RT-PCR 荧光定量理论

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RTqPCR实时荧光定量PCR

差的10倍。
Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经
过的扩增循环次数。Ct值极具重现性。分析定量时多取15-35较好。
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1
RT-qPCR 原理----定量原理
1.绝对定理想的PCR反应：
X=X0 (1+Ex)n
n：扩增反应的循环次数
X：第n次循环后的产物量
X0：初始模板量
Ex：扩增效率
Ct = −
log X0
log X
+
log(1 + Ex) log(1 + Ex)
=
−1
log(1 + Ex)
Ex = 10−1/ − 1
log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log X
Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值
合后才发荧光。（在变性过程中无荧光，在复性及
延伸过程中发出荧光）
• 特异性荧光标记：
• 1、TaqMan 水解型杂交探针。5′端标记有报告
基团R，3′端标记有荧光淬灭基团 Q。探针完整
，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光。
Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针R
与Q分开，发出荧光。
• 2、Molecular Beacon 分子信标。标记荧光的发夹
就可计算出样品中所含的模板量.
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1
RT-qPCR 原理----绝对定量
1.绝对定量
模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小
Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准
曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量

荧光定量PCR技术

03
结果重复性差
可能原因包括实验操作不规范、仪器故障等。解决方案包括规范实验操作、定期维护和校准仪器等。
05
荧光定量PCR技术在生物医学研究中的应用
基因表达水平检测
绝对定量
通过标准曲线对未知模板进行定量分析，确定基因的表达量。
相对定量
比较不同样本间基因表达的差异，常用于研究基因在不同组织、不同发育阶段或不同处理条件下的表达模式。
光信号的特性，实现对PCR产物的实时监测。
02
第二代荧光定量PCR技术
引入了特异性更高的荧光探针（如TaqMan探针），提高了检测的准确
性和特异性。
03
第三代荧光定量PCR技术
在第二代技术的基础上，进一步改进了荧光探针的设计，引入了多种荧
光基团和猝灭基团，实现了多重荧光定量PCR检测。
应用领域及意义
研究微生物与环境因素的相互作用
荧光定量PCR技术可用于研究微生物与环境因素（如温度、pH值、营养物质等）的相互作用，揭示微生物在环境中的适应机制和生态功能。
食品安全领域应用
检测食品中的病原微生物
荧光定量PCR技术可用于快速、灵敏地检测食品中的病原微生物，如沙门氏菌、大肠杆菌等，保障食品安全。
评估食品中的转基因成分
重复性原则
设计合理的实验重复和对照，以验证结果的稳定性和可靠性。
定量准确性原则
选择合适的荧光定量方法和标准曲线，确保目标序列的准确定量。
样品准备与DNA提取方法
样品准备
收集待测样品，如组织、细胞、血液等，并进行适当的处理，如研磨、裂解等，以
释放DNA。
DNA提取方法
根据样品类型和实验需求选择合适的DNA提取方法，如酚氯仿抽提法、试剂盒法等，以获得高质量的DNA模板

实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用

实时荧光定量PCR技术的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义
二、RT-PCR技术的原理及试验流程三、RT-PCR技术的数据分析四、RT-PCR技术的应用
实时荧光定量PCR的定义
RT-PCR技术的数据分析
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ)
病原体检测转基因食品检测基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究
RT-PCR技术的数据分析相对定量通过内标定量
内标（Endogenous Control）通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
变性
退火
延伸
RT-PCR技术的原理及试验流程
SYBR Green法优缺点
RT-PCR技术的原理及试验流程
Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan法
RT-PCR技术的原理及试验流程
TaqMan探针法优缺点

