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紫花苜蓿MsCOL1基因植物表达载体的构建及拟南芥转化苏志芳;包阿东;李亚珍【摘要】[目的]构建紫花苜蓿MsCOL1基因植物的表达栽体.[方法]根据紫花苜蓿CONSTANS类似基因MsCOL1基因(登录号:DQ661682)序列,设计含有酶切位点的一对特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,获得MsCOL1基因完整编码区DNA 序列,并将目的片段插入表达载体pBll21的相应位置,构建植物表达载体35S∶∶MsCOL1,再利用农杆菌介导方法将35S∶∶MsCOL1转化到拟南芥中.[结果]分析测序结果显示,所获得克隆为插入目的片段的阳性克隆.经RT-PCR检测,证明转基因植株中MsCOL1基因能够顺利表达.[结论]该方法成功构建植物表达载体35S∶∶ MsCOL1,并获得了转基因拟南芥植株.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】3页(P1610-1611,1668)【关键词】紫花苜蓿;拟南芥;转基因;MsCOL1【作者】苏志芳;包阿东;李亚珍【作者单位】河套学院农学系,内蒙古临河015000;河套学院农学系,内蒙古临河015000;河套学院农学系,内蒙古临河015000【正文语种】中文【中图分类】S541+.1有关植物开花时间的分子生物学研究，在模式植物拟南芥上已经进行得相对全面、深入。
在调控拟南芥开花时间的光周期途径中，CONSTANS(CO)基因的表达控制拟南芥感知日照时间的长短，在连接光信号与生物信号过程中起关键性作用，该基因编码一个含有锌指结构的核蛋白[1]。
当植物受到长时间光照时，CO基因的mRNA表达量增加[2]。
CO基因是FT基因[1]和SOC1基因[3]的上游基因，其转录因子能促进植物开花。
在拟南芥开花时间有关基因调控研究中，CO基因突变体能使开花时间延迟，通过调节增加CO基因的表达，可以使FT基因的表达量提高，使植物开花行为提前发生[1]。
但是在CO基因的同源基因COL的表达模式中，功能有所差异。
拟南芥CGP1基因启动子克隆及其GUS转基因植株的构建朱香豫;吴席;陶曼芝;王婷婷;贾亚峰;曹树青【期刊名称】《合肥工业大学学报:自然科学版》【年(卷),期】2022(45)10【摘要】前期研究发现一个功能未知基因响应植物镉胁迫,将之命名为CGP1。
文章为探究植物基因CGP1的表达模式及其在响应镉胁迫中的表达变化情况,以野生型拟南芥为实验材料构建CGP1基因启动子接pART7-GUS载体及其转基因植株。
通过提取野生型拟南芥的DNA,并以DNA为模板利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术克隆得到CGP1基因启动子序列,将启动子序列和GUS载体双酶切后进行连接,并转化到大肠杆菌感受态细胞中,通过测序获得构建成功的ProCGP1-GUS载体。
利用浸染花序法将ProCGP1-GUS载体转入野生型拟南芥中,并通过抗性筛选获得ProCGP1-GUS转基因阳性植株,为研究镉胁迫下CGP1基因的功能奠定了基础。
【总页数】5页(P1395-1399)【作者】朱香豫;吴席;陶曼芝;王婷婷;贾亚峰;曹树青【作者单位】合肥工业大学食品与生物工程学院【正文语种】中文【中图分类】Q943.2【相关文献】1.拟南芥 CWINV1启动子 GUS 表达载体构建及转基因植株的鉴定2.拟南芥MYB4基因GUS载体构建及其转基因植株的筛选3.拟南芥CTSP3基因GUS载体构建及转基因植株的筛选鉴定4.拟南芥Pro:RFE6-GUS载体的构建及其转基因植株的筛选5.拟南芥ProWRKY12-GUS转基因植株的构建及其染色分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
拟南芥防御素基因PDF1.2启动子与GUS重组载体的构建与转化刘志霞;周舟;蔡薇;程姣;任春梅【摘要】PDF1.2基因在植物的防御系统中扮演着重要的角色,其编码产生的植物防御素参与了植物对真菌入侵、病毒感染、不良环境等逆境胁迫的防御反应.试验利用从拟南芥中通过PCR扩增和克隆的该基因启动子构建GUS报告基因的表达载体,通过根癌农杆菌浸渍转化法将表达报告基因转入拟南芥中,筛选获得了转化植株.获得以下主要结果:(1)成功克隆了拟南芥PDF1.2基因的启动子并将其与带GUS 标记基因的载体进行了融合,得到了重组的融合载体;(2)成功的将带GUS标记基因的拟南芥PDF1.2基因启动子融合载体转入到拟南芥植株中并利用其自带抗性标记筛选到了抗性植株;(3)利用GUS染色技术检测了转基因植株中PDF1.2基因启动子的表达情况.