测序与诱变
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DNA序列测定1定义：是核酸一级结构的测定，简称DNA测序。
是现代分子生物学和基因工程操作中占有极其重要地位的一门技术。
A 1963年，Sanger和Thompson第一次完成了胰岛素51个氨基酸的序列测定，揭开了生物大分子一级结构测定的序幕。
B 1965年，Holly等成功测定了酵母丙氨酸tRNA的75个核苷酸序列，主要采用降解和片段重叠的方法。
C 六十年代末，Southern 首次进行了DNA序列分析，他用二苯胺降解法测定豚鼠的α- 卫星DNA。
这种方法不适用于一般的DNA。
D 1975年，Sanger首次使用加减法历经两年测定了φX174噬菌体基因组全场5386bpDNA 序列。
E Wu和Tayllor分析噬菌体λDNA粘性末端序列，他们采用四种3H-dNTP作为DNA 多聚酶的底物，以λDNA粘性末端为模板进行了体外分段接力补链合成，最终从同位素电泳图谱上分析出了λDNA两个粘性末端12bp的序列。
F 1977年Maxam和Gilbert提出了“化学降解法”G 1977年sanger提出了“双脱氧链终止法”H 1977年Messing 组建了一系列M13载体系统，为双脱氧链终止法提供了天然的模板和万能的引物。
I 1987年，应用生物系统公司推出了不用同位素标记的“激光测定法”2 加减法A 吴瑞（Ray Wu美国康奈尔大学）和Kaiser证明：在具有粘性末端的λ噬菌体DNA中加入DNA聚合酶时，如果在反应体系中只加三种核苷酸而缺少一种时，合成反应就准确地进行到此核苷酸之前的位置。
B England发现在反应物中缺少dNTP时，T4 噬菌体感染的大肠杆菌产生的聚合酶具有外切酶活性，反应从双链DNA3′端向5′端降解。
依此原理，sanger在加法系统中只加一种核苷酸，则降解反应进行到该核苷酸位置即停。
这是一种最早的简便快速DNA 序列测定法，一次可读100个核苷酸序列。
C Sanger采用该法首先测定了φx174噬菌体的5386bp DNA序列。
加减法首次引入了使用特异引物在DNA聚合酶作用下进行延伸反应、碱基特异性的链终止，以及采用聚丙烯酰胺凝胶区分长度差一个核苷酸的单链DNA等3种方法。
尽管有了这些进展，但加减法仍然太不精确，因此难以广为接受。
3化学降解法Maxam-Gilbert化学降解法A 原理：将待测DNA片段进行末端标记，然后用专一性的化学试剂将DNA降解。
这一方法是在体外研究lac阻抑制与lac操纵基因相互作用时酝酿发展起来的。
时至今日，可以探测DNA构象的蛋白质－DNA相互作用，仍然是Maxam- Gilbert法独具的鲜明特点。
B 这一方法的基本步骤为(1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P；(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开；(5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。
G反应：硫酸二甲脂（DMS）使鸟嘌呤N7甲基化。
A+G反应：甲酸使嘌呤环上的氮质子化导致糖苷键被削弱，进而嘌呤环被吡啶取代。
C+T反应：肼能够裂解嘧啶环，导致其脱落。
C反应：在一定浓度的的NaCl 条件下，肼只对胞嘧啶起作用。
在以上修饰反应完成后吡啶在加热条件下导致被修饰碱基处磷酸二酯键断裂。
4 双脱氧核苷链终止法通常DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3…-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP、dCTP）聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP 加到引物的3…-OH末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。
如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），因为它与普通dNTP不同，在脱氧核糖的3‟位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。
例如，存在ddCTP、dCTP和三种其他的dNTP（其中一种为α-32P标记）的情况下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成一种全部具有相同的5…-引物端和以ddC残基为3‟端结尾的一系列长短不一片段的混合物。
经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信息，从而将全部C的位置确定下来。
采用类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3…端结尾的三组长短不一的片段。
将制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。
从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列，见图24-3所示。
1．M13噬菌体复制型双链DNA（RFDNA）的制备。
为了将待测双链DNA进行克隆，必须制备M13mp18或M13mp19复制型（闭环双链）DNA，从M9培养基中，挑起单个克隆大肠杆菌JM101到50ml2×YT培养基中，37℃振荡过夜。
稀释1ml培养物到50ml2×YT培养中，于37℃振摇6h，转移2ml培养物于微量离心管中，12000g，离心5min细菌沉淀保留用于分离复制型RFDNA，上清用于分离噬菌体单链DNA。
2．重组噬菌体制备采用多克隆位点上的限制性内加酶切割待测DNA，并采用相同内切酶切割M13噬菌体RFDNA，然后将待测外源DNA片段与M13复制型载体DNA连接过夜，连接反应物转染JM101感受态细菌，然后加入1ml新鲜的静止相JM101培养物混匀，然后分别以300μl 于含有IPIG（200mg/ml）和X-gal200mg/ml的2×YT培养基上，于37℃培养8h即可出现蓝色和白色噬斑，白色即为阳性重组噬菌体。
