㊃论 著㊃D O I 10 3760 c m a ji s s n 1673-436X 2018 15 011作者单位:510120广州医科大学附属第一医院 广州呼吸疾病研究所 呼吸疾病国家重点实验室通信作者:王健,E m a i l j i a n w a n g1986@y a h o o c o m 香烟暴露所致后代支气管肺发育不良大鼠模型的建立及鉴定金颖康 张抗抗 张晨婷 陈豫钦 王健 卢文菊ʌ摘要ɔ 目的 建立一种香烟烟雾暴露的支气管肺发育不良(B P D )模型㊂方法 雌雄性S D 大鼠合笼后随机分为正常对照组和香烟烟雾暴露组各2组,香烟烟雾暴露组的母鼠放置在熏烟装置进行全身暴露,每次1h,每日2次;待幼鼠出生后改为整笼全身暴露1h ,每日1次;烟熏过程中监测烟雾中的总颗粒浓度,每次10m i n ,持续监测烟雾中的O 2㊁C O ㊁C O 2浓度;正常对照组正常饲养,不予任何干预㊂记录造模过程中幼鼠的体质量增长㊁死亡率㊂在幼鼠日龄14d 时处死,取肺组织,留取支气管肺泡灌洗液(B A L F )分析细胞分类计数,H E 染色观察肺组织形态学改变,W e s t e r nb l o t 分析B P D 标志蛋白血管内皮生长因子(V E G F )㊁α7-烟碱型乙酰胆碱受体(α7-n A C h R )表达㊂结果 香烟烟雾暴露组幼鼠体质量明显低于正常对照组(P <0 05),死亡率高于正常对照组㊂造模结束时香烟烟雾暴露组肺内的中性粒细胞和巨噬细胞明显升高(P 值均<0 01);肺组织出现肺泡腔变大,部分肺泡融合㊁肺泡间隔断裂增厚等表现㊂与正常对照组比较,香烟烟雾暴露组肺组织放射状肺泡计数减小,平均肺泡内衬间隔增加,V E G F 蛋白表达水平明显降低,α7-n A C h R 表达升高(P 值均<0 05)㊂结论 孕期及后代香烟烟雾暴露所致肺部损伤符合B P D 病理表现,可以作为一种动物模型研究香烟暴露所致婴儿B P D 的致病机制㊂ʌ关键词ɔ 支气管肺发育不良;孕期;香烟烟雾暴露;模型基金项目:广州市人社局博士后科研启动项目(2014-2017)Ar a tm o d e l o fb r o n c h o p u l m o n a r y d y s p l a s i a i n d u c e db y c i g a r e t t es m o k ee x po s u r e J i nY i n g k a n g Z h a n g K a n g k a n g Z h a n g C h e n t i n g C h e n Y u q i n W a n g J i a n L u W e n j u T h e F i r s t A f f i l i a t e d H o s p i t a lo f G u a n g z h o u M e d i c a lU n i v e r s i t y G u a n g z h o uI n s t i t u t e o f R e s p i r a t o r y D i s e a s e s S t a t eK e y L a b o r a t o r y o f R e s p i r a t o r y D i s e a s e s G u a n gz h o u510120 C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r W a n g J i a n E m a i l j i a n w a n g1986@y a h o o c o m ʌA b s t r a c t ɔ O b je c t i v e T oe s t a b l i s ha m o d e lo fb r o n c h o p u l m o n a r y d y s p l a s i a B P D i n d u c e db y c i g a r e t t e s m o k e e x p o s u r e M e t h o d s Af t e rm a t e dw i t h m a l eS Dr a t s f e m a l er a t sw e r er a n d o m l y di v i d e d i n t ot w o g r o u p s c o n t r o l g r o u p a n d c i g a r e t t e s m o k e e x p o s u r e g r o u p E x p o s u r e g r o u p we r e p u ti nf u m ig a t i o nd e v i c e f o r o n eh o u r t wi c e d a i l y u n t i l t h e p u p sw e r e b o r nw h i c hw e r e e x p o s e d f o r o n