模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

拟南芥ABI3基因缺失突变体的鉴定及对盐胁迫的响应赵彦敏;高海琴;瓮巧云【摘要】采用PCR和RT-PCR技术分别在DNA和RNA水平上对由于T-DNA 插入所导致的拟南芥ABI3基因突变体进行鉴定,鉴定后将野生型Col-0与纯合abi3突变体种子分别置于含不同浓度NaCl的MS培养基上培养,测定萌发率、生物量和根长.结果表明:在NaCl胁迫下,野生型Col-0和纯合abi3突变体种子的萌发率、生物量和根长均随着NaCl浓度的增加呈现下降趋势.在相同NaCl浓度下,纯合abi3突变体种子的萌芽率、生物量和根长均低于野生型Col-0.当NaCl浓度达到150 mmol/L时,纯合abi3突变体种子的萌芽率、生物量和根长均降到最低,与野生型Col-0存在极显著差异.可见,拟南芥ABI3基因具有提高拟南芥抗NaCl 胁迫能力的作用.【期刊名称】《上海农业学报》【年(卷),期】2018(034)004【总页数】4页(P7-10)【关键词】ABI3基因;T-DNA插入;突变体;NaCl胁迫【作者】赵彦敏;高海琴;瓮巧云【作者单位】张家口广播电视大学,张家口075000;张家口广播电视大学,张家口075000;河北北方学院农林科技学院,张家口075000【正文语种】中文【中图分类】Q943.2植物在生长发育过程中,不可避免地会受到各种非生物因素如干旱、低温、高盐及高温等的胁迫,导致农作物的生长品质及产量下降。

作为植物体内重要的逆境响应激素之一,脱落酸(Abscisic acid,ABA)既是胁迫的诱导产物,又是胁迫信号的传导者,通过级联放大反应,能迅速参与到植物抗胁迫的反应中。

此外,脱落酸还参与植物生长的其他环节,如能促使马铃薯形成块茎、抑制种子的萌发等。

早期通过正向遗传学方法筛选到一些在萌发率上对 ABA不敏感的拟南芥基因,如 ABI1-1、ABI2-1、ABI3、ABI4和ABI5[1-4];作为ABA信号的正调控转录因子ABI3基因,在植物的抗旱性和耐盐性功能中起重要的作用[5],主要在种子里表达[2]。

烟草突变体筛选与鉴定方法篇：6.烟草 T-DNA 激活标签突变体侧翼序列筛选与鉴定崔萌萌【期刊名称】《中国烟草科学》【年(卷),期】2012(000)006【总页数】3页(P109-111)【作者】崔萌萌【作者单位】中国农业科学院烟草研究所,青岛 266101【正文语种】中文通过激活标签技术（activation tagging）得到突变群体是构建突变体库的一种重要方法，应用此种方法研究基因功能，不管是用正向或反向遗传学方法，都必须先获得插入位点的侧翼序列（flanking sequence）。

随着拟南芥、水稻及烟草等作物的侧翼序列数据库的不断完善及烟草全基因组测序的完成，越来越体现出激活标签技术对于推动烟草功能基因组学研究具有巨大的潜力。

1 T-DNA激活标签插入群体构建T-DNA激活标签技术是从早期的T-DNA标签技术发展改良而来的，早期的T-DNA标签技术是将人工构建的T-DNA通过Ti或Ri质粒携带，用农杆菌介导的方法[1]随机插入到植物基因组中，通常得到的是功能缺失型突变体，并不适于功能冗余基因、多发育阶段作用基因、环境变化相关基因的研究。

T-DNA激活标签是在 T-DNA的边界加入强启动子或多个串联增强子，从而增强插入区附近（上游或下游）基因的表达，产生显性功能获得型（dominant gain of function）突变体，且这种突变是可稳定遗传的。

通过对激活标签载体T-DNA区加入筛选标记（如抗除草剂Basta的Bar基因和抗卡那霉素的nptH基因）[2]可以筛选阳性植株。

当激活标签插入到基因内部时也会产生传统插入失活突变体。

2012年采用叶盘转化法通过农杆菌侵染将激活标签载体pSKI015转入烟草品种红花大金元中，获得了具有Basta抗性的转基因突变体T0代近4万份。

2 激活标签突变体的初步筛选由于通过激活标签技术产生的功能获得型突变体表型为显性，所以在当代即可进行初步的表型筛选，通过观察得到一些外观性状明显的突变表型；香气、烟碱等性状突变需要专业人员进行分析或测定；一些肉眼不可见的形态突变要借助显微观察等方法。