%PDF1.2 gene plays an important role in plant defense systems,the plant defensins encoded by PDF1.2 gene participates in plant defensive response against to adversity stress such as fungal invasion,viral infection and adverse environment conditions.The promoter of PDF1.2 gene that amplified and cloned by PCR from Arabidopsis was used to construct the expression vector of GUS reporter gene in this experiment,then the expression reporter gene was transformed into Arabidopsis through agrobacterium tumefaciens transformation method and the transformed plants was obtained by screening.The main results were showed as follows:1.The promoter of Arabidopsis PDF1.2 gene was successfully cloned and fused with the vector carrying GUS report gene to obtain a recombinant fusion vector;2.The reconstructive vector wastransferred into Arabidopsis thaliana and the transgenic plants were screened successfully;3.The expression of the promoter of PDF1.2 gene in transgenic plants was detected by GUS staining.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2018(032)002【总页数】4页(P131-134)【关键词】载体构建;PDF1.2基因;克隆;转化【作者】刘志霞;周舟;蔡薇;程姣;任春梅【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;作物基因工程湖南省重点实验室,长沙410128【正文语种】中文【中图分类】Q785PDF1.2基因是一个广泛存在于植物中与抗逆相关的基因［1～4］。
华大基因公司测序。
DNA marker;A,pMD19-KpnI-P JAZ1-BamHI-NcoI pMD19-KpnI-P JAZ1-BamHI-NcoI鉴定M,DNA marker;A,pMD19-BamHI-JAZ1-BamHIpMD19-BamHI-JAZ1-BamHI转化子的KpnI和NcoI对测序证实无突KpnI-P JAZ1-BamHI-NcoI和pCAMBIA1305.切,前者割胶回收约2.3kb的JAZ1具有相应酶切位点的线性化载体化大肠杆菌,经菌落PCR筛选获pCAMBIA1305.1-KpnI-PJAZ1-BamHI-NcoI 定(图3)。
注:M,DNA marker;A,P JAZ1;B,JAZ1cds;C,KpnI和NcoI双酶切;D,BamHI单酶切图3P JAZ1:JAZ1-GUS的PCR鉴定3讨论拟南芥IQM1是由AT4G33050编码的含有1个IQ 基序的钙调素结合蛋白[1]。
基因芯片分析表明,IQM1突变后,其成熟植株叶片中有4个JAZ家族基因(JAZ1、JAZ5、JAZ7与JAZ8)表达上调[3]。
前人已构建P35S:JAZ1-GUS,并构建双突变体iqm1-1×P35S:JAZ1-GUS,通过GUS染色实验得出IQM1突变使JAZ1蛋白水平降低。
为了排除35S启动子对表达模式的影响,有必要构建P JAZ1:JAZ1-GUS植物表达载体。
本研究成功了构建了该载体,在转化IQM1突变体植株,筛选获得转基因纯合子植株后,可进一步验证IQM1突变对JAZ 蛋白的影响,为IQM家族蛋白的研究提供更全面的科学证据。
【参考文献】[1]Zhou YP,Fujibe T,Wang XL,Cheng HZ,Yamamoto KT, Tian CE.Initial characterization of Arabidopsis T-DNA insertion mutants of the IQM1gene that encodes an IQ motif-containing。