e h o u r o n c e d a i l y T h e t o t a l p a r t i c l e c o n c e n t r a t i o nw a sm o n i t o r e dd u r i n g e x p o s u r e f o r t e n m i n u t e se a c ht i m e a n dt h e c o n c e n t r a t i o n s o fO 2 C O a n d C O 2i nt h es m o k e w e r ec o n t i n u o u s l y m o n i t o r e d C o n t r o l g r o u p w a sf e d w i t h o u t a n y i n t e r v e n t i o n W e i g h t a n d m o r t a l i t y r a t eo f p u p sw e r e r e c o r d e d A t t h e 14t hd a y p u p s 'l u n gs w e r e c o l l e c t e da n dc e l l c o u n tw a s m a d e i nt h eb r o n c h o a l v e o l a r l a v a g ef l u i d B A L F H e m a t o x y l i na n d e o s i n H E s t a i n i n g w a s p e r f o r m e d t o o b s e r v e t h em o r p h o l o g i c a l c h a n g e s o f t h e l u n g s T h e e x p r e s s i o n s o f v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r V E G F a n dn i c o t i n i c a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r a l ph a 7 α7-n A C h R w e r e a n a l y z e db y W e s t e r nb l o t R e s u l t s T h eb o d y w e i g h t o f c i g a r e t t e s m o k e e x p o s u r e g r o u p w a s s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a nt h a to fc o n t r o l g r o u p P <0 05 a n dt h e m o r t a l i t y r a t e w a sh i gh e rt h a nt h a to fc o n t r o l g r o u p C o m p a r e dw i t hc o n t r o l g r o u p t h en u m b e r o f n e u t r o p h i l a n dm a c r o p h a ge i nB A L F i n c r e a s e d a l l P <㊃6611㊃国际呼吸杂志2018年8月第38卷第15期 I n t JR e s p i r ,A u gu s t 2018,V o l .38,N o .15Copyright ©博看网. All Rights Reserved.001H Es t a i n i n g s h o w e d a l v e o l a r f u s i o n a l v e o l a r s e p t a l t h i c k e n i n g r a d i c a l a l v e o l a r c o u n t d e c r e a s e d a n d m e a n l i n e a r i n t e r c e p t i n c r e a s e d a l l P<005W e s t e r nb l o t s h o w e dV E G Fe x p r e s s i o nd e c r e a s e da n dα-7n A C h Re x p r e s s i o ni n c r e a s e d a l l P<005i nc i g a r e t t es m o k ee x p o s u r e g r o u p C o n c l u s i o n s T h e p a t h o l o g i c a lm a n i f e s t a t i o n s c a u s e db y c i g a r e