拟南芥属植物分子遗传学和突变体筛选研究方法随着生物技术的快速发展，从分子到基因组层面的遗传研究已经成为许多生物学实验室的重要研究方向。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)则是其中一种最常用的模式植物，它拥有许多基因遗传和发育过程的相似性，因此被广泛用于生物学研究。

本文将着重介绍拟南芥属植物分子遗传学和突变体筛选研究方法。

1. DNA转化和质粒构建在拟南芥基因研究中，DNA转化和质粒构建是十分重要的实验方法。

DNA转化即将外源DNA导入拟南芥细胞内，常使用的方法有冷冻处理法、电穿孔法等。

而质粒通常可以用于转化拟南芥细胞，以研究基因结构、调节元件、绿色荧光蛋白构建等。

2. 基因敲除基因敲除是在已知某个基因的功能和表达模式，并通过基因突变得以验证。

敲除分为生理性敲除和人工性敲除两种，其中后者可以通过质粒导入方法实现。

基因敲除在拟南芥遗传学研究中被广泛应用，可以探究基因对于生长发育过程的途径以及在各种逆境下的适应能力等。

3. 基因表达基因表达研究是在基因的各种调节元件上构建不同启动子，将被测量的基因与这些元件进行组合，从而研究基因表达的条件和模式。

例如通过全基因组转录组分析方法，可以了解到各种条件对基因表达的影响。

基因表达研究在植物逆境抗性和发育过程等方面都有广泛的应用。

4. 突变体筛选突变体是指基因序列中发生变异引起的表型重要变化，通常是由于自然或人为诱变引起。

突变体的筛选在拟南芥属植物分子遗传学中有着重要的地位。

目前已开发出几十种突变体筛选方法，包括靶向突变、随机诱变、胚乳培养及基因组分析等。

通过筛选突变体，我们可以了解到基因在植物生长发育中的重要性和相互间的关系。

5. 遗传交叉和构建突变遗传交叉是通过交叉杂交的方式寻找某一特定基因或显性性状的控制，以了解基因型和表型特征之间的关系。

而构建突变则是利用特定的载体将人工合成的单个核苷酸序列插入到目的基因中，从而创造特定的基因突变。

这些方法在研究基因调控途径、寻找新型基因等方面都有着重要的应用。

孟德尔遗传两大定律高考题31．（16分）T-DNA 可随机插入植物基因组内，导致被插入基因发生突变。

用此方法诱导拟南芥产生突变体的过程如下：种植野生型拟南芥，待植物形成花蕾时，将地上部分浸入农杆菌（其中的T-DNA 上带有抗除草剂基因）悬浮液中以实现转化。

在适宜条件下培养，收获种子（称为T 1 代）。

（1）为促进植株侧枝发育以形成更多的花蕾，需要去除 ，因为后者产生的会抑制侧芽的生长。

（2）为筛选出已转化的个体，需将T 代播种在含 的培养基上生长，成熟后自交，收获种子（称为T 2代）。

（3）为筛选出具有抗盐性状的突变体，需将T 代播种在含 的培养基上，获得所需个体。

（4）经过多代种植获得能稳定遗传的抗盐突变体。

为确定抗盐性状是否由单基因突变引起，需将该突变体与 植株进行杂交，再自交 代后统计性状分离比。

（5）若上述T-DNA 的插入造成了基因功能丧失，从该突变体的表现型可以推测野生型基因的存在导致植物的抗盐性 。

（6）根据T-DNA 的已知序列，利用PCR 技术可以扩增出被插入的基因片段。

其过程是：提取植株的DNA ，用限制酶处理后，再用 将获得的DNA 片段连接成环（如右图）以此为模板，从图中A 、B 、C 、D 四种单链DNA 片断中选取 作为引物进行扩增，得到的片断将用于获取该基因的全序列信息。

