦解，其细胞壁对蜗牛酶较为敏感，易于酶解脱壁，且酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化才能大幅度的提高制备率。
文章篇号:1007-2764(2006)03-0263-093微生物原生质体制备及再生的影响因素谭文辉，李燕萍，许杨（南昌大学中德联合研究院 食品科学教育部重点实验室，江西南昌 330047） 摘要：原生质体的制备及再生，是原生质体技术的前提和基础。
本文较全面地介绍了影响微生物原生质体制备及再生的因素，以期在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体，为进一步实验打下良好的基础。
关键词：原生质体；制备；再生Factors Affect the Formation and Regeneration of Protoplasts ofMicroorganismTan Wen-hui, Li Y an-ping, Xu Y ang(The Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education (Nanchang University); Sino-Germany Joint ResearchInstitute, Nanchang 330047, China)Abstract: Formation and regeneration of protoplasts is the precondition and foundation of protoplasts technology. The factors that affect the formation and regeneration of protoplasts from microorganism were investigated to find the optimum condition of formation and regeneration of protoplasts. It is important to make the good foundation for further research.Keywords: Protoplasts; Formation; Regeneration原生质是有组织的生活物质，是细胞生命活动的物质基础，所有的原生质有相似的基本组成成分和特性。
文章篇号:1007-2764(2006)03-0263-093微生物原生质体制备及再生的影响因素谭文辉，李燕萍，许杨（南昌大学中德联合研究院 食品科学教育部重点实验室，江西南昌 330047） 摘要：原生质体的制备及再生，是原生质体技术的前提和基础。
本文较全面地介绍了影响微生物原生质体制备及再生的因素，以期在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体，为进一步实验打下良好的基础。
关键词：原生质体；制备；再生Factors Affect the Formation and Regeneration of Protoplasts ofMicroorganismTan Wen-hui, Li Y an-ping, Xu Y ang(The Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education (Nanchang University); Sino-Germany Joint ResearchInstitute, Nanchang 330047, China)Abstract: Formation and regeneration of protoplasts is the precondition and foundation of protoplasts technology. The factors that affect the formation and regeneration of protoplasts from microorganism were investigated to find the optimum condition of formation and regeneration of protoplasts. It is important to make the good foundation for further research.Keywords: Protoplasts; Formation; Regeneration原生质是有组织的生活物质，是细胞生命活动的物质基础，所有的原生质有相似的基本组成成分和特性。
