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LPS诱导小鼠急性肺损伤TLR4及TNF―α表达

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LPS诱导小鼠急性肺损伤TLR4及TNF―α表达【摘要】目的：研究脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性肺损伤机制。

方法：实验分为正常对照组、模型组及抗体组；正常对照组小鼠腹腔腔内注射等量0.9%NaCl。

模型组腹腔内注射LPS（4 mg/kg）。

抗体组在造模前8～10 h，应用小鼠Toll样受体4/髓样分化蛋白2（TLR4/MD2）复合物抗体腹腔内注射50 μg。

各组均在造模5 h后留取血和肺组织，采用细菌内毒动态浊度法检测血浆LPS的含量，HE染色判定小鼠肺组织病理变化，RT-PCR测定小鼠肺组织TLR4基因表达，Western-blot测定TLR4蛋白表达；ELISA检测小鼠血清中TNF-α的水平。

结果：和正常对照组比较，模型组及抗体组小鼠血浆内毒素含量显著升高（P<0.05），模型组小鼠肺组织HE染色呈ALI表现；和模型组比较，抗体组TLR4 mRNA、蛋白及TNF-α的表达明显下调（P<0.05）。

结论：急性肺损伤机制可能与LPS和TLR4受体结合介导TNF-α信号途径相关。

【关键词】脂多糖；急性肺损伤； Toll样受体4；肿瘤坏死因子-αExpression of Toll Like Receptor 4 and TNF-α on Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide inMice/GU Zhi-long，JIANG Hua-mao，HU Zhan-sheng.//Medical Innovation of China，2015，12（24）：016-019【Abstract】 Objective：To study mechanism of acute lung injury induced by lipopolysaccharide in mice.Method：The mice were randomly divided into normal control group， model group and antibody group.Control group was given 0.9%NaCl. Model group of acute lung injury was induced by LPS at a dose of 4 mg/kg. Aitibody group mice were given anti-TLR4/MD antibody（50 μg）before 8-10 h of building model group. Blood and lung tissue were taken after modeling in 4 hours. A mount of endotoxin in plasma was measured by kinetic turbidimetric assay.Degree of lung damage was grated by HE staining. Expressions of TLR4 at both mRNA and protein levels were measured by RT-PCR and Western Blot.Content of TNF-α in mice serum was detected by ELISA.Result：Compared with the control group，endotoxin in serum，in model group and ayibody group significantly increased（P<0.05），with obvious ALI lung damages in model pared with the model group，antibody group presented that expression of TLR4 mRNAand protein lower regulated（P<0.05） and ELISA results of TNF-αsignificantly decreased （P<0.05）.Conclusion：The mechanism of acute lung injury induced by lipopolysaccharide may be related to TLR4 signal passway that mediates the TNF-α level.【Key words】 Lipopolysaccharide； ALI； Toll like receptor 4； TNF-αFirst-author’s address：The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，Chinadoi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.24.006 急性肺损伤（Acute Lung Injury，ALI）是在创伤、重症感染、休克等等非心源性疾病过程中，肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞损伤造成的弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭[1]；脂多糖（LPS）诱导的ALI在重症感染后早期出现[2]，并且死亡率较高[3]。

Toll like receptors（TLRs）家族和先天性免疫系统关系比较密切[4]，其中TLR4目前研究最多，是LPS受体[5]。

本实验基于建造小鼠内毒诱导ALI[6-7]，深入探讨ALI、LPS 和TLR4及TNF-α之间的关系及损伤机制，并可能为临床ALI 的预防和治疗提供实验基础和新方法。

1 材料与方法1.1 主要材料、仪器及试剂 DNA marker（大连宝生物）和引物（大连宝生物），梯度PCR仪器（德国Biometre公司），超净工作台（苏州净化设备厂），DU800核算蛋白分析仪（德国BECKMAN COULTER公司），半干式转膜仪，辣根标记羊抗兔二抗（北京中杉金桥）兔抗小鼠TLR4抗体（SANTA），DNA 及蛋白maker（大连宝生物），引物（大连宝生物）。

1.2 方法1.2.1 实验动物及分组 SPF级别的BALB/C雄性小鼠，体重30～35 g，随机分成3组，每组10只，A组为正常对照组，不作任何处理；B组为急性肺损伤模型组：腹腔内注射给予LPS（4 mg/kg）腹腔内注射制备ALI模型；C组为抗体组：建造ALI模型前8～10 h给予TLR4/MD腹腔内注射（50 μg）。

