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TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤--------------------------------------------------------------------------------凋亡细胞的原位末断转移酶标记法（TUNEL法）细胞凋亡的多步骤机制作用的最终环节是；细胞内源性核酸内切酶的激活而导致核染色质DNA双链的断裂。
大量DNA片段暴露出的3 羟基在末断转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)或DNA多聚酶的作用下，与生物素或地高辛标记的核苷酸结合，最终借助与卵白素或抗地高辛抗体结合的荧光素或HRP，使凋亡细胞被特异性地标记和显示出来。
TUNEL细胞凋亡试剂盒由美国罗氏公司提供试剂1：酶浓缩溶液（Enzyme Solution）试剂2：标记溶液（Lable Solution）试剂3：转化剂-POD（Converter-POD）酶标记抗荧光素抗体（即用型）试验所需其它试剂：非石蜡切片:·冲洗缓冲液:磷酸盐缓冲液（PBS）·阻断溶液:0.3%H2O2甲醇溶液·固定溶液:4%多聚甲醛（溶剂pH7.4新鲜配制的PBS溶液）·渗透液:0.1%Triton甔-100（溶于新鲜配制的0.1%枸橼酸钠溶液）Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)名：曲拉通X-100，乳化剂OP分子式：C34H62O11石蜡切片:·二甲苯和乙醇（100%、95%、90%、80%、70%用蒸馏水稀释）·冲洗缓冲液:磷酸盐缓冲液（PBS）·蛋白酶K 工作液10~20mg/ml溶于10mM Tris/HCl（pH7.4~7.8）根据需要选择:·渗透液:0.1%TritonX-100（溶于新鲜配制的0.1%枸橼酸钠溶液）·胃酶溶液（0.25%-0.5%溶于HCl ，pH2）或胰酶·0.1M枸橼酸缓冲液，pH6，微波修复材料：微波炉，微波输出功率850W-2000W2 .选用中性甲醇固定的活检及实验动物标本，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。
罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书注意：Label溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钴，严禁吸入和食入。
反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中，按有毒废物处理。
除上表所列试剂外，还需准备以下溶液。
下表列出每步所需物品概览：特异性：TUNEL反应优先标记凋亡产生的DNA链断裂，从而辨别凋亡与坏死、以及由抑制细胞生长的药物或放射线产生的primary DNA链断裂实验干扰：假阴性：在某些型式的凋亡细胞中DNA链断裂可能缺失或不完全。
空间位阻，如细胞外元件可能阻止TdT到达DNA断裂处。
两种情况均能产生假阴性。
假阳性：在坏死晚期，可能产生大量的DNA片段DNA链断裂也可能在具有高增殖和代谢活动的细胞中出现。
两种情况均能产生假阳性。
为确认细胞死亡的凋亡型式，应认真进行每种细胞的形态学检查凋亡过程中产生的形态学改变尤其特征形式，因此，对于可以结果进行解释时，细胞形态评估是一项重要的参数样本：细胞离心涂片和细胞涂片在chamber slides上培养的黏附细胞冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋样本分析时间：2-3小时，除外培养、固定和渗透检测次数：一个试剂盒50T试剂盒存储/稳定性：未开封试剂盒储存于-15～-25℃可稳定至标签上标明的效期。
1 流程图：2 样品准备2.1 黏附细胞、细胞涂片和细胞离心涂片需准备的其他试剂：Washing buffer：磷酸盐缓冲液（PBS）Blocking buffer封闭溶液：甲醇稀释的3% H2O2Fixation solution固定溶液：PBS配制的4%多聚甲醛，ph 7.4，新鲜配制Permeabilisation solution 渗透液：0.1%Triton1）X-100溶于0.1%柠檬酸钠溶液中，新鲜配制步骤：下表描述了细胞固定、内源性过氧化物酶封闭和细胞渗透过程。
2.2 组织部分2.2.1 福尔马林-包埋组织福尔马林包埋组织的预处理：可按4种不同的方式预处理。
罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HR P；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml–3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7. 5，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书(In situ cell death detection kit-POD法)一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml–3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