31．（16分）（1）顶芽 生长素（2）（一定浓度的）除草剂（3）（一定浓度的）（4）野生型 1（5）降低 12（6）突变体DNA连接酶B、C27. 二倍体结球甘蓝的紫色叶对绿色叶为显性，控制该相对性状的两对等位基因（A、a和B、b）分别位于3号和8号染色体上。

下表是纯合甘蓝杂交试验的统计数据：请回答：（1）结球甘蓝叶性状的有遗传遵循____定律。

紫色叶植株中，纯合子所（2）表中组合①的两个亲本基因型为____，理论上组合①的F2占的比例为_____。

与绿色叶甘蓝杂（3）表中组合②的亲本中，紫色叶植株的基因型为____。

HY5‐215The Arabidopsis HY5 gene encodes a bZIP protein that regulates stimulus‐induced development of root and hypocotyl, Genes Dev. 1997 Nov 15; 11(22): 2983–2995.In the genome of hy5‐215, the splicing acceptor site of the first intron (=G) was replaced by A, suggesting that this mutation causes aberrant RNA processingIn hy5‐215, the nucleotide g‐1117 (white letter), which is the last nucleotide in the first intron, is replaced by an aHY5‐215的突变位点与野生型相比，并没有酶切位点的变化。

引物在有一个错配位点的情况下，可以产生一个新的酶切位点PsiI，从而将野生型、杂合、纯合进行区分。

Design proper primers and choose proper a enzyme by dCAPS Finder 2.0(/dcaps/dcaps.html)HY5proF GAGAGAATATGCGAGTGAATGAC Len 22 TM 54 HY5proR TCTAAAGTCTCTTTTATGTTTTA T A Len 25 TM 50.8PsiI:但是，实验室并没有PsiI ，所以只能再去寻找新的内切酶。

在设计的引物有2个错配位点时，可以产生新的酶切位点，AluI 将野生型切断。

HY5-215 F CGTATCTCCTCATCGCTTTCAATAG Len 25 TM 60.0 HY5-215 R GTCCCGCTCTTTTCCTCTTTATC Len 23 TM 60.8AluI:MYCTThe Arabidopsis bHLH Transcription Factors MYC3 and MYC4 Are Targets of JAZ Repressors and Act Additively with MYC2 in the Activation of Jasmonate Responses, Plant Cell. 2011 Feb; 23(2): 701–715.MYC2Mutagen : T‐DNA insertionInsertion FlankingSequence:TAAAACCGCCGGAGAATCAGATCACTCCGATCTAGAAGCT(Length:40)根据T‐DNA PrimerDesign（/tdnaprimers.2.html）设计引物PRODUCT_SIZE 1186Myc2LP TGGTTTTTCTTGGTTTCGATG Len 21 TM 59.96Myc2RP CTCTAATCATTGCGTCCCAAC Len 21 TM 59.58LBb1.3 ATTTTGCCGATTTCGGAAC BP+RP_PRODUCT_SIZE 558‐858MYC3Mutagen : T‐DNA insertionmyc3 F AAGGTGGGTTGTTGAAATCTAATG Len 24 TM 58.3myc3 R GTTTTCTCCGACTTTCGTCATCA Len 23 TM 61T-DNA ATATTGACCATCATACTCATTGC Len 23 TM 55.2MYC4Mutagen : T‐DNA insertionmyc4 F TCTCTCACAACTTGATCCAGCTAA Len 24 TM 60.0myc4 R TAACCGATTACCATCTCAACCAA Len 23 TM 59.2T-DNA ATATTGACCATCATACTCATTGC Len 23 TM 55.2Phyb‐9Mutations in the gene for the red/far‐red light receptor phytochrome B alter cell elongation and physiological responses throughout Arabidopsis development. Plant Cell v.5(2); 1993 Febhy3-EMS742 is a G-toA mutationphyb9 F CTGTTCAATCGCAGAAACTCGCGGT Len25phyb9 R CCGTCACATTTCACTAAGTCCAT Len 23 TM58.6MnlI:但是，实验室并没有MnlI，所以只能再去寻找新的内切酶。

拟南芥作为模式植物的基因功能研究拟南芥(Arabidopsis thaliana)，一种小型的芥菜科植物，由于具有生长快、遗传学易、基因组小、适应性强等特点，成为国际上广泛使用的模式植物，用于研究植物基因功能、生物学和生物技术等领域。