Botanical Research 植物学研究, 2017, 6(2), 25-30Published Online March 2017 in Hans. /journal/br https:///10.12677/br.2017.62005文章引用: 荣楠, 蔡薇, 周舟, 任春梅. 拟南芥防御相关基因THI 2.1启动子与GUS 重组载体的构建与转化[J]. 植物学Construction of Recombinant Plasmid of Defense-Related Gene THI 2.1 Promoter and GUS Gene in Arabidopsis thalianaNan Rong 1*, Wei Cai 1*, Zhou Zhou 1, Chunmei Ren 1,2#1College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha Hunan 2Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province, Changsha HunanReceived: Feb. 25th , 2017; accepted: Mar. 14th , 2017; published: Mar. 17th, 2017AbstractTHI 2.1 gene is an important gene in plant defense systems; the thionins encoded can effectively enhance plants disease resistance and help plants resist the spread of external pathogens. Analy-sis of the expression pattern of this gene in plants will help us to further understand the regula-tion of this gene. In our study, a fusion expression vector of THI 2.1 gene promoter and GUS marker gene was constructed and transformed into Arabidopsis thaliana . Our results provide the material basis for further study on the expression pattern of THI 2.1 gene in Arabidopsis thaliana . The result as follows: 1) The fusion vector of THI 2.1 gene promoter and GUS marker gene was constructed successfully. 2) The reconstructive vector was transferred into Arabidopsis thaliana and the trans- genic plants were screened successfully.KeywordsVector Construction, THI 2.1 Gene, Promoter拟南芥防御相关基因THI 2.1启动子与GUS 重组载体的构建与转化荣 楠1*，蔡 薇1*，周 舟1，任春梅1,2#1湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 2作物基因工程湖南省重点实验室，湖南 长沙*并列第一作者。
拟南芥CTSP3基因GUS载体构建及转基因植株的筛选鉴定作者：孟云陶曼芝吴席曹树青樊婷婷来源：《安徽农业科学》2019年第03期摘要[目的]深入研究植物基因CTSP3的基因表达模式及其对重金属镉胁迫的响应机制，以野生型拟南芥为材料构建CTSP3-GUS重组质粒及GUS转基因植株。
[方法]通过提取野生型拟南芥的DNA，克隆其启动区基因片段，将基因片段和pART27-GUS质粒双酶切后连接，转化到大肠杆菌感受态细胞中，菌落PCR和测序获得阳性单克隆。
然后将CTSP3-GUS重组质粒转入农杆菌感受态GV3101，获得阳性单菌落。
接着采用浸花法侵染野生型拟南芥，最后通过抗性筛选和PCR鉴定获取CTSP3-GUS转基因植株。
[结果]成功克隆CTSP3启动区基因片段，构建出重组质粒，获得了CTSP3-GUS转基因植株。
[结论]获得CTSP3-GUS转基因植株，为接下来进一步研究该基因在植物响应镉胁迫机制中的功能奠定了基础。
关键词拟南芥;CTSP3;载体;转基因植株中图分类号Q939.9文献标识码A文章编号0517-6611（2019）03-0084-03doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.027重金属污染已经成为世界性重大环境问题之一，其中重金属镉污染尤为严重。
过多的镉会对动植物细胞组织造成不可逆的损伤[1-3]。
在重金属镉逆境中，植物通过控制金属流入、促进金属泵出、重金属螯合等途径来应激[4]。
运用植物转基因技术对植物品种进行优化改良是解决重金属污染的最佳方式[5]。