应用常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测柑桔衰退病毒

ｗｈｃｐｃｆｃｐｍｅｉｑｃＶ／ｃｕｔ２ａｄＴａＭａｒｂｑｃｖｒｓｄａｄｂｔｅｐｍｅｓａｄｉｈａｓｅｉｒｉｉｒｐａｒｃｕｔ１ｑｃＶｎｑｎｐｏｅｃｕｔｐｌｗｅｅｕｅｎｏｔｒｈｈｉｒｎｐｏｒｅｉｎｄｂｓｄｏｎ／２ｅｅｏｒｂｅｗｅｅｄｓｇｅａｅ０ｇｎｆＣＴＶ．ＴｈｅｅｔｏｉｉｏｏｖｎｉｎｅｄｔｃｉｎｌｔｆｒｃｎｅｔｏａＲＴ．ｍｌＰＣＲｙｓｅｗａ０ｓｔｍｓ５ＰｆｔｔｌＲＮＡｘｒｃｅｏｔｅｈｏｔｉｆｃｅｇｏｏａｅｔａｔｄｆｍｓｎｅｔｄｂＶＣＴＶ，ｗｈｌｈｔｆｒｆｏｅｃｎｕｔｔｔｅＩ．ｒｈｉｅｔａｒｓｅｔｑａｉａｉＰＣＲｙｓｏｌｎｖｓ．
ＲｇｌｉｎａＣｏｇｉ，ｈｎｑｎ０００ＣｉａｅｕａｏｔｈｎｑｎＣｏｇｉ４０３，ｈｎ）ｔｇｇ
Ａｂｔａｔｗｏｋｎｓｏａｉｅｅｓｒｎｃｐｉｎｌｐｌｍｅａｅｃａｎｒａｔｎ（ — ＣＲ）ｄｔｃｉｎｓｓｍｓｒｃ：ＴｉｄｆｒｐｄｒｖｒｅｔａｓｒｔａｏｙｒｓｈｉｅｃｉｉｏｏＲＴＰｅｅｔｙｔｏｅ
ｃｕｔｌｒｅｉｎｄｂｓｄｏ２ｅｅｏｉｕｒｔｚｉｕＣＴｑｃｖ０ｗｅｅｄｓｇｅａｅｎＰＤｇｎｆＣｔｓｔｉｅａｖｒｓ（Ｖ）ａｄＲＮＡｏｙｒｓｅｅｏｉｒｓｎｐｌｍｅａｅＩｇｎｆ — Ｉｃ

实时荧光定量RT-PCR技术在肿瘤研究中的应用

实时荧光定量RT-PCR技术在肿瘤研究中的应用
实时荧光定量RT-PCR技术是一种常用的分子生物学技术，已在肿瘤研究中得到广泛应用。

它的主要优点包括快速、准确、可靠、灵敏和高通量，使其成为诊断和检测肿瘤的首选方法之一。

实时荧光定量RT-PCR技术通过检测RNA的表达水平来识别
分子生物学过程的差异，这些差异可以标示癌细胞。

该技术可以定量分析获得的数据，并通过荧光信号的实时记录来实现数据的实时分析。

在肿瘤研究中，实时荧光定量RT-PCR技术广泛应用于检测和鉴定癌症相关基因的表达水平。

它可以分析单个分子和复杂分子组合的表达，如miRNA、mRNA和蛋白质。

此外，它还可
以分析多种基因的表达水平，从而确定肿瘤的进展和转移情况。

在临床实践中，实时荧光定量RT-PCR技术的应用范围非常广泛。

它可以检测肿瘤细胞DNA上的突变，确定癌症的类型和
分级以及筛选潜在治疗药物的反应性。

此外，该技术还可以用于肿瘤早期筛查，预测治疗效果和判断患者的预后。

总之，实时荧光定量RT-PCR技术在肿瘤研究中有着重要的应用和作用。

随着该技术的不断改进和发展，相信它将会在未来的肿瘤治疗和预防方面发挥更加重要的作用。

RT-qPCR之原理篇

RT-qPCR之原理篇Hi，⼩伙伴们，本周继续我们的RT之旅，在上期的内容中我们介绍了RT-qPCR的第⼀步——反转录，讲到怎样获得⾼质量的cDNA模板，那么接下来就需要⽤我们获得的模板去做定量PCR，在此之前⼤家要了解什么是定量PCR，定量PCR的原理是什么，只有知道了这些，我们才能较为顺利的去定量。

所以，本期我们将为⼤家着重介绍RT-qPCR中定量的原理，希望对⼤家有所帮助。

我们先来回顾⼀下常规PCR和荧光定量PCR的区别，常规PCR是对PCR的最终产物进⾏定性和半定量分析，最终只能通过跑胶看出结果；荧光定量PCR则是根据荧光信号的变化，实时检测每个循环扩增产物的变化，从⽽达到对初始模板量的定性和定量分析。