t t e s m o k e e x p o s u r ed u r i n gp r e g n a n c y a n d p o s t n a t a l s t a g e a r e c o n s i s t e n tw i t hB P D w h i c hc a nb eu s e da sa na n i m a lm o d e l t os t u d y t h e m e c h a n i s m o fB P Di ni n f a n t s e x p o s e d t o c i g a r e t t e s m o k eʌK e y w o r d sɔ B r o n c h o p u l m o n a r y d y s p l a s i a P r e g n a n c y C i g a r e t t e s m o k i n g e x p o s u r e M o d e lF u n d p r o g r a mG u a n g z h o u M u n i c i p a lH u m a n R e s o u r c e sa n dS e c u r i t y B u r e a u P o s t d o c t o r a lS t a r t u p F u n d2014-2017支气管肺发育不良(b r o n c h o p u l m o n a r y d y s p l a s i a,B P D)是发生在新生儿尤其是早产儿的慢性肺部疾病,其病变以肺泡融合㊁数量减少㊁血管丛减少和血管增厚为特征㊂B P D是28周之前出生的早产儿第二大死因[1]㊂烟草危害是当今世界最严重的公共问题之一,大量证据表明吸烟可导致多部位恶性肿瘤及呼吸系统㊁心血管系统㊁泌尿生殖系统等多系统慢性疾病,导致生殖发育异常,还与其他健康问题的发生密切相关㊂孕期暴露在各种化学物质和环境毒素将会对胎儿肺发育和功能造成不同程度损伤,孕期吸烟相关的胎儿肺部并发症发生率可高达30%以上㊂流行病学调查和动物实验研究结果显示孕期香烟暴露可直接影响后代的肺部健康,同样也是导致儿童B P D的独立危险因素,而儿童时期B P D的发生与成人时期发生C O P D有直接关联[2-4]㊂通过详细研究香烟烟雾暴露所致B P D 的发病机制㊁病理生理过程,有助于提高社会对香烟烟雾暴露危害的认识和警惕,找到有效干预手段㊂因此,通过建立大鼠孕期香烟烟雾暴露所致后代B P D模型进行疾病研究是一种切实有效的方法㊂由于孕期香烟烟雾暴露是导致后代B P D的独立危险因素,用孕期母鼠及后代熏烟法建立B P D 模型符合此类疾病的病理生理过程,是研究香烟烟雾所致B P D最理想的建模方法㊂目前国内单独采用孕鼠香烟烟雾暴露建立B P D模型未见报道㊂在此次模型制造中,采用孕期及哺乳期母鼠及其后代香烟烟雾暴露方法建立幼鼠B P D模型,经鉴定符合B P D的病理表现,详细步骤如下㊂1材料与方法11材料选用体质量200~350g的6~8周龄S P F级健康雌雄S D大鼠60只(雌雄比2ʒ1),购自广东省医学实验中心[许可证号:S C X K(粤) 2013-0002]㊂P A B-S200被动吸烟装置,P-5L2C数字型粉尘仪(检测烟雾浓度),美国T I S空气颗粒物检测仪(检测可吸入颗粒),红梅牌香烟(焦油量13m g,烟碱量13m g),血管内皮生长因子(v a s c u l a re n d o t h e l i a l g r o w t hf a c t o r,V E G F)抗体㊁α7-烟碱型乙酰胆碱受体(n i c o t i n i c a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o ra l p h a7,α7-n A C h R)抗体购自A b c a m公司(a b46154㊁a b208641)㊂12造模方法雌雄S D大鼠按照2ʒ1比例合笼,合笼后连续3d阴道涂片观察有无交配痕迹,将有交配痕迹的雌鼠单独放置,并随机分为正常对照组和香烟烟雾暴露组各2组(共4组,每组10只),1周以后阴道出血判定为流产㊂香烟烟雾暴露组放置在熏烟装置进行全身暴露,每次1h(烟气比约为5%)烟熏,每天2次,熏烟装置中,每周6d相当于怀孕妇女每天接受1h的香烟烟雾暴露,作为香烟烟雾暴露模型;幼鼠出生连同母鼠继续烟雾暴露,每天1次,直至幼鼠日龄14d取材(当天不熏烟),烟熏过程中监测烟雾中的总颗粒浓度,每次10m i n,持续监测烟雾中的O2㊁C O㊁C O2浓度㊂对照模型在相同的正常环境中喂养,不加任何干预㊂孕期母鼠称重,崽鼠生后当天称重(每窝称重后减去母鼠体质量计算平均值),之后隔天称重计算平均值㊂13实验方法131肺组织病理标本采集及染色部分幼鼠在出生14d麻醉后开胸取幼鼠肺组织,20c mH2O (1c mH2O=0098k P a)压力下4%多聚甲醛灌注肺组织充盈后再次放入4%多聚甲醛固定,乙醇梯度脱水,石蜡包埋切片,进行H