QiaGen粪便DNA提取试剂盒中文说明书

QIAampDNAMiniKitprotool（中文版）组织样品DNA的提取(QIAamp DNA Mini Kit)实验前注意：样品保持于室温（15-25℃）准备好水浴两组：一组56℃用于步骤3，一组70℃用于步骤5步骤11中用于洗脱的Buffer AE和蒸馏水保持于室温（15-25℃）Buffers AW1 and AW2按照17页说明准备如果Buffer ATL或AL中有沉淀形成，则于56℃中水浴以溶解之具体步骤：1.切割组织样品。

应少于25mg（脾组织则少于10mg）。

DNA产量与组织类型和大小有关。

一般，1mg组织可得到大约0.2-1.2μg的DNA。

2.（剪碎）将剪成尽量小的碎块，置于2ml离心管中，加入180μl Buffer ATL。

（研磨）将25mg组织置于液氮中，充分研磨后倒入2ml 离心管中，加入180μl Buffer ATL。

此过程中，液氮可以挥发，但组织不能融化。

（匀浆处理）将25mg组织置于2ml离心管中，加入不超过80μl 的PBS，匀浆器处理。

加入100μl Buffer ATL。

Buffer ATL不稀释时，推荐（研磨）。

3.加入20μl proteinase K，振荡处理20s，56℃水浴至组织完全裂解。

proteinase K必须使用，因为QIAGEN Protease在Buffer ATL 存在的情况下活性已降低。

裂解时间视组织块大小而定，通常1-3h即可完全裂解。

过夜处理是合理的，无不良影响。

为保证裂解效率，应使用振荡水浴或者振荡台。

4.短时离心，以去除离心管盖内沿液体。

5.加入200μl Buffer AL，振荡15S，70℃水浴10min。

短时离心，以去除离心管盖内沿液体。

加入Butter AL后，可能会产生白色沉淀物，70℃水浴中大都可以溶解。

这些沉淀物对于抽提过程和后续实验没有影响。

6.加入200μl乙醇（96%-100%），振荡15s，短时离心，以去除离心管盖内沿液体。

组织样品DNA的提取(QIAamp DNA Mini Kit)实验前注意：⏹样品保持于室温（15-25℃）⏹准备好水浴两组：一组56℃用于步骤3，一组70℃用于步骤5⏹步骤11中用于洗脱的Buffer AE和蒸馏水保持于室温（15-25℃）⏹Buffers AW1 and AW2按照17页说明准备⏹如果Buffer ATL或AL中有沉淀形成，则于56℃中水浴以溶解之具体步骤：1.切割组织样品。

应少于25mg（脾组织则少于10mg）。

DNA产量与组织类型和大小有关。

一般，1mg组织可得到大约0.2-1.2μg的DNA。

2.（剪碎）将剪成尽量小的碎块，置于2ml离心管中，加入180μl Buffer ATL。

（研磨）将25mg组织置于液氮中，充分研磨后倒入2ml离心管中，加入180μl Buffer ATL。

此过程中，液氮可以挥发，但组织不能融化。

（匀浆处理）将25mg组织置于2ml离心管中，加入不超过80μl的PBS，匀浆器处理。

加入100μl Buffer ATL。

Buffer ATL不稀释时，推荐（研磨）。

3.加入20μl proteinase K，振荡处理20s，56℃水浴至组织完全裂解。

proteinase K必须使用，因为QIAGEN Protease在Buffer ATL存在的情况下活性已降低。

裂解时间视组织块大小而定，通常1-3h即可完全裂解。

过夜处理是合理的，无不良影响。

为保证裂解效率，应使用振荡水浴或者振荡台。

4.短时离心，以去除离心管盖内沿液体。

5.加入200μl Buffer AL，振荡15S，70℃水浴10min。

短时离心，以去除离心管盖内沿液体。

加入Butter AL后，可能会产生白色沉淀物，70℃水浴中大都可以溶解。

这些沉淀物对于抽提过程和后续实验没有影响。

6.加入200μl乙醇（96%-100%），振荡15s，短时离心，以去除离心管盖内沿液体。

加入乙醇后，可能会产生白色沉淀物。

QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi KitCatalog numbers 12362 室温下15-25度存放2年。