研究发现CTSP3功能缺失突变体对重金属镉胁迫表现出耐受的表型，所以笔者拟通过克隆CTSP3启动区基因，获得CTSP3-GUS植株，以进一步研究植物基因CTSP3的基因表达模式及其对重金属镉胁迫的响应机制。
1材料与方法1.1材料1.1.1材料。
植物材料是哥伦比亚（Columbia， col）遗传背景的拟南芥（Arabidopsis thaliana），从美国拟南芥种质资源中心获得，由合肥工业大学植物分子生物学实验室繁殖所得。
拟南芥钙调素结合蛋白基因启动子的克隆及表达万东莉;李瑞丽;邹博;高阳;万永青;王瑞刚;李国婧【摘要】采用PCR技术从拟南芥中克隆了SCBP60g基因的启动子,并与GUS报告基因融合构建重组表达载体,转化野生型拟南芥,对获得的转基因株系进行GUS 组织染色,从基因调控水平上探讨其在功能方面的差异.结果显示:SCBP60g基因的启动子能指导GUS报告基因在拟南芥的根、茎、叶和花中表达,并且在这些部位的维管束表达较强.这种表达方式与LCBP60g基因的启动子指导的GUS基因组织化学染色有差异,表明这个启动子的表达调控具有一定的特异性.%In this study,a promoter fragment of the SCBP60g gene was amplified by PCR from Arabidopsis, and fused with the GUS reporter gene. The recombination construct was then transformed into wild type Arabidopsis. Histochemical staining of GUS activity showed that; the promoter could drive the GUS expression in root,stem,leaf and flower,and relatively high expression levels were found in vascular tissue. However,this expression pattern is different from the promoter of LCBP60g that drives the same GUS gene expression,indicating the specific regulation of this promoter.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2012(032)001【总页数】6页(P17-22)【关键词】拟南芥;启动子;钙调素结合蛋白;CBP60g;GUS报告基因【作者】万东莉;李瑞丽;邹博;高阳;万永青;王瑞刚;李国婧【作者单位】内蒙古农业大学生命科学学院,呼和浩特010018;内蒙古农业大学生命科学学院,呼和浩特010018;内蒙古农业大学生命科学学院,呼和浩特010018;内蒙古农业大学生命科学学院,呼和浩特010018;兰州大学生命科学学院,兰州730000;内蒙古农业大学生命科学学院,呼和浩特010018;内蒙古农业大学生命科学学院,呼和浩特010018;内蒙古农业大学生命科学学院,呼和浩特010018【正文语种】中文【中图分类】Q786高等植物基因的表达调控是分子生物学研究领域的热点之一。
gus载体构建原理基因编辑技术是一种革命性的方法，在许多疾病和人类遗传学方面都有很好的应用。
GUS基因是一种广泛使用的转化分析标记，可以用于分子生物学应用和基因编辑中。
在这篇文章中，我们将探讨“gus载体构建原理”。
第一步：载体设计一个gus载体通常由以下几个部分组成：启动子，gus基因，选殖标记和终止子。
启动子控制着gus基因被转录的时间和位置，而选殖标记可以用来筛选带有gus基因的细胞。
终止子让gus基因的转录在正确的位置终止。
第二步：标记gus基因的载体在很多基因编辑任务中，gus基因可以用来标记细胞是否已经被编辑。
gus基因被整合到生物体本身的基因组中时，可以通过水杨酸β葡糖苷酶染色来检测它的存在和表达。
因此，载体中的gus基因应该带有水杨酸β葡糖苷酶的附加序列，以便将其标记。
第三步：将gus载体转化入细胞将gus载体导入到受体细胞中的方式有多种方法，包括电穿孔，微注射，病毒转染等。
在这一步中的最关键的问题是确定gus载体已经被成功导入到细胞中。
为了验证这一点，我们可以使用PCR，南方blotting，western blotting等技术来检测gus基因在细胞中的存在。
第四步：筛选gus载体转化后的细胞这一步是gus载体构建过程中最关键的一步。
gus基因控制细胞株中β-葡萄糖苷酶的表达，并且能够将其转化为蓝色产物。
因此，如果我们将含有gus基因的gus载体导入到细胞中，经过营养选择和筛选之后，只有表达gus基因的单元才会变成蓝色。
因此，我们可以通过观察细胞的颜色来确定这个细胞具有gus基因。
总体来说，gus载体构建的过程是一个需要多个步骤的复杂过程。
对于初学者来说，研究这个过程可能会比较困难，需要学习许多分子生物学的基础知识和技术。
