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比色分析技术分光光度法是利用单色器（主要是棱镜）获得单色光来测定物质对光吸收能力的方法。
物质对不同波长的光波具有选择吸收的特性，分光光度法就是基于物质的这种特性而建立起来的分析方法，它是光谱分析技术中最基本和最常用的方法，因其具有灵敏、准确、快速、简便、选择性好等特点而被广泛应用。
一、比色分析的基本原理比色分析技术是利用物质对光的吸收作用来对物质进行定性或定量分析的技术。
分光光度法是光谱分析技术中最常用的一种，应用最多的是紫外 - 可见光分光光度法。
（一）吸光度与透光度当一束光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部分光被吸收，另有一部分光透过溶液。
设入射光强度为I 0 ，透射光强度为I ，I 和I 0 的比值称为透光度（ transmittance ，T ），即T ＝，其数值小于 1 。
T 与 100 的乘积称为百分透光度，以 %T 表示。
透光度的负对数称为吸光度 (absorbance ， A) 。
其表达式为：A ＝－LgT ＝－Lg ＝Lg（二） Lambert-Beer 定律Lambert-Beer 定律指出当一束单色的辐射能通过介质或溶液后，有一部分被吸收，其辐射能的吸收与溶液中吸收物质的浓度和溶液厚度的乘积成正比。
Lambert-Beer 定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。
Lambert-Beer 定律是描述溶液吸光度同溶液浓度和溶液液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。
其表达式为：A ＝KLC式中，A ——吸光度；K ——吸光系数；L ——溶液厚度，称为光径；C ——溶液浓度。
根据 Lambert-Beer 定律，当液层厚度单位为 cm ，浓度单位为 mol/L 时，吸光系数K 称为摩尔吸光系数（ε）。
ε的意义是：当液层厚度为 l cm ，物质浓度为 l mol/L 时，在特定波长下的吸光度值。
ε是物质的特征性常数。
在一定条件（入射光波长、温度等）下，特定物质的ε不变，这是分光光度法对物质进行定性的基础。
比色及吸光光度法教学目的：1、掌握比色分析法的特点、方法原理，应用范围和一些专业术语。
2、明确溶液颜色与光吸收的关系。
3、掌握朗伯-比耳定律的物理意义及其应用。
教学重点：朗伯-比耳定律教学内容：第一节概述一、比色分析法比色分析法：利用比较溶液颜色深浅的方法来确定溶液中有色物质的含量。
有色物质溶液颜色越深，浓度越大；颜色越浅，浓度越小。
二、比色分析法测定步骤①选择适当显色剂，使被测组分转变成有色物质，称为显色阶段。
测定无色溶液时要进行显色阶段。
②选择最佳条件测定溶液的深浅度，称为比色阶段。
三、发展过程：目视比色法→光电比色法→分光光度计（吸光光度法）四、比色与分光光度法的特点比色和分光光度法主要用于测定微量组分。
1、灵敏度高：测定试样中微量组分（1～0.001%）常用方法，甚至可测定10-4 ~ 10-5%的痕量组分。
2、准确度高：一般比色法相对误差为5～10%，分光光度法为2～5%，其准确度虽比重量法和滴定法低，但对微量组分的测定已完全满足要求。
如采用精密分光度计，误差将减少至1～2%。
3、应用广泛：几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可以直接或间接地用比色法和分光光度法进行测定。
4、操作简便、快速，仪器设备也不复杂。
例如：试样中含Cu量为0.001%，即在100mg试样中含Cu 0.001mg，用比色法可以测出。
如用碘量法进行滴定分析测定：设Na2S2O3溶液浓度为0.05mol/L，消耗体积为V（mL），则：0.001/63.55 = 0.05·VV = 0.0003（mL）所需Na2S2O3标准溶液0.0003mL，无法用化学分析法来测定，但比色和吸光光度法完全可以准确的测定其含量。
第二节光的基本性质：光具有两象性：波动性和粒子性1、波动性：入ν = c入：波长（nm）ν：频率（Hz）c：速度（3×1010 cm/s）例如：光的反射、折射、衍射、偏振、干涉等现象。
2、粒子性：E = h νE：光量子能量h：常数（普朗克常数=6.6256×10-34 J·s）ν：频率不同波长（或频率）的光，其能量不同。
玻璃比色皿和石英比色皿辨别、使用和清洗方法光度分析法是最常用的定量分析方法之一，其主要特点是：(1)应用范围广泛。
很多物质在紫外-可见光区有吸收，因此可借助于比色法进行测定。
(2)适用的浓度范围广泛，从常量分析到痕量分析(经预富集后)均可实现。
(3)灵敏度高，选择性好，精确度高，分析成本低，操作简便、快速。
因此广泛应用于地质、冶金、化工、医学、食品、制药及环境监测等行业。
在光度法中，比色皿的选择、使用和维护对分析结果有着重要的影响。
比色皿选择与鉴别比色皿的制造工艺有两种，一种是粘合剂粘合而成，另一种是高温熔融而成。
比色皿的材料通常来源于石英、熔凝硅石和光学玻璃。
玻璃比色皿对紫外线几乎全部吸收，吸光度非常大。
而石英比色皿的吸光度则小得多。
常用比色皿的形状有方形、矩形和圆筒形，容量一般为几毫升。
也有用于少量试样的微型或超微型毛细管皿。
另外还有高、低温、恒温比色皿。