在开始之前作如下准备1）按照说明把RNase A加到Buffer P1 中，混匀，放到2-8度储存。

选作：按照1:1000的比例把LyseBlue 加到Buffer P12）pre-chill Buffer P3 4°C存放。

3）检查Buffer P2 是否有SDS沉淀物，可以放到37℃短暂温热以便溶解分子沉淀物。

4）准备异丙醇。

5）用试剂盒提供的无内毒素的水中加入40ml的96-100%的酒精。

大量质粒提取过程在LB培养基中种植转化的E.coli菌。

使用100ml（高复制数的质粒）或者250ml（低复制数的质粒）过夜培养。

操作步骤如下1.收获LB培养过夜的细菌，在6000g，4℃条件下离心15min。

2.加入10ml Buffer P1（根据SBI要求加倍，用20ml）重悬细菌。

3. 加10ml Buffer P2（根据SBI要求加倍，用20ml），剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室温放置5min。

如果使用了LyseBlue试剂，溶液应该变成均匀蓝色。

4.在孵育期间，打开针口的密封盖.并把过滤器放到合适的架子上。

5.加入10ml冰浴的Buffer P3（根据SBI要求加倍，用20ml）到此溶菌产物中，剧烈晃动离心管4-6次使其混匀。

如果加入了LyseBlue试剂，混匀试剂直到没有颜色。

6.将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min，不要插入活塞。

打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml离心管中。

7. 加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min。

8.将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管中溶液通过重力滴下排空。

9.将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下。

质粒DNA中提方法（QIAfilter midi kit 25）适用于100 微克的高质粒或粘粒DNA，使用QIAfilter注射器样元件代替常规离心法以清除细菌裂解物。

低拷贝质粒，加入氯霉素放大后应视为高拷贝。

为质粒选择适当的培养体系。

在开始之前的注意事项■如果是低拷贝，最好增加裂解buffer的用量，以提高裂解效率，裂解缓冲卷，从而增加DNA 产量。

■可选：删除样品的步骤用符号表示☞为监测分析凝胶（见第34 页）的过程。

■加入buffer P3后，样品不再需要冰浴。

在开始之前做的东西■把提供的RNase A 添加到buffer P1 中。

一瓶RNase A (使用之前简要地离心）加入一瓶buffer P1 ，终浓度为100 ug/ml。

■检查buffer P2 是否由于低温存储产生SDS沉淀。

如有必要，37 ° C下使SDS溶解。

.■在4 °C预冷buffer P3。

■可选：使用前将提供的LyseBlue 试剂添加到buffer P1 混合。

每个buffer P1 瓶加入一小瓶LyseBlue （在使用之前简要离心），达到1: 1000 稀释。

LyseBlue 可以提供视觉识别从而防止常见处理错误，如细胞裂解导致效率低下和不完全沉淀的SDS、基因组DNA污染、细胞碎片等。

过程1.摇菌：新鲜划线的选择性平板（接种含有适当的选择性抗生素）挑一个单菌落放入2-5 ml LB 培养基中。

在37 ° C 摇菌约8 h （约300 rpm）。

使用4倍体系容积的试管或锥形瓶。

2.稀释选择性LB 培养基1/500 -1/1000。

若为高拷贝质粒，接种到25 毫升或● 100毫升的介质具有▲ 25—50 µ l 或● 100 – 200 µ l 起始培养液。

若为低拷贝质粒，接种▲ 50 — 100 毫升或● 250 毫升的介质具有▲ 100 – 200 µ l 或● 250-500 µ l 起始培养基。