但是，对于那些有经验的科学家来说，这个过程可能是比较简单和直接的。
识水坝为您倾心整理(小店)如需格式转换服务请发豆丁站内信或联系QQ@2218108识水坝为您倾心整理(小店)如需格式转换服务请发豆丁站内信或联系QQ@2218108中戮农业科学院硕士掌能论文第一章引言——■—■——■■—■■一ＩＩＩＩ——■■●■■■—■———■——●●■■■■■■—■■————■■■——■２．１乙烯信号传繇途径的模型在分离投游芥突变俸过程中获褥的两类乙烯突变体，既乙烯不敏感型和乙烯诱导的组成袭迭型，它们都对植物生禽周期中大范隧的乙烯作用其霄影响。
裘鞠，这些己爝接震拥有一个典嚣瓣秘始信号传导途径。
在这条逸径中有证据表明，ＥＴＲｌ基因编码一个乙烯受体，作为己烯信号传导途径中的最初受体。
速夸受俸是一个媵结合蛋自，与绷莲熬两缀分调节因子Ｈｉｓ激酶具有阍源性。
另外，ＥＴＲｌ基因位点的突变体对乙烯完全不敏感。
毅突变体分析表明，ＥＴＲｌ的一个下游基因是ｄ豫ｊ。
ＣＴＲｌ编褥一个与Ｒａｆ激酶霹添豹溅彝霞，ｅ７炎？佼点煞突变导致乙烯调节的途径组成型激活，ＣＴＲＩ是乙烯储号传导途径的负调节因子，其下游基隧髓ＥＩＮ２。
尉№蕊因位点戆突变俸夯对己燎完全不敏感。
最近，乙烯信号传导谂径中的一些灏成员也已经发现，基于上述这些发现，Ｅｃｋｅｒ等（２００４）提出了如下乙烯信号传导途径的耨模型ｆ圈１－－２）：２．２乙烯信号感威和传导的可能机制２．２。
ｌ艺爆与ＥＴＲｌ器蠡的相互｛乍粥图１－－２赫因表达调控中的乙烯鹰簪途径模型Ｆｉｇ１－２Ａｍｏｄｅｌｆｏｒｔｈｅｅｔｈｙｌｅｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｐａｔｈｗａｙｌｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ时ｇａｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ。
（Ｅｃｋｅｒ，ｅｆ４，，＋２００４ＣｕｒｒａｎｔＯｐｉｎｉｏｎｔｎＰｌａｎｔＢｔｏｌｏｇｙ）已有充分的证据说明ＥＴＲｌ魁植物中的一个己烯受体。
遗传分析提供的谜据表明，ＥＴＲｌ作用予对乙烯信号传爵有影响的其它熬因位点的上游。
Ｂｌｅｅｅｋｅｒ等发现，ｅｒｒｌ．，突变体植株的饱年珏结念己爝麴悲力只裙黔生整麴１／５。
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology2008,16(3):543~544*基金项目： 国家重点基础研究规划 （973） 项目(No.G1999011704)资助。
**通讯作者。
Author for correspondence.Email:<xcwang@>收稿日期： 20070309接受日期： 20070417·研究简报·拟南芥 基因启动子的克隆及转录调控元件分析 *李 宏， 魏鹏程， 龚喜明， 王学臣 **（中国农业大学生物学院植物生理生化国家重点实验室， 北京 100094）关键词：拟南芥 启动子； 顺式作用元件； 转录调控中图分类号:S188 文献标识码: A 文章编号: 10061304(2008)03054302Cloning and Analysis of Transcriptional Regulatory Module of PromoterLI Hong， WEI Pengcheng， GONG Ximing， WANGXuechen**promoter;ciselements;transcriptional regulatory扩张蛋白 （expansin） 是一类特异定位在细胞壁上具有酸 生长活性的蛋白 (Lee and Kende,2001;Chen and Bradford, 2000)， 调控很多重要的生理过程(Cho and Cosgrove,2000)， 在时间和空间上的表达受到严格调控。
本研究克隆了一个拟 南芥 基因 的启动子，通过数种逆境胁迫 诱导表达， 对可能的活性响应部位进行了分析。
1材料和方法1.1 启动子的克隆和活性检测以拟南芥( )基因组 cDNA为模板， 设 计上下游引物， 扩增 897bp长的片段， 插入已连接 基因 的质粒中， 构建重组质粒 pUC19P12。