原生质体是由原生质特化而来，细胞内由原生质组成的各种结构，统称为原生质体，它们彼此联系、相互影响而构成一个有机整体，担负着细胞的所有生命活动[1]。
原生质体技术的关键是对细胞壁进行消化，以形成大量的原生质体，并使原生质体能高频率的再生细胞壁，回复到正常细胞状态。
当细胞壁去除后，原生质体具有以下特征：一是无细胞壁障碍，可对膜和细胞器进行基础研究，同时可进行遗传操作；二是具有全能性，能在人工条件控制下，进行大量快速繁殖；三是可诱导融合，形成杂种细胞，为体细胞杂交提供实验材料[2]。
因此，原生质体技术无论在理论上或实践上都日益受到重视。
1 原生质体的制备收稿日期：2006-03-29作者简介：在读硕士，研究方向为食品生物技术国家自然科学基金资助（30460006）项目，江西省自然科学基金资助（0530081）项目通讯作者：许杨，教授、博导人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质体，效果都不理想。
目前，制备原生质体大都是利用酶解法脱去细胞壁。
但由于各种微生物细胞壁组成的差异，制备原生质体的条件也各不相同。
1.1 菌龄对原生质体形成的影响菌体的不同生理状态，直接影响到细胞壁的结构、菌体的代谢水平及菌体的活力等。
酵母菌原生质体制备一般取对数生长期的单倍体细胞，此时细胞代谢活跃，生长率高，群体细胞的化学组成、形态及生理特征比较一致[3]。
孙传宝等报道，对数生长期以前的菌丝体细胞壁结构对降解酶不敏感，酶解过程中更多的是将细胞壁最外层葡聚糖部分降解，造成菌丝体断裂，内含物溢出。
到了对数生长后期，菌丝体原生质体释放量较高，但菌丝体体内有大量液泡产生，且原生质膜内皱较多，故释放的原生质体体积较大[4]。
1.2 培养基成分对原生质体分离的影响培养基成分不同可导致新合成细胞壁结构的差异，这种差异又导致了细胞壁对酶敏感度反应不一，从而使菌丝细胞释放的原生质体量有差异[5]。
据报道，在链霉菌（Streptomyces rimosus）的培养基中加入氨基乙酸，可有效促进菌丝体细胞壁形成对裂解酶敏感263的结构，大幅度提高原生质体释放，且制备的原生质体质量高，从而提高原生质体的再生[6]。
1.3 酶种类对原生质体形成的影响在制备细菌、放线菌的原生质体时，主要使用溶菌酶作为工具酶。
对于酵母菌、霉菌，大型真菌，由于其细胞壁组成比较复杂且存在差异，使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用一种酶的效果好[7]。
据报道，混合使用裂解酶、几丁质酶、纤维素酶和果胶酶，粉红聚端孢（Trichothecium roseum）的原生质体生成率最高为2.8×105个/mL[8]。
1.4 酶浓度对原生质体形成的影响酶中往往含有对原生质体有害的酶类，随着酶量的增加，杂酶的浓度也会随之增加，当达到一定浓度时，必然会影响原生质体的活性；而且，酶浓度过大，细胞脱壁太彻底，必然降低原生质体的再生率[9]。
1.5 酶解时间对原生质体形成的影响不同微生物的最适酶解时间的差异很大。
酶解时间过长，对于一些早期释放的原生质体膜有破坏作用，影响原生质体膜的稳定性，导致原生质体破碎或再生率降低[10]。
Benjaminiella poitrasii的最佳酶解时间为4小时，此时原生质体产量和再生率最高，时间过短或过长都会导致原生质体的产量和再生率降低[11]。
1.6 酶解温度对原生质体形成的影响根据酶反应动力学原理，酶解温度直接影响酶促反应的速度。
放线菌的最适酶解温度为28~37℃，真菌的最适酶解温度为30~35℃。
据N.Balasubramanian 等报道，对粉红聚端孢（Trichothecium roseum）来说，最适酶解温度为28℃，在低于最适酶解温度时，随着温度的升高，原生质体制备率不断提高；高于最适酶解温度时，原生质体的产量明显减少[8]。
1.7 酶解液pH值对原生质体分离的影响酶解液pH值不仅影响酶的活力和底物的特性，改变溶壁效果，而且影响已脱壁原生质体的稳定性。
pH值略偏碱性有利于革兰氏阴性细菌细胞壁外膜的去除，使溶菌酶可以更好的作用于肽聚糖上ß–(1,4)糖苷键，促使菌体脱壁。
对Monacrosporium megalospo- rum真菌来说，酸性的环境对其原生质体有害，pH7最有利于原生质体的形成[12]。