E染色观察肺组织损伤程度㊂肺组织切片H E染色,显微镜下观察放射状肺泡计数:每组各取10张切片,每张切片随机取10个视野,计算平均值㊂平均肺泡内衬间隔:随机选取2组肺组织,20倍镜下在同一水平线,每张切片随机选取8个视野,测量时避开支气管及血管,在每个视野正中心划 十 字交叉线,计数单位长度交叉线的肺泡隔数,同时测出十字交叉线总长度,该指标反映平均肺泡直径大小,以总长度/肺泡隔数表示肺泡内衬间隔㊂㊃7611㊃国际呼吸杂志2018年8月第38卷第15期I n t JR e s p i r,A u g u s t2018,V o l.38,N o.15Copyright©博看网. All Rights Reserved.1 32 支气管肺泡灌洗液(b r o n c h o a l v e o l a rl a v a g e f l u i d ,B A L F )中细胞分类计数 将部分幼鼠麻醉后开胸,用显微剪在颈部剪开皮肤,小心暴露主气管,儿童留置针于颈部刺入主支气管,20c mH 2O 压力下生理盐水灌洗,回收,重复3次留取灌洗液,混匀裂解去除红细胞后统计细胞数,细胞沉淀涂片后进行染色并分类计数,分别计数100个细胞内巨噬细胞㊁中性粒细胞和淋巴细胞的细胞数㊂1 3 3 肺组织相关蛋白水平检测 将剩余幼鼠处死开胸取肺组织,液氮冻存㊂提取肺组织总蛋白,W e s t e r nb l o t 检测B P D 血管生成标记物V E G F 和α7-n A C h R 蛋白表达水平㊂1 4 统计学分析 采用S P S S16 0和G r a p h -P a d 5 0进行统计分析和作图㊂对于连续变量,首先进行K o l m o go r o v -S m i r n o v 正态性检验,若符合正态分布,以x -ʃs 表示;若为偏态分布,以中位数(四分位间距)表示㊂正态分布的连续变量采用双侧独立样本t 检验;非正态分布的连续变量采用双侧独立样本M a n n -W h i t n e y U 检验㊂所有指标以双侧P <0 05为差异有统计学意义㊂注:A ㊁B 为正常对照组;C ㊁D 为香烟烟雾暴露组图3 造模结束时2组幼鼠肺组织形态学表现 H E ˑ2002 结果2 1 2组大鼠一般情况比较 相对于正常对照组,14d 实验结束时,香烟烟雾暴露组母鼠无死亡,流产率为30 0%(3/10),产幼崽45只,存活30只(66 7%);正常对照组母鼠无死亡,流产率为0 0%(0/10),产幼崽70只,存活63只(90 0%)㊂香烟烟雾暴露组母鼠失去光泽,呈现出烟熏所致枯黄,易激惹㊁暴躁;幼鼠体质量增长缓慢,明显落后于正常对照组(图1)㊂2 2 烟雾颗粒及烟气成分浓度 熏烟过程中,烟雾总颗粒浓度为609~623m g/m 3,可吸入性颗粒浓度为34m g/m 3㊂持续监测熏烟箱内烟雾气体浓度,O 2浓度>20%,C O 2浓度为4000~5000p p m ,C O 浓度为500~800p pm ㊂2 3 肺泡灌洗液细胞分类计数 如图2所示,造模结束时香烟烟雾暴露组肺内的中性粒细胞㊁巨噬细胞明显升高(P 值均<0 01),提示肺内存在炎症反应㊂2 4 各组肺组织形态学比较 与正常对照组比较,显微镜下香烟烟雾暴露14d 后的幼鼠肺组织出现肺泡腔变大㊁部分肺泡融合㊁肺泡间隔断裂增厚等表现(图3)㊂与正常对照组比较,香烟烟雾暴露组幼鼠肺组织放射状肺泡计数减小(P <0 05),平均肺泡内衬间隔增加(P <0 05)㊂见图4㊁5㊂图1正常对照组与香烟烟雾暴露组幼鼠体质量增长曲线注:与正常对照组比较,a P <001图2 正常对照组与香烟烟雾暴露组支气管肺泡灌洗液中细胞分类计数比较㊃8611㊃国际呼吸杂志2018年8月第38卷第15期 I n t JR e s p i r ,A u gu s t 2018,V o l .38,N o .15Copyright ©博看网. All Rights Reserved.2 5 各组肺组织中V E G F ㊁α7-n A C h R 蛋白水平的比较 与正常对照组比较,香烟烟雾暴露组肺组织中V E G F 蛋白表达水平降低(P <0 05),α7-n A C h R 表达升高(P <0 05)㊂见图6~8㊂注:与正常对照组比较,a P <005图4 正常对照组与香烟烟雾暴露组幼鼠肺组织放射状肺泡计数比较注:与正常对照组比较,a P <005图5 正常对照组与香烟烟雾暴露组幼鼠肺组织平均肺泡内衬间隔比较注:V E G F 为血管内皮生长因子;α7-n A C h R 为α7-烟碱型乙酰胆碱受体图6 W e s t e r nb l o t 检测正常对照组与香烟烟雾暴露组肺组织中V E G F ㊁α7-n A C h R 蛋白表达3 讨论烟草危害是当今世界最严重的公共问题之一,全世界每年因吸烟导致的死亡人数高达600万,超过因艾滋病㊁结核㊁疟疾导致的死亡人数之和㊂我国是世界最大的烟草生产国和消费国㊂据调查,我国吸烟人群超过3亿,另有7 