Botanical Research 植物学研究, 2018, 7(3), 287-293Published Online May 2018 in Hans. /journal/brhttps:///10.12677/br.2018.73037Construction and Transformationof Recombinant Plasmid of GeneSSCD1 Promoter and GUS Genein Arabidopsis thalianaPeilin Liu1, Tiantian Zhi1, Chunmei Ren1,2*1College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha Hunan2Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province, Changsha HunanReceived: Apr. 22nd, 2018; accepted: May 16th, 2018; published: May 23rd, 2018AbstractThe tyrosine degradation pathway is an important metabolic pathway in animals, but in plants, less is known about this pathway. Our previous study found that: in Arabidopsis thaliana, the SSCD1 gene encodes the final enzyme of the tyrosine degradation pathway, fumarate lace to ace-tate hydrolase (FAH), and mutation of this gene results in cell death in Arabidopsis under short day. To investigate the tissue expression characteristics of the SSCD1gene, a fusion expression vector of Arabidopsis thaliana SSCD1 gene promoter and GUS gene was constructed and trans-formed into Arabidopsis thaliana, and the transgenic plant was obtained and identified by GUS histochemical staining. The GUS histochemical staining showed that the GUS gene driven by the SSCD1 gene promoter was strongly expressed in the hypocotyls, but weakly in the cotyledons and roots. However, the expression was almost absent in the true leaves. The results of this study in-dicate that the SSCD1 gene plays a more important role in hypocotyls, which is very important for deeply exploring tyrosine degradation pathway in plants.KeywordsArabidopsis, SSCD1 Mutant, Tyrosine Degradation Pathway, GUS拟南芥SSCD1基因启动子与GUS重组载体的构建与转化刘佩琳1，支添添1，任春梅1,2**通讯作者。
刘佩琳等1湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙2作物基因工程湖南省重点实验室，湖南长沙收稿日期：2018年4月22日；录用日期：2018年5月16日；发布日期：2018年5月23日摘要酪氨酸降解途径是动物中一条重要的代谢途径，而在植物中对该途径了解较少。
我们前期研究发现：在模式植物拟南芥中，SSCD1基因编码酪氨酸降解途径最后一个酶——延胡索酰乙酰乙酸酶(fumaryl acetoacetate hydrolase)，该基因突变后导致拟南芥在短日照下出现细胞死亡。
为了探讨SSCD1基因的组织表达特征，本研究构建了拟南芥SSCD1基因启动子与GUS的融合表达载体并转入拟南芥，得到其转基因植株，经GUS组织化学染色，发现SSCD1基因启动子驱动的GUS基因在下胚轴中表达较强，子叶和根中表达较弱，而在真叶中几乎没有表达。
该研究结果表明SSCD1基因在下胚轴中发挥着更重要的作用，对深入探讨植物中酪氨酸降解途径具有重要的作用。
关键词拟南芥，SSCD1突变体，酪氨酸降解途径，GUSCopyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY)./licenses/by/4.0/1. 引言酪氨酸降解途径在动物体内发挥着重要作用，在人类和动物中若被阻断将会造成很严重的损伤，甚至死亡[1]。
延胡索酰乙酰乙酸酶(FAH)参与酪氨酸降解的最终途径，其主要作用是将延胡索酰乙酰乙酸水解成乙酰乙酸和延胡索酸进入三羧酸循环彻底分解[2]。
在动物中，FAH合成中断会导致动物患上酪氨酸血症并引起死亡[3]。