在建造模型成功后各组小鼠无菌条件下取出肺组织和取小鼠血检测内毒素及TNF-α水平，一部分肺组织置于液氮冷冻后，在-80 ℃冰箱保存，为mRNA及蛋白表达的检测，另外部分放置在4%多聚甲醛内固定24 h后，HE染色镜下观察小鼠肺组织形态改变。

1.2.2 实验指标检测及试验方法1.2.2.1 小鼠血内毒素含量检测选用试剂盒（动态浊度法-血浆内毒素检测试剂）的处理方法和步骤，处理血标本，并应用LPS监测分析得出检测数据。

1.2.2.2 小鼠肺组织HE染色及形态改变 4%多聚甲醛中固定，浸润、经过梯度脱水，透明化处理（二甲醛），石蜡包埋处理，各组切片6张，厚度约7 μm，HE染色后，光学显微镜下观察形态及病理变化；损害评分标准应用Gloor等[8]方法。

1.2.2.3 小鼠肺组织TLR4基因表达按照TAKALA说明书进行提取总RNA。

TLR4基因表达：通过分光光度仪测RNA280 nm/260 nmOD值，立即开始进行逆转录，合成cDNA，引物序列（TLR4），上游5’-CCCTGAAAGGCTTGGTCT-3’；下游3’-GAGGTGTCHHTHHTCTAA-5’，扩增产物长度268 bp；引物序列（β-actin），上游5’-AGGCATACAGGGACAGCA-3’；下游3’-TACAGCAGGGTCAACCATTG-5’，扩增产物长度534 bp。

反应体系：10×RT Buffer 1 μL，MgCl2 2 μL，AMV 逆转录酶 0.5 μL，RNase Inhibitor 0.25 μL，Oligo dT 0.5 μL，RNase FREE dH2O 3.75 μL，dNTP Mixture 1 μL，Total RNA 1 μL。

反应条件：32 ℃ 9 min，49.2 ℃ 32 min，97 ℃ 4 min，4 ℃ 4 min。

cDNA为模板PCR扩增，反应体系：5×PCR Buffer 10 μL，MgCl2 2 μL，dNTP Mixture 1 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，H2O 32.75 μL，Taq酶 0.25 μL；反应条件：96 ℃6 min、（95 ℃ 30 s、49.2 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s）33 cycle、72 ℃9 min。

1.2.2.4 小鼠肺组织TLR4蛋白表达取小鼠肺组织进行总蛋白的提取，提取后用BCA法进行蛋白含量的检测，检测后进行PAGE凝胶电泳，电泳分离60 min后，通过maker条带选取约95 kd大小切胶，应用半干转膜方法，封闭60 min，经过一抗、二抗孵育，ECL显色，暗室内曝光，Tannon Gis 软件分析测曝光底片光密度值。

1.2.2.5 小鼠血浆TNF-α双抗夹心ELISA检测通过应用ELISA检测TNF-α试剂盒方法与流程进行标本处理及检测，并在酶标仪进行检测分析。

1.3 统计学处理应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，各组的均数采取单因素方差分析，组间进行两两比较LSD检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果2.1 建模小鼠情况各组小鼠观察情况如下：A组无死亡小鼠，B组小鼠攻毒后最初仅异常活动增多，随后出现蜷缩、抱团现象，刺激无反应，不能进食、水，腹部呼吸频率快，死亡1只；C组小鼠变化同A组。

2.2 LPS含量检测和A组比较，B组（模型组）LPS水平显著升高，C组LPS水平也呈现升高趋势，建模成功，见表1、图1。

表1 各组小鼠血浆内毒素水平组别只数（只） LPS水平（EU/mL）A组 10 6±0.89B组 9 1230±10.38*C组 10 1003±12.49**与A组比较，P<0.05图1 各组小鼠血浆内毒素水平2.3 小鼠肺组织HE染色镜下观察小鼠攻毒造模后，镜下肺泡水肿及腔内红染，肺泡间隔增厚并充血，视野可见大量中性粒细胞浸润。

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右美对内毒素性肺损伤大鼠肺组织TLR4表达影响

右美对内毒素性肺损伤大鼠肺组织TLR4表达影响

右美托嘧啶对脂多糖诱导急性肺损伤大鼠肺巨噬细胞TLR4表达影响急性肺损伤（ALI）是重症监护病房最主要的死亡原因之一。

脂多糖（LPS）致急性肺损伤主要是激活NF-κB释放大量炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等所致。