TUNEL Standard Operating Procedure一、试剂盒来源美国罗氏（Roche）公司二、实验原理T UNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
图1 TUNEL 实验原理示意图PROTOCOL OF APOPTOSISPrinciple: The TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase fluorescein-dUTP Nick End Labeling) method identifies apoptotic cells in situ by using terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) to transfer fluorescein-dUTP to the free 3'-OH of cleaved DNA. Then Detect the incorporated fluorescein with an anti-fluorescein antibody conjugating AP(alkaline phosphatase).Procedure:1. Paraffin embedding tissue sections2. Dewax, rehydrate sections by standard methods:Xylene and ethanol(absolute, 95%,90%,80,%70%,diluted in double distilled water)3. Optional: Inactivate endogenous POD/AP activity4. Wash slides with PBS(0.01M, PH7.2~7.4) 3 times, 3~5min/time5. Add protease and incubate (30 min, 37°C, protetase K, working solution:10~20ug/ml in 10mM Tris/HCl, PH7.4~8.0)6. Wash slides with PBS 3 times, 3~5min /time7. Permeabilize sections (2 min, on ice, permeabilisation solution0.1%TritonX-100, 0.1% sodium citrate, freshly prepared.8. Add TUNEL-reaction mixture and incubate (60 min, 37°C)9. Wash slides with PBS 3 times, 3~5min /time10. Optional: Analyze by fluorescence microscopy11. Add Anti-Fluorescein-AP or -POD and incubate (30 min, 37°C)12. Wash slides with PBS 3 times, 3~5min /time13. Add substrate and incubate (5–20 min, RT)14. Analyze by light-microscopy三、实验器材1. 光学器材（可选其一）：①正置光学显微镜及其成像系统（带荧光）②正置光学显微镜（Olympus）+数码相机（小镜头，易伸入显微镜头中拍照）2. 上行脱水缸：75%乙醇溶液、90%乙醇溶液、95%乙醇溶液、100%乙醇溶液、100%乙醇溶液、二甲苯（各1缸，共6个染色缸）3. 下行脱蜡与水化缸：二甲苯2缸（必要时3个）、100%乙醇溶液2缸、95%乙醇1缸、90%乙醇溶液1缸、75%乙醇溶液1缸、三蒸水1缸（8~9个）4．小型染色缸（PBS用）：3个5. 免疫组化笔或唇膏：1支6. 湿盒（带纱布）或自制湿盒：1~2个7. 盖玻片：若干片和若干规格（需处理后用）8. 吸管：若干支9. 加样器：200μL~1000μL、40μL~200μL、2μL~20μL10.枪头：200μL~1000μL、40μL~200μL、2μL~20μL11. 50.0mL螺口血清瓶（高压、消毒）：若干个12. 1.5 mL EP管、2.0 mL 与5.0 mL 冻存管（高压、消毒）：若干个13. EP管与冻存管架：若干个14. 苏木素染缸：1个15. 分色缸：1个16. PBS大缸：1个17.针式滤器（0.6μm）与10mL、50mL注射器：若干个18. 500mL容量瓶或盐水瓶：2个19. 有齿镊、小弯镊、小竹签（滴中性树胶用）：各1把（支）20. 清洁盖玻片储存盒：1个或清洁盖玻片储存缸1个21. 培养箱或温箱：37℃孵育用22. 烤箱：60℃考片用23.量筒：250mL、500mL、1000 mL、2000 mL，各1个24. 烧杯：50 mL、250 mL、500mL、1000 mL、2000 mL，各1个25. 玻棒：2支26. 磁力搅拌器：1个27. 50 mL 容量瓶1个28. 10mL试管（配DAB专用）若干支四、试剂1. 试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；2. 自备试剂（1）PBS（0.01M，PH 7.4）：中国福州迈新公司（2）单蒸水、三蒸水或超纯水（3）二甲苯（4）梯度乙醇溶液（100%、95%、90%、75%）：采用95%与无水乙醇配制（5）DAB显色试剂盒（含20×DAB、30%H2O2、PBS）：中国福州迈新公司（6）蛋白酶K（Proteinase K）：（MERCK公司）①母液（1mg/mL）： -20℃保存；②工作液：10-20 μg/mL in 10 mM Tris/HCL，pH 7.4-8，4℃保存，以1月内使用为宜。