本文将从基因功能研究的背景、研究方法、成果及应用等方面阐述拟南芥作为模式植物的基因功能研究。

一、基因功能研究的背景随着生物科技的发展，人们逐渐了解到生命的构成不再是仅仅由肉眼可见的器官，细胞以及前所未知的基因构成，而这些构成还遵循着特殊的规律，而所谓的生命也就是这些规律的展示和执行。

基因是遗传信息和生物体结构与功能的基础，对于细胞、组织、器官、个体、群体的形成、发育、生长、适应、代谢、进化等均有着至关重要的作用。

通过基因的准确描述和塑造，可以探究生命本身的特征，揭示生命存在的法则，从而推进生命科学的研究。

在过去的几十年中，越来越多的研究者开始了解到，基因研究的突破性进展往往来自于模型生物的研究。

模式生物是指在进行基础生物学研究时所使用的生物种群，通常具备以下特点：生长快、生育期短、相对小型、遗传学易、基因组小、适应性强、工作形成成熟。

二、研究方法作为模式植物的拟南芥基因功能研究，其研究方法主要分为以下三种：遗传学、分子学和生理学。

1. 遗传学方法遗传学方法主要包括突变体筛选、遗传连锁分析、分子标记分析、基因克隆和功能验证等关键步骤。

其中最重要的是突变体筛选，拟南芥突变体可分为自然突变体和人工突变体两类。

自然突变体指自然发现的具有不同性状的拟南芥个体，而人工突变体则是透过人工施加物质、辐射等诱变因子，诱导拟南芥作出基因水平上的变化的植株。

通过突变体筛选，可以筛选出具有特定性状并带有单个基因突变的突变体，以便进一步分析所筛选的基因的功能。

2. 分子学方法分子生物学方法是一种在基因水平上分析拟南芥基因功能的方法。

主要包括基因克隆、分子检测和基因表达等关键步骤。

基因克隆是将目标基因从其天然环境中提取出来，并将其插入到载体中，以便在体内或体外进行分析和操作。

本科生文献综述题目拟南芥突变体的筛选综述系别林学与园艺学院班级园艺102班姓名唐辉学号103231228答辩时间年月新疆农业大学林园学院拟南芥突变体的筛选综述唐辉指导老师：王燕凌摘要：本文归纳了拟南芥抗旱、抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐、晚花突变体筛选的研究内容。

在拟南芥抗旱突变体筛选中将用到甘露醇模拟干旱胁迫来进行试验。

在抗氧化、耐低钾、耐硒中将用到Na2SeO3、钾、硒、NaCl等化合物或者化学元素对拟南芥突变体的生长发育影响来进行拟南芥突变体的筛选。

概括了拟南芥突变体在甘露醇模拟干旱中的生长影响以及拟南芥突变体在抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐等逆境环境中生长研究方面的观点。

总结了拟南芥突变体在先如今人们研究中常用的几种筛选方法，指出了拟南芥突变体筛选的研究需求，并提出筛选拟南芥抗逆突变体的重要意义。

关键词：拟南芥；突变体；筛选；研究Screening Summary of Arabidopsis MutantsTang Hui Instructor:Wang YanlingAbstract: This paper summarizes the Arabidopsis drought, oxidation resistance, low potassium, selenium-resistant, salt, late-flowering mutants creening research.And detailed exposition of the various materials and processes Arabidopsis mutants creening methods needed in the screening process.In the anti-oxidation, anti-potassium, selenium resistance will be used Na2SeO3, potassium, selenium, NaCl chemical elements or compounds such mutations affect thegrowth and development of the body to be screened Arabidopsis thaliana mutants.Thus summarizes the growth of Arabidopsis mutants mannitol and simulated drought in Arabidopsis mutants in anti-oxidation, anti-potassium,selenium resistance point of view, salt and other adverse environments grow research.Arabidopsis mutants summarized earlier research that people now commonly used inseveral screening methods, pointed out the Arabidopsis mutant screening research needs and the importance of screeningproposed resilience of Arabidopsis mutants.Key words: Arabidopsis；Mutant；Filter；Research拟南芥（Arabidopsis）为十字花科(Cruciferous)、拟南芥属（Brassicaceae、Arabidopsis）一年生或二年生的细弱草本植物。