既往研究表明，右美托咪定能抑制炎症因子产生减轻内毒素诱导的大鼠急性肺损伤[1]。

TLR4是LPS靶细胞膜上的跨膜受体，主要介导LPS信号的跨膜转导，引起下游炎症反应[2]。

右美托嘧啶能否影响肺组织TLR4表达尚不可知，本研究拟探讨右美托嘧啶对内毒素性急性肺损伤大鼠肺组织TLR4表达的影响，进一步探讨其减轻肺损伤的可能机制。

1资料与方法1.1动物选择及分组健康清洁级成年雄性SD大鼠30只，10-14周龄，体重250-300g，由中徐州学院动物中心提供。

采用随机数字表法，将大鼠随机分为3组(n=10)，对照组(C组)：腹腔和尾静脉均注射生理盐水1 ml/k，急性肺损伤组(ALI组)：腹腔注射生理盐水1ml/kg，30 min后经尾静脉注射LPS(Sigma,L2880) 5 mg/kg,，急性肺损伤+右美托咪啶组(ALI+D组)：腹腔注射生理盐水1ml/kg，30 min后经尾静脉注射LPS(Sigma,L2880) 5 mg/kg。

1.2细胞培养参照既往文献，每只大鼠静脉注射生理盐水或LPS后 6 h后处死后即行气管插管，用冰D-Hank液50ml分次灌洗双肺，回收灌洗液后立即离心（3000g，10min，4℃）,离心后沉淀物用生理盐水3ml漂洗3次，用1640培养液4ml重悬置孵育箱37℃、5%CO2孵育2h，倒去培养液后用生理盐水3ml漂洗3次，吸去上清液，再用1640培养液4ml重悬后孵育12h，轻轻吸去培养液，倒置显微镜下计数巨噬细胞大致为1.2.RT-PCR法检测TLR4：取液氮中保存的肺组织100 mg，采用Trizol提取组织总RNA。

每份标本取等量的RNA逆转录酶，按试剂盒说明操作合成cDNA及PCR扩增。

槐定碱与TLR4／MD—2阻断剂对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞TLR4—NF—κB—TNF

槐定碱与TLR4／MD—2阻断剂对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞TLR4—NF—κB—TNF

槐定碱与TLR4／MD—2阻断剂对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞TLR4—NF—κB—TNF—α通路的影响目的：研究槐定碱及TLR4/MD-2阻断剂对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞TLR4-NF-κB-TNF-α通路的影响，探讨其抗内毒素的药理机制。

方法：培养RAW264.7巨噬细胞，分为5组：空白对照组，LPS模型组，槐定碱+LPS组，TLR4/MD-2阻断剂+ LPS组，TLR4/MD-2阻断剂+槐定碱+LPS组，各组分别于处理完毕后120 min时收集细胞及细胞培养液。

Western blot检测TLR4蛋白表达，免疫细胞化学检测NF-κB 蛋白的分布与表达，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测NF-κB，TNF-α mRNA 表达，放射免疫分析法检测细胞培养液中TNF-α含量。

结果：与LPS模型组比较，槐定碱+LPS组TLR4蛋白，NF-κB mRNA与NF-κB 入核率，TNF-α mRNA 及培养液中TNF-α含量均显著降低（P＜0.01）；TLR4/MD-2阻断剂+ LPS组与TLR4/MD-2阻断剂+槐定碱+LPS组NF-κB mRNA 及NF-κB入核率，TNF-α mRNA 及培养液中TNF-α 含量均低于LPS模型组（P ＜0.01），接近空白对照组，但2组之间上述各值的差异均无统计学意义。

结论：TLR4/MD-2可能是槐定碱作用的靶位之一，槐定碱抑制TLR4-NF-κB-TNF-α通路活化可能是其抗内毒素机制之一。

标签：槐定碱；TLR4/MD-2阻断剂；LPS；RAW264.7巨噬细胞；TLR4脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），亦称内毒素，是革兰阴性菌（G-）细胞壁外膜上的主要病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP），TLR4是LPS的主要模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）[1-2]。

LPS诱导鼠急性肺损伤模型的评价分析

LPS诱导鼠急性肺损伤模型的评价分析

LPS诱导鼠急性肺损伤模型的评价分析急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是通过干扰与肺泡毛细血管屏障有关的临床急危重症。