4亿不吸烟人群遭受二手烟的危害㊂每年因吸烟相关疾病致死人数超过100万,如对吸烟流行状况不加以控制,至2050年,每年死亡人数将突破300万㊂自1964年关于烟草问题的‘美国卫生总监报告“首次对吸烟危害健康问题进行系统阐述,大量证据表明,吸烟可导致多部位恶性肿瘤及呼吸系统㊁心血管系统㊁泌尿生殖系统等多系统慢性疾病,导致生殖发育异常,还与其他健康问题的发生密切相关㊂然而,公众对吸烟和二手烟暴露的危害认识严重不足,妇女及孕期妇女香烟暴露亦成为不可回避的问题㊂注:V E G F 为血管内皮生长因子;与正常对照组比较,a P <0 05图7 正常对照组与香烟烟雾暴露组肺组织中V E G F 蛋白相对表达量的比较注:α7-n A C h R 为α7-烟碱型乙酰胆碱受体;与正常对照组比较,a P <005图8 正常对照组与香烟烟雾暴露组肺组织中α7-n A C h R 蛋白相对表达量的比较B P D 是在1967首次由挪威学者R o s a n 和P o r t e r 在肺透明膜病治疗后发现遗留的肺部疾病㊂经典的B P D 的致病因素包括氧毒性㊁气压伤㊁容积伤㊁感染及其他理化因素,组织学特征包括气道㊃9611㊃国际呼吸杂志2018年8月第38卷第15期 I n t JR e s p i r ,A u gu s t 2018,V o l .38,N o .15Copyright ©博看网. All Rights Reserved.上皮化生㊁气管周围纤维化及血管平滑肌增生㊂由于皮质激素治疗和通气辅助治疗策略的改变,提出新B P D 取代 经典的B P D ,也称为小婴儿的慢性肺部疾病,其特点是肺泡和毛细血管发育不良,B P D的病理特点包括肺泡间隔减少和肺泡微血管丛发育失调,在显微镜下看到的是变大㊁简化㊁囊性肺泡和不规则的肺血管,肺泡间微血管数量减少,因此肺泡发育停滞/损害㊁血管生成障碍是所有B P D的共同特征[1,5-6]㊂任何程度的B P D均可导致远期不良结局,比如增加儿童时期气道高反应性,导致成年肺功能异常,甚至致使C O P D提早发生[7]㊂D i d o n等[8]认为B P D和C O P D在发病机制上存在共性㊂一些影像学研究显示,在B P D存活下来的年轻人肺组织和肺功能上呈现出C O P D样改变[8-11]㊂香烟烟雾是导致C O P D的首要因素,包括主动吸烟和二手烟雾暴露㊂研究证实,孕期香烟烟雾暴露可导致婴儿发育异常及早产,孕期直接吸烟或二手烟暴露也是早产儿发生B P D的因素之一,且暴露在香烟烟雾环境中可导致B P D患儿对感染的易感性增加而加重B P D病理改变[12-14]㊂可用于B P D研究的动物种类包括小鼠㊁大鼠㊁兔㊁羊及竹鼠,目前的各种动物模型各有优缺点,无法用一种模型解释所有B P D的病理生理过程[15]㊂人和大鼠肺组织的发育经历5个阶段:胚胎期㊁假腺管期㊁微管期㊁囊泡期㊁肺泡期㊂2个物种的肺部发育过程并不平行,大鼠孕期0周至出生后5d,相当人类胎儿的24周至足月,生后5~ 30d相当于生后36周至幼儿期[16]㊂本研究选择在大鼠孕期及子代大鼠14d内进行造模,符合孕期及生后新生儿期的时间段的香烟烟雾暴露㊂研究证明,V E G F水平与B P D的发生和严重程度相关,因正常的肺发育过程中的肺泡分化依赖于血管生成,而V E G F表达是血管生成的重要标志[17]㊂因此,本研究选用V E G F为B P D的重要评价指标之一㊂在香烟烟雾暴露B P D模型中,肺部形态学㊁V E G F表达均符合B P D的病理特点,肺泡分化障碍㊁肺泡破坏和血管生成受阻,同时模型肺组织中尼古丁受体α7-n A C h R蛋白表达上调,在大鼠动物模型上模拟出香烟烟雾是B P D诱因㊂本次研究成功制备孕期及后代香烟烟雾暴露所致的B P D,能够更好地解释B P D的香烟烟雾易感性,也可以从某些方面解释B P D的发生,甚至对不同程度B P D的治疗提供一定的方向㊂①孕母吸烟导致肺部病变的原因:越来越多的证据显示,胎儿暴露在环境毒素下,包括多环芳烃和香烟烟雾可以影响肺部发育和肺功能㊂香烟烟雾中含有3800多种已知的化学物质,其中尼古丁为其主要成分㊂而尼古丁通过兴奋神经肌肉系统中的n A C h R而发挥作用,香烟烟雾暴露诱导的胚胎早期病变所致B P D通过n A C h R发生效应,而拮抗相关的抗体有可能阻止尼古丁所致的肺部损害㊂其中中枢神经型α7-n A C h R作用广泛,参与各种中枢神经病变㊁肿瘤病变和血管病变等,同时有证据表明,α7-n A C h R参与到动脉粥样硬化等血管增殖的病理过程,也同时参与肿瘤组织中尼古丁介导的血管生长[12,18-19]㊂给恒河孕猴摄入尼古丁,其胎儿肺组织内α7-n A C h R亚单位表达水平明显增加,肺组织发育成熟受到影响,α7-n A C h R也可以抑制人气道上皮细胞的增殖,说明α7-n A C h R可以影响到肺组织的生长发育[18,20]㊂本次研究模型中同样发现肺组织α7-n A C h R水平升高,其在B P