那么荧光定量PCR是怎样进⾏的呢？下⾯我们将按照三⽅⾯的原理来逐步解析其⼯作原理：⼀、荧光定量PCR仪的系统原理在定量PCR仪中主要包含三⼤系统，PCR热循环系统、光路系统以及荧光检测系统。

仪器在⼯作过程中，由PCR热循环系统进⾏⽬标序列的扩增，由光路系统对PCR产物的荧光物质进⾏激发，最后由检测系统对激发的荧光进⾏检测统计，最后得到每个循环中产物的扩增量，将其转化为成为扩增曲线，⽤于之后的定性或定量研究。

⼆、荧光定量PCR⼯作的化学原理⽬前最常⽤的荧光定量PCR⽅式主要有两种，⼀是染料法，另⼀个是探针法。

1、染料法以SYBR Green I 染料为例， SYBRGreen I 是⼀种DNA双链⼩沟结合染料，游离时发光极微弱，结合DNA后荧光强度明显增强。

每形成⼀条双链，就有相应数⽬的SYBRGreen I 嵌⼊，并产⽣荧光信号，荧光的强度与体系中双链的浓度成正⽐，从⽽保证了荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，荧光的强度就代表了体系中双链产物的浓度。

其⼤致的⼯作流程如下图：此种⽅法当然也会有它的优缺点，优点是成本低， SYBRGreen I 试剂价格低，适合初步筛查⽬标基因；缺点是⽆特异性，针对所有双链形式DNA均有荧光基团嵌⼊，给出所有双链DNA的总荧光信号，不能进⾏多重筛查，每个PCR管中只能检测⼀个⽬标基因。

rt pcr原理

Real-time PCR（实时荧光定量PCR）原理解析1. 什么是PCR？PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种在体外扩增DNA片段的技术。

PCR的发明者是美国生物化学家基里尔·米隆尼斯（Kary Mullis），于1983年提出了这一方法。

PCR通过不断重复三个步骤来扩增目标DNA片段：变性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Elongation）。