过去由于对ALI和ARDS机制研究不清、临床上没有针对性治疗方法，导致疾病的死亡率很高。

近年来，随着利用脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）创建ALI动物模型实验的研究的不断深入，在ALI模型的建立及其机制方面有了较新的进展，新的研究指导临床有望降低ALI和ARDS的死亡率。

本文对LPS诱导鼠急性肺损伤不同模型进行评价分析，以便广大研究者对急性肺损伤动物模型建立和研究提供进一步认识，为前临床研究提供动物实验基础。

目前，在已發表通过对急性肺损伤动物模型的实验研究中，研究人员发现活化多形核白细胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）在肺组织内的聚集的现象，在ALI和ARDS的发展中发挥关键作用[1-2]。

然而PMN移动到肺部不同部位引起ALI和ARDS的原理尚未完全阐明。

目前用于研究PMN与ALI和ARDS 的关系主要方法为在LPS诱导下复制肺损伤鼠模型[3-4]，来阐明LPS刺激对化学引诱物的反应增加炎症部位的PMN迁移的作用。

虽然单独使用LPS没有预先考虑存在的疾病、液体复苏或机械通气等客观条件的存在[5-6]，无法反映整体人类疾病的复杂性，但是通过对鼠肺损伤模型过程的，能够在一定程度上反映模拟体内ALI和ARDS的病理生理状态[7]，为前临床研究提供研究思路。

本文就LPS 急性肺损伤模型建立总结和分析，为前临床研究提供动物实验基础提供合适的参考。

1 LPS诱导下复制肺损伤机制内毒素模型的基础：LPS是一种糖脂，是存在于组成革兰氏阴性细菌的外膜中的极性脂质头组（脂质A）和链重复二糖[8]。

LPS大多数的生物学效应是由脂质A复制的，即使存在或不存在寡糖O抗原的影响。

牛磺酸对LPS诱导小鼠急性肺损伤的治疗效果

牛磺酸对LPS诱导小鼠急性肺损伤的治疗效果

牛磺酸对LPS诱导小鼠急性肺损伤的治疗效果急性肺损伤（ALI）是一种常见的危重症，其主要表现为肺泡上皮细胞损伤、间质水肿和炎症细胞浸润，导致气体交换功能障碍。

近年来，一些研究表明牛磺酸具有抗氧化、抗炎和细胞保护作用，可能对ALI具有治疗效果。

本文将探讨牛磺酸对LPS诱导小鼠急性肺损伤的治疗效果。

一、急性肺损伤的机制急性肺损伤是一种复杂的疾病，其发病机制涉及多种因素。

LPS（细菌内毒素）是一种常见的急性肺损伤模型诱导剂，其通过激活Toll样受体4（TLR4）途径，引起炎症因子释放，破坏肺泡屏障，导致肺损伤。

研究发现，LPS诱导的肺损伤模型能够模拟ALI的病理过程，被广泛应用于急性肺损伤的研究中。

在LPS诱导的急性肺损伤中，炎症反应和氧化应激是主要的病理生理过程。

炎症反应引起炎症因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α）的释放和炎症细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞）的浸润，导致肺组织损伤。

氧化应激则导致细胞内自由基的产生增加，造成肺泡上皮细胞和内皮细胞的损伤，加剧肺损伤的程度。

二、牛磺酸的生物学作用牛磺酸是一种氨基磺酸，是一种必需的营养物质，在机体中具有多种生物学功能。

研究表明，牛磺酸具有抗氧化、抗炎和细胞保护作用，能够保护肝脏、肾脏、心脏等器官免受损伤。

在肺损伤模型中，牛磺酸能够通过抑制炎症因子的释放、减少氧化应激、保护肺泡上皮细胞和内皮细胞等途径，发挥保护作用。

研究人员使用LPS诱导小鼠急性肺损伤模型，将小鼠分为对照组、LPS组、牛磺酸治疗组。

实验结果显示，与LPS组相比，牛磺酸治疗组小鼠肺组织病理学损伤程度减轻，肺泡充填物减少，间质水肿减轻，炎症细胞浸润减少。

牛磺酸治疗组小鼠肺组织中炎症因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α）的表达水平显著降低，氧化应激指标（如丙二醛、超氧化物歧化酶活性）得到改善。

进一步的实验结果表明，牛磺酸能够通过调节TLR4途径，抑制炎症因子的释放，减轻氧化应激，保护肺泡上皮细胞和内皮细胞，发挥保护作用。