而在植物体内，编码FAH酶的SSCD1基因突变会导致拟南芥在短日照条件下发生细胞死亡，而长日照下表型正常[4]，因此利用基因工程技术来研究SSCD1基因的表达模式有助于了解酪氨酸降解途径在植物体内的作用机制。
启动子处于基因转录起始位点的上游，其作为重要顺式元件参与了一系列基因的表达和调控，并能被RNA聚合酶识别与结合[5]。
将启动子与GUS基因融合，通过转基因实验验证基因的表达活性和组织特异性表达是研究基因表达模式的一种常用方法[6] [7]。
本试验以拟南芥为研究材料，通过构建SSCD1基因启动子以及GUS的融合表达载体，随后将其导入拟南芥植株内，通过抗性筛选得到稳定可遗传的转基因植株，进一步采用GUS组织化学染色，检测SSCD1基因的启动子是否成功转入和正常激活GUS基因。
本实验的完成为后续该基因的研究提供一定借鉴与帮助。
2. 试验材料与方法2.1. 试验材料2.1.1. 植物材料及培养条件拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型Col-0由湖南农业大学作物基因工程湖南省重点实验室植物信号刘佩琳等传导课题组提供。
使用消毒液(20% bleach + 0.1% Triton100)将拟南芥种子浸泡10 min，用无菌水于超净工作台上清洗3~4次，适当密度接种在MS固体培养基上。
4℃黑暗春化3 d后，转入人工气候箱生长，培养温度为(22 ± 2)℃，光周期为长日照(16 h光照/8 h黑暗) [8]。
2.1.2. 表达载体本试验采用的载体为pCAMBIA1301，该载体的启动子为35S启动子，标记基因为GUS 基因，抗性基因为卡那霉素抗性基因，植物筛选标记基因为潮霉素抗性基因。
2.1.3. 菌株本试验所用到大肠杆菌E. coli DH5α和根癌农杆菌GV3101均由湖南农业大学作物基因工程湖南省重点实验室植物信号传导课题组提供。
2.1.4. 试剂DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，PCR所用的反应体系以及卡那霉素和氨苄青霉素均购自于北京TaKaRa公司，质粒提取试剂盒和切胶回收试剂盒购自于AXYGEN公司，酶切连接用到的试剂以及PstI酶和NcoI酶均购自北京宝生物工程有限公司，其他试剂购自于国药集团化学试剂有限公司。
2.1.5. 培养基LB培养基配方为胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂粉15 g/L (固体培养基需要加)，调pH = 7.0；YEB培养基配方为胰蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂粉15 g/L (固体培养基需要加)，调pH = 7.0。
2.2. 试验方法2.2.1. 拟南芥总DNA的提取根据DNA提取试剂盒中的说明书进行提取。
2.2.2. PCR引物的设计及SSCD1基因启动子的扩增通过TAIR网站获取拟南芥SSCD1的基因启动子序列，经软件plantcare分析后选取ATG前2000 bp 序列(启动子区域)，利用Primer Premier 5软件设计其特异性引物SSCD1-F/SSCD1-R，在5’端分别加上PstI和NcoI酶切位点，引物序列为:SSCD1-F,5’-AACTGCAGCTCTCCAACGACAACT-3’(下划线处为酶切位点PstI)SSCD1-R,5’- CATGCCATGGTGACGATACAGATAC-3’(下划线处为酶切位点NcoI)使用高保真酶对试剂盒提取的拟南芥野生型Col-0基因组DNA进行PCR扩增。
退火温度根据引物合成时的预测温度生成(退火温度为60℃)。
将扩增得到的PCR产物经琼脂糖(1.0%)凝胶电泳检测，然后回收目的条带并纯化。
2.2.3. SSCD1启动子基因与GUS融合载体重组将pCAMBIA1301质粒载体(参照质粒提取试剂盒说明书获得载体)和扩增得到的SSCD1启动子片段用PstI和NcoI限制性内切酶在37℃下双酶切过夜，得到的线性载体与启动子片段分别回收后在T4连接酶作用下连接至预期位点，载体构建如图1。
体系为10 × T4 Buffer 2 μL，线性化载体6 μL，插入片段扩增产物1 μL，T4 ligase 0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。
将配置好的体系16℃过夜。
从−80℃冰箱里取出大肠杆菌感受态细胞，置于冰上融化，加入20 μL连接产物混匀，在冰上放置30 min；42℃热击90 s，然后迅速转至冰浴，放置1~2 min，加入700 μL LB液体培养基，37℃摇床下振荡培养45 min，6000 g室温下离刘佩琳等Figure 1. Construction of vector p SSCD1::pC1301图1. p SSCD1::pC1301载体构建心2 min，去部分上清(剩100 μL)，然后混匀浓缩菌液，取50 μL菌液均匀涂布于含50 mg/L Kan的LB 固体培养基上，于37℃恒温培养箱倒置，培养过夜[9] [10]。