这些步骤在PCR仪中由多个温度循环来控制，因此PCR也被称为“温度循环扩增”。

PCR技术为科学家提供了一种快速、敏感、特异性极高的扩增目标DNA的方法。

然而，传统的PCR只能在反应结束后进行结果的检测，无法实时监测反应的过程。

为了解决这个问题，Real-time PCR技术应运而生。

2. 实时PCR概述实时PCR是在PCR扩增过程中，使用荧光信号实时监测反应的进行。

与传统PCR相比，实时PCR能够提供实时的、连续的照片剖析PCR的进展。

实时PCR有两种常用的检测方法：荧光染料法和探针法。

其中，探针法又分为TaqMan探针法和Molecular Beacon探针法。

这些探针和染料能够与PCR反应中的产物结合，并产生荧光信号，根据信号的增长情况可以推断目标DNA的含量。

实时PCR广泛应用于分子生物学、医学诊断、检测病原体等领域。

接下来，我们将重点介绍实时PCR的基本原理以及常用的探针法和荧光染料法。

3. 实时PCR基本原理实时PCR的基本原理和传统PCR类似，也是通过变性、退火和延伸三个步骤来扩增DNA片段。

然而，在实时PCR中，PCR反应是在热循环PCR仪中进行，并且扩增过程中的结果可以实时检测。

实时PCR一般需要使用一种独特的仪器，称为实时荧光PCR仪或荧光定量PCR仪。

这种仪器能够在不破坏试管密封的情况下，通过荧光信号实时检测PCR反应体系中的增长程度。

在实时PCR中，荧光信号通过专门的探测器（Detector）收集，并且荧光信号的强度会随着PCR反应进行的次数递增。

rt—qpcr实验原理及步骤

rt-qpcr是一种结合了逆转录和实时荧光定量PCR技术的方法，用于对RNA分子进行定量检测。

其原理主要包括三个方面：逆转录、PCR 扩增和实时荧光定量检测。

1. 逆转录rt-qpcr实验首先需要将RNA转录为cDNA，这是通过逆转录酶（Reverse Transcriptase）催化的反应来实现的。

逆转录酶可以将RNA模板转录成相应的cDNA，为后续的PCR扩增提供模板。

2. PCR扩增在cDNA合成完成后，接下来是PCR扩增反应。

PCR扩增需要引物（primers）来选择性地扩增目标基因的片段。

在PCR过程中，引物与模板结合，逐渐扩增出大量目标片段，这些片段即为实验所关注的RNA分子的转录产物。

3. 实时荧光定量检测在PCR扩增过程中，可以加入SYBR Green等实时荧光染料，以实现实时监测PCR反应过程中产生的DNA片段数量。

这种实时荧光检测技术可以实现对PCR反应的动态观察，并能够定量分析反应体系中的DNA含量。

rt-qpcr实验步骤主要包括样品准备、逆转录、PCR扩增和荧光定量检测，以下为详细步骤：1. 样品准备首先需要准备待检测的RNA样品，其中包括目标RNA分子的提取、纯化和定量等工作。

样品的处理质量将直接影响后续实验结果的准确性和可靠性。

2. 逆转录将RNA样品与逆转录酶、随机引物和dNTPs等混合物一起进行逆转录反应。

逆转录过程一般包括以下步骤：首先将RNA与随机引物混合，然后加入dNTPs和逆转录酶，进行逆转录反应。

3. PCR扩增在逆转录完成后，将逆转录得到的cDNA作为模板，与特定引物和PCR Master Mix（包括酶、缓冲液和dNTPs等）进行PCR扩增反应。

PCR扩增条件需要根据引物的特性和目标片段的长度进行优化，以保证扩增反应的特异性和准确性。

4. 荧光定量检测在PCR扩增过程中，引入实时荧光染料（如SYBR Green）或探针（如TaqMan探针）来进行荧光定量检测。

三种荧光定量PCR检测方法比较

三种荧光定量PCR检测方法比较定量pcr：以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本中靶基因的拷贝数,称为定量PCR。

定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。

常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类：<1> SYBR Green I 检测模式SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。

其与双链DNA 结合后, 荧光大大增强。

因此, SYBR Green I 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量。

SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm。

PCR 扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法,40 个循环。

SYBR Green I 的缺点：由于SYBR Green I 没有特异性,不能识别特定的双链,只要是双链就会结合发光,对PCR 反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光,通常本底较高,所以在临床上使用可能会有假阳性发生。

SYBR Green I 的优点：SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生,由于它能所有的双链DNA相结合,所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针,通用性较好,并且价格相对较低。

这对科研是很有利的,因此国内外在科研中使用比较普遍。

<2> 水解探针模式<taq man探针>TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5’末端, 而淬灭剂则在3’末端。

当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。

在进行延伸反应时,聚合酶的5’外切酶活性将探针切断,使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。

一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。

随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累。

因此Taqman 探针检测的是积累荧光。

PCR 扩增程序通常是：94℃～60 ℃40 个循环。

常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒方法的建立及其应用

常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒方法的建立及其应用钱明明;许海燕;宗晴;阴甜甜;杨文彬;宋召军;黄金林;焦新安【摘要】目的建立GⅠ、GⅡ型诺如病毒的常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测方法,并对两种方法进行应用.方法优化筛选出最佳PCR反应体系与反应条件,并从灵敏性、特异性、临床样品检测等方面对建立的方法进行比较与评价.结果该两种方法特异性强,与札幌病毒、轮状病毒、星状病毒、腺病毒同时检测无交叉反应,同一体系内GⅠ、GⅡ型诺如病毒相互之间没有干扰;常规RT-PCR最低检测限为103 copies/μL,荧光定量RT-PCR最低检测限为102 copies/μL;对180份临床粪便样品进行检测,常规RT-PCR则检测率为5.56％(10/180),符合率达97.22％,荧光定量RT-PCR检测率为8.33％(15/180),符合率达100％;对15份阳性样品测序分析,证实均为诺如病毒.结论建立的常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR均可用于诺如病毒的快速检测,荧光定量RT-PCR更为灵敏.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2015(031)007【总页数】6页(P602-606,611)【关键词】常规RT-PCR;荧光定量RT-PCR;GⅠ、GⅡ型诺如病毒【作者】钱明明;许海燕;宗晴;阴甜甜;杨文彬;宋召军;黄金林;焦新安【作者单位】扬州大学人畜共患病重点实验室,扬州 225009;南通市疾病预防控制中心,南通 226000;扬州大学人畜共患病重点实验室,扬州 225009;扬州大学人畜共患病重点实验室,扬州 225009;扬州大学人畜共患病重点实验室,扬州 225009;扬州大学人畜共患病重点实验室,扬州 225009;扬州大学人畜共患病重点实验室,扬州225009;扬州大学人畜共患病重点实验室,扬州 225009【正文语种】中文【中图分类】R450诺如病毒(Norovirus，NVs)属于杯状病毒科诺如病毒属，是引起非细菌性急性胃肠炎的主要病原体，世界50%以上的胃肠炎暴发均由它引起[1]。