D中的详细机制还需进一步研究㊂②生后幼鼠再次香烟暴露所致的肺部问题:肺泡灌洗液提示香烟烟雾暴露幼鼠肺泡内中性粒细胞和巨噬细胞明显升高,从一定程度上提示急性和慢性炎症是B P D的原因之一㊂而香烟烟雾暴露模型除尼古丁受体相关作用机制外,炎症也可能是其中重要的机制之一㊂香烟烟雾暴露也是成人C O P D的常见原因,B P D的病理变化与成人C O P D有相似之处,并有临床研究发现幼年时期的B P D患者成年后发生C O P D几率较大,年龄提前㊂因此,可以从不同角度探索C O P D与B P D之间的共性:如在香烟烟雾C O P D模型中,二手烟可通过调节核转录因子κB(n u c l e a r f a c t o r-κB,N F-κB)的内源性抑制剂导致N F-κB水平升高,参与B P D 病理生理机制和C O P D病理生理过程[11,14];在B P D中,N F-κB也抑制成纤维细胞生长因子10 (f i b r o l d a s t g r o w t hf a c t o r-10,F G F-10)的表达,这种成纤维细胞生长因子对肺部传导气道的分支和形态发生至关重要,通过二手烟暴露,N F-κB诱导可以减少早产儿促进B P D发生的F G F-10表达㊂在成体肺中,F G F-10已被确定为一种存活因子,外源性F G F-10在小鼠中的表达降低了诱导的肺泡上皮细胞D N A损伤㊁细胞凋亡以及诱导的肺纤维化的程度,与C O P D的发生存在一定关系[21-22]㊂以上举例的香烟烟雾暴露所致的B P D的分子机制不能全面概括所有,可能涉及的分子机制及致病机制值得进一步深究㊂综上所述,依据世界流行病学调查显示,近些年我国控烟形式严峻,笔者认为香烟烟雾暴露建立的B P D模型符合临床B P D发㊃0711㊃国际呼吸杂志2018年8月第38卷第15期I n t JR e s p i r,A u g u s t2018,V o l.38,N o.15Copyright©博看网. All Rights Reserved.生㊁发展的病理生理过程㊂在当前形势下,希望这一模型能够更好地为研究B P D提供帮助,以引起国家对烟草控制的力度及对妇女儿童香烟烟雾暴露问题的重视㊂参考文献1 C o a l s o nJ J P a t h o l o g y o fb r o n c h o p u l m o n a r y d y s p l a s i a JS e m i nP e r i n a t o l2006304179-184D O I101053js e m p e r i2006050042 A n t o n u c c iR C o n t uP P o r c e l l a A e ta l I n t r a u t e r i n es m o k ee x p o s u r e an e wr i s kf a c t o r f o rb r o n c h o p u l m o n a r y d y s p l a s i aJ JP e r i n a t M e d2004323272-277D O I101515J P M 20040513 B u r k e H L e o n a r d i-B e e J H a s h i m A e ta l P r e n a t a la n dp a s s i v e s m o k e e x p o s u r e a n d i n c i d e n c e o f a s t h m a a n dw h e e z es y s t e m a t i c r e v i e wa n dm e t a-a n a l y s i s J P e d i a t r i c s20121294735-744D O I101542p e d s2011-21964 V o l l s a e t e r M R o k s u n d O D E i d e G E e ta l L u n g f u n c t i o na f t e r p r e t e r mb i r t h d e v e l o p m e n t f r o m m i d-c h i ld h o o d t oa d u l t h o o d J T 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s i s i n m i c e J A m JR e s p i rC r i tC a r e M e d20091805424-436D O I101164r c c m 200811-1794O C收稿日期2018-03-02㊃1711㊃国际呼吸杂志2018年8月第38卷第15期I n t JR e s p i r,A u g u s t2018,V o l.38,N o.15Copyright©博看网. 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