3．单链噬菌体DNA（模板DNA）的制备上述平板的每个白色噬菌斑是由一种重组M13DNA分子转染细菌后产生的，如果取一个白色噬菌斑进行培养便可得到一种单链形式的DNA。
为此，挑取一个白色噬菌斑转接到一个新鲜制备的OD600=0.1的大肠杆菌JM101培养物中，于37℃振摇5h左右，12000g离心10min，上清转移到另一新微量离心管中用于分离单链DNA，按1ml上清液中加入200μl(20%聚乙二醇PEG-6000的2.5m NaCl )沉淀噬菌体，再用饱和酚抽提除去噬菌体蛋白，最后用1/10体积的3m NaAc和乙醇沉淀单链DNA，浓度调至0.1～0.5μg/μl。
4．引物制备可以购买通用引物或实验室合成15bp～26bp长度的引物，通常以2μg/ml的浓度贮存于-20℃备用。
5 测序6．变性聚丙烯酰胺凝胶测序凝胶装置的大小形状均不相同，其主要参数有：①长度通常为40～50cm；②宽度通常为20cm；③厚度通常为0.3～0.4mm；④加样槽；⑤整块凝胶上的温度应均一。
测序电泳与一般电泳的区别1、厚度薄，仅有0.5mm。
2、面积大，一般高度达50cm，宽度达20-40cm。
3、电压高，达2000~3000V。
4、温度高，要求在45度以上。
测序一般采用变性（尿素、高温）聚丙烯酰胺凝胶，防止单链DNA形成高级空间构象。
下胶、洗片：1、揭开两块玻板。
2、用比胶大一些的吸水纸铺在胶上。
3、揭开吸水纸，胶粘在纸上。
4、覆上保鲜膜。
5、放入暗盒中，覆上X光片，-70°C曝光1-3天。
6、D-72显影液显影，酸性定影液定影，水洗，凉干。
由于DNA一般都由几千个单核苷组成。
而目前测定DNA序列的最好方法，一次也只能测约600个核苷酸，因此进行DNA顺序测定前，需要用不同限制酶消化待测DNA，使其降成小片段，分别克隆到pUC1,18pUCl18,pUC19,M13mp18,M13mp19等载体中，分别测定各小片段的顺序，由于不同限制酶产生的片段之间有交错重叠顺序，根据片段间和末端重叠序列，用计算机软件如Mac Vector TM5.0分析DNA，Assemblylign TM排列出各片段的位置，进而排出DNA的全序列。
1995年，J.C. Venter所领导的TIGR（The Institute of Genomic Reseach）完成了第一个单细胞自由生物基因组，流感嗜血杆菌(Haemopophilus influenzae Rd)全序列测定。
1996年他们又完成了拥有最小基因组的单细胞生物尿殖道支原体(Mycoplasma genitalium)和一种不同于原核、真核生物的单细胞生物--产甲烷古细菌(Methanococcus jannaschi) 的全序列测定。
德国人则测定了肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)基因组全序列。
与此同时，历时七年(1989-1996年)的第一个真核生物酿酒酵母(Saccharomyces cevevisiae)基因组计划在欧共体及美、日、加、英等各国实验室共同努力下得以完成。
1997年大肠杆菌(Escherichia. Coli S)的基因组计划完成，美丽隐杆线虫(caenothabditis elegans)的基因组计划也于1998年完成。
新的测序策略—全基因组鸟枪法测序全基因组鸟枪法测序的主要步骤是：第一，建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组文库。
克隆数要达到一定数量，即经末端测序的克隆片段的碱基总数应达到基因组5倍以上。
第二，高效、大规模的末端测序。
对文库中每一个克隆，进行两端测序，TIGR在完成流感嗜血杆菌的基因组时，使用了14台测序仪，用三个月时间完成了必需的28,463个测序反应，测序总长度达6倍基因组。
第三，序列集合。
TIGR发展了新的软件，修改了序列集合规则以最大限度地排除错误的连锁匹配。
第四，填补缺口。
有两种待填补的缺口，一是没有相应模板DNA的物理缺口，二是有模板DNA但未测序的序列缺口。
他们建立了插入片段为15-20kb的λ文库以备缺口填补。
鸟枪法测序的缺点随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加，各个片段重叠或一个连续体的概率是2n2-2n高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误。
对鸟枪法的改进(1) Clone contig法。
首先用稀有内切酶把待测基因组降解为数百kb以上的片段，再分别测序。
(2) 靶标鸟枪法(direted shotgun)。
首先根据染色体上已知基因和标记的位置来确定部分DNA片段的相对位置，再逐步缩小各片段之间的缺口。
基因定点诱变研究蛋白质结构与功能之间的关系1. 对赖以形成蛋白质一级结构的氨基酸侧链进行化学修饰。
2. 蛋白质晶体的x射线衍射。
Mutagenesis of cloned genes1 Deletion mutagenesisIn the cDNA clones,it is common to delete progressivelyfrom the ends of the coding region to discover with partsof the whole protein have properties. In genomic clones.when the transcription part has been identified,upstreamare removedprogressively to discover the minimumlength of upstream sequence that has promoter andregulatory function .2 Site-directed mutagenesisFormerly,single-stranded templates preparedusing M13 were used,but now PCR techniques arenow preferred.3 PCR mutagenesisDeletion or point mutation。