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RT-PCR反应体系反应体系： 1 RT-PCR反应体系： 1.1 模板作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。模板RNA最常见的问题是RNA 降解或混有基因组DNA。 1.2 逆转录酶 1.3 DNA聚合酶 1.4 引物
RT-PCR方法 2 RT-PCR方法 2.1 一步法：即反转录和PCR扩增在同一管内完成，有助于减少污染，灵敏度更高 2.2 两步法：即反转录和PCR扩增分两步进行，首先从RNA模板反转录得到cDNA，得到的 cDNA再进行一次或多次不同的PCR反应。
两个概念：两个概念：荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，为了便于对所检测样本进行比较，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般这个阈值是以PCR反应的前15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline）,荧光域值的缺省设置是 315 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。如果检测到荧光信号超过阈值被认为是真正的信号。 CT 值：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为 CT 值
图 1 实时荧光扩增曲线图荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。
RT-PCR技术原理及数据分析技术原理及数据分析：三： RT-PCR技术原理及数据分析：实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
3 提高提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性：反应的灵敏度与特异性：反应的灵敏度与特异性 3.1 首先应确定模板RNA完整性好，无DNA污染。 3.2 RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。 3.3 为了防止模板降解，可以在反应体系中加入 RNase抑制剂RNasin。 3.4 使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。 3.5 如果由于模板有二级结构，导致扩增效果不好，可提高逆转录反应温度。 3.6 设计引物时，避免在引物3´端含有互补序列，避免可以形成内部发卡结构的序列。
荧光探针和荧光染料：荧光探针和荧光染料： RT-PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。
荧光染料（ SYBR Green I ）
RT-PCR原理及方法
报告人：樊凤娇
一、 RT-PCR反应原理与方法反应原理与方法 RT-PCR是将RNA反转录（RT）和以反转录产物cDNA为模板的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因cDNA序列等研究。
四：RT-PCR的应用: RT-PCR的应用: 的应用 1 临床、食品及环境应用主要包括病原微生物检测、病原体检测、基因病诊断、传染病检测和病变检测等。 2 分子生物学应用分子生物学上RT-PCR应用相当广泛，包括基因转录检测（同一基因在不同组织的表达差异，如药物处理、物理处理、化学处理等），特定基因在不同时期的表达差异等。 3 遗传学，SNP分析及深入应用
SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。由于它与所有的双链 DNA 相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好。
2.3 一步法与两步法区别：一步法更方便，且可防止在管与管之间转换过程中污染样品，可适用于大量样品分析或定量PCR。两步法在选择聚合酶和引物时具有更大的灵活性，同时可由一次反转录样品获得多个遗传信息。陈阳婷等在研究一步法RT-PCR和两步法RT-PCR对马铃薯病毒诊断研究的比较中得出，两步法RTPCR具有较高的灵敏性，但这两种方法均可快速、简便、有效地诊断马铃薯病毒。
4： RT-PCR中PGES和PGFS引物以及内参：中和引物以及内参引物序列
Suranga P Kodithuwakku Spermatozoa stimulate prostaglandin synthesis and secretion in bovine oviductal epithelial cells
荧光探针（TaqMan 探针）
TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而淬灭剂则在 3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光基因与 3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。