比色皿有不同的光程长度，一般常用的有0．5、l、2、3、5cm ，选择哪种光程长度的比色皿，应视分析样品的吸光度而定。
当比色液的颜色较淡时，应选用光程长度较大的如2cm、3cm比色皿；当比色液的颜色较深时，应选用光程长度较小的如0.5cm 、lcm比色皿，以使所测溶液的吸光度在0.1-0.7之间。
比色皿有方向性。
有些比色皿上标有方向标记，使用时必须注意。
无方向标记的比色皿应予以校正，校正时要先确定方向并作好标记，以减少测定误差。
比色皿的校正方法是：将纯净的蒸馏水注入比色皿中，把其中吸收最小的比色皿的吸光度置为零，并以此为基准，测出其它比色皿的相对吸光度。
测定比色液时，应将其吸光度减去比色皿的吸光度。
同一组比色皿相互间的差异应小于测定误差在测定同一溶液时，吸光度差值应小于0.5％，否则应对差值进行校正。
比色皿的光程长度也需校正，校正时可将吸光度约为0.4的溶液分别注入校正皿和具有准确光程长度的标准比色皿中，测定吸光度。
以标准比色皿的吸光度为1.00，求出校正比色皿吸光度的相对值作为该比色皿的校正系数。
4、操作简便、快速，仪器设备也不复杂。
例如：试样中含Cu量为0.001%，即在100mg试样中含Cu 0.001mg，用比色法可以测出。
如用碘量法进行滴定分析测定：设Na2S2O3溶液浓度为0.05mol/L，消耗体积为V〔mL〕，那么：0.001/63.55 = 0.05·VV = 0.0003〔mL〕所需Na2S2O3标准溶液0.0003mL，无法用化学分析法来测定，但比色和吸光光度法完全可以准确的测定其含量。
第二节光的根本性质：光具有两象性：波动性和粒子性1、波动性：入ν = c入：波长〔nm〕ν：频率〔Hz〕c：速度〔3×1010 cm/s〕例如：光的反射、折射、衍射、偏振、干预等现象。
2、粒子性：E = h νE：光量子能量h：常数〔普朗克常数=6.6256×10-34 J·s〕ν：频率不同波长〔或频率〕的光，其能量不同。
入大—E小；E大—入小。
第三节溶液颜色与光吸收的关系一、光谱的分类可见光：混和光，由波长400～760nm的电磁波按适当强度比例混合而成，因人们视觉可觉查到，故称为可见光。
紫外光：电磁波的波长小于400nm。
红外光：电磁波的波长大于760nm。
各种单色光的波长日光紫外线可见光红外线无色紫蓝青蓝绿黄绿黄橙红无色400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-600 600-650 650-760< 400nm > 7601、互补色：当将某两种颜色的光按适当强度比例混合时，可以形成白光，这两种色光就称为互补色光。
光色互补示意图溶液所以呈现不同的颜色是由于该溶液对光具有选择性吸收。
例如：①当入射光〔白光〕全部透过溶液时——溶液无色透明。
②当入射光〔白光〕全部被溶液吸收时——溶液黑色。
③当入射光〔白光〕通过KMnO4溶液时，该溶液选择性吸收绿色波长的光，而将其它的色光两两互补成白光而通过去，只剩下紫红色，未被互补，所以KMnO4呈现紫色。
本章只讨论物质分子对可见光的吸收：目视比色法与分光光度法
•不同浓度的同一物质吸收曲线形状相似，最大吸收波长相同，但吸光度值不同。
在任一波长处，溶液的吸光度随浓度的增加而增大，这是分光光度法定量分析的依据。
•在物质对光的吸收曲线上，吸光度最大处所对应的波长称为该物质的最大吸收波长（用λmax 表示）
•在最大吸收波长附近吸光度的变化最为明显，所以定量分析中常选择最大吸收波长来测定吸光度，以获得较高的灵敏度。
•不同物质的吸收曲线的形状和
最大吸收波长不同，说明光的
吸收与溶液中物质的结构有
关，根据这一特性可用作物质
的初步定性分析。
结论：相同条件下，颜色越深，则浓度越大。
吸光度与浓度是相互关
1.基本组成
光源单色器样品室检测器
显示
光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。
可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500 nm，其中最适宜的使用范围为320-1000nm。
卤钨灯：寿命长，发光效率高(7230型、754型)
紫外区：气体放电光源：氢、氘、氙灯。
发射185～400 nm的连续光谱;激光光源：氩离子激光器，可调谐染料激光器
注意：1.其底及两侧为毛玻璃，另两面为光学透光面。
用的型号：751G、752、754、756、756MC、721、722、723、724
高。
常用型号：710、730、760MC、760CRT、日本岛津UV－210型。
1.波长调节器（λ）；
2.电位器（O）；
3. 0%T电位器（100)；
4.吸收
池拉杆；5.灵敏度选择钮；6.电源开关；7.吸收池暗箱盖；8.显示仪
显色剂加入量对吸光度A的影响
(1)影响显色剂的平衡浓度和颜色
(2)影响金属离子的存在状态
影响显色的同时降低
(3)影响络合物的组成
显色反应最适宜的酸度需要通过实验进行选择。
方法是：固定被测离子及显色剂浓度，改变溶液pH值，测其吸光度，然后绘制吸光度对pH 值的关系曲线。
实际测定时，可选择曲线平坦区域的某一pH值作为测
光度计主要仪器测量误差是表头透射比的读数误差。
光度计的读
一定，而被测组分分别处于低浓度范围(T大)和高低浓
均较大，而且曲线有一最低点。
图工作曲线
，从工作曲线上查出待测液的浓度。
吸收光谱不重叠吸收光谱重叠。