1.8 渗透压稳定剂的性质及浓度对原生质体产率的影响合适的渗透压稳定剂，一方面可使原生质体内外的渗透压维持平衡，另一方面对酶的活性也具有一定的促进作用，从而影响原生质体的产量。
通常，丝状真菌以无机盐作为稳定剂比较适宜，而酵母菌则用糖或醇做稳定剂较好[13]。
对绿色木霉(Trichoderma viride)来说，用0.6 mol/L的KCl作为渗透压稳定剂得到的原生质体产量最高，可达4.7×105个/mL[14]。
1.9 预处理方式对原生质体形成的影响不同预处理方式会引起细胞壁的组成或超微结构发生变化，从而影响裂解酶的敏感度。
一方面，对已培养好的菌体，在酶解前用适量硫醇化合物(如ß-巯基乙醇和二硫苏糖醇)预处理能还原细胞壁中蛋白质的二硫键，使分子链切开，酶分子易渗入，从而促进细胞壁的水解及原生质体的释放[15]。
另外，EDTA作为螯合剂，可以避免金属离子对酶的抑制作用而提高霉的脱壁效果，从而提高原生质体的形成率。
据报道，对埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli）来说，用EDTA 洗后，可以除去对酶解不利的金属离子[16]。
另一方面，在原生质体制备前，用适量的青霉素对菌体进行预处理，可以抑制肽聚糖合成过程中的转肽作用，有利于原生质体的形成[12]。
1.10 其他影响因素酶解过程中轻微振荡有利于原生质体的释放，可能与酶充分接触菌丝体或与氧的供应有关。
此外，还有一些影响因素如：菌体浓度、分散程度和遗传性等。
2 原生质体的再生原生质体再形成有生活能力的菌丝称为再生。
不同微生物的原生质体最适再生条件存在一定的差异。
2.1 培养方式对原生质体再生的影响不同的菌种要求不同的再生培养方式，用固体培养法再生原生质体优于液体培养法。
王波等报道，双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的原生质体适合于固体单层再生培养，单层再生培养基的再生菌落数较双层再生培养基的高72.0 %[17]。
2.2 培养基对原生质体再生的影响在再生培养基中会添加一些营养物质，这些物质可能是作为细胞壁合成的前体物质，也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢，加速细胞壁合成的作用。
通常，添加酵母膏、蛋白质、糖类或氨基酸到真菌的再生培养基中，而细菌、放线菌的再生培养基中常添加水解酪蛋白、血清白蛋白、氨基酸和琥珀酸钠等。
对白绢菌（Sclerotium rolfsii）来说，在再生培养基中添加0.6 mol/L的蔗糖，原生质体的再生率最高，可达26 %[18]。
2.3 菌龄对原生质体再生的影响菌龄过短的菌丝经酶解破壁形成小原生质体，有的细胞器不完全，营养供给不足，再生能力也较低。
264菌龄长的原生质体再生率高，且再生时间远比菌龄短的原生质体再生时间短，可能是含有细胞核和其他细胞物质数量多的缘故[19]。
2.4 渗透压稳定剂对再生率的影响渗透压稳定剂对再生率的影响主要可能还是对原生质体稳定的影响。
王殿夫等曾经报道，就形成率而言，以糖及糖醇类作为渗透压稳定剂比无机盐更有利于原生质体的再生。
这可能是由于糖和糖醇对原生质体的保护作用[20]。
2.5 Ca2+对原生质体再生的影响Ca2+主要是通过维系膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与活性。
王建华等报道，原生质体膜外在蛋白上二价阳离子的存在使膜脂流动性减慢、稳定性增强，这种维持稳定性的效果大小与膜表面分子数量的多少呈正比例关系[21]。
2.6 酶解参数对原生质体再生的影响原生质体制备时的酶浓度和酶解时间对原生质体再生的影响较大。
酶浓度的高低也影响原生质体的再生，因为在过高浓度的酶制备原生质体时细胞受损伤较大，失去了重新建成原来细胞所必要的因子，影响原生质体的再生。
酶解时间与原生质体形成率成正比，与再生率成反比[22]。
原因是酶解时间越短，细胞壁脱壁越不完全，较易再生出细胞壁，酶解时间越长，脱壁越完全，原生质膜易被酶液破坏，再生较困难。
2.7 原生质体的贮存对再生的影响由于原生质体比较脆弱，在各种高渗液和不同温度下保存，其再生能力普遍都会下降。
据徐进等报道，捕食线虫真菌（Nematode-trapping）的原生质体经过-20 ℃冰冻后或经4 ℃放置数天后，仍有部分可以再生(再生率低于0.1%)[23]。