罗氏(R o c h e)公司T u n e l试剂盒操作说明书(Insitucelldeathdetectionkit-POD法)一、原理：TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radishperoxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1号（蓝盖）EnzymeSolution酶溶液：TdT10×、2号（紫盖）LabelSolution标记液：荧光素标记的dUTP1×、3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μlPBS）、ProteinaseK工作液（10-20μg/mlin10mMTris/HCl，pH7.4-8）或细胞通透液（0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase1（3000U/ml–3U/mlin50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，1mg/mlBSA）等。
TUNEL说明书1 介绍TUNEL是提供单细胞水平细胞凋亡的稳定系统，能够迅速、快捷、精确的检测出凋亡细胞。
该试剂盒可以通过测定核DNA片段检测组织切片和培养细胞的凋亡细胞。
多数高等真核生物的细胞都通过启动自身的细胞自杀程序实现程序性死亡或细胞凋亡。
凋亡在发育、内环境稳定和一些疾病中具有重要作用。
凋亡具有某些特定的形态学特征，包括细胞膜起泡，细胞核和细胞质固缩，染色质浓缩，并且不发生局部炎症反应。
细胞死亡与此相反，它的特点是细胞肿胀，染色质絮凝，细胞膜完整性破坏，细胞溶解和产生及局部炎症反应。
凋亡过程中，内源性Ca2+、Mg2+依赖性核酸内切酶被激活，DNA被降解而形成末端为3’－OH、含180～200碱基对的不同倍数的核苷酸片段。
TUNEL 可用于多种细胞凋亡的检测，已经经过验证的应用范围: Vibratome® 神经组织切片, Jurkat 细胞, HL-60细胞这本技术小册子包括检测组织切片和茴香霉素诱导的HL-60细胞的细胞凋亡。
检测原理: DeadEnd™ Colorimetric TUNEL 系统使用改良的TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)对凋亡细胞的断裂DNA进行末端标记。
使用末端脱氧核苷转移酶(TdT)将生物素标记的核苷被掺入到DNA的3′-OH末端。
然后，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin HRP)结合在上述生物素标记的核苷上，可以通过过氧化物酶的底物——过氧化氢和稳定的显色剂氨基联苯胺(DAB)检测到。
用这种程序，凋亡细胞的核被染成深棕色。
2 产品内容G7361平衡缓冲液（G327B）——4.8ml末端脱氧核苷酰酶酸转移酶（M828B）——20ul抗生物素蛋白链菌素辣根过氧化物酶（G714A）——40ul生物素化的核苷混合物（G715A）——20ul蛋白酶K（V302A）——10mgG7362塑料盖玻片（G326B）——2020X SSC（G329B）——20mlDAB 20X 色原体（G716A）——200ul20X DAB底物缓冲液（G717A）——200ul20X过氧化氢（G718A）——200ul储存条件: 将平衡缓冲液, TdT酶, 生物素标记的核苷混合物和蛋白酶K 储存于–20°C。
不适用于诊断，仅供生命科学实验使用。
仅供体外使用。
TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（标记POD）本试剂盒可标记DNA链末端，即TUNEL技术。
用于单个细胞水平凋亡（细胞程序性死亡）的免疫组织化学检测和定量分析。
光镜检测。
批号：11684817910一盒可用50次储存：-15—-25℃操作指南2006.01.1.2 试剂盒组成注意事项本品标记溶液含有二甲基砷酸盐，容易被吸入而产生毒性和导致呕吐；也含有二氯化钴，吸入后容易致癌。
因此应避免接触并遵循相关的操作说明。
使用过程中不能吃、喝和抽烟。
如果接触到皮肤，应立即用大量水冲洗干净。
如果感觉不适或者突发其它情况，应立即就医。
酶标反应应在致密的、无损坏的容器中进行，收集上清液后应标明成分。
垃圾应作为有毒废物进行处理。
注意：与先前的试剂盒/管不同，次试剂盒的酶溶解液不再含有毒的二甲砷基酸盐，因此瓶1没有毒性。
试剂盒组成请参照下表对比试剂盒组成试剂盒外自备仪器和试剂出上表所列试剂外，实验者需制备系列溶液。
下表列出了在不同实验步骤中所需要的试剂。
在每步操作前都给出了详细的说明。
2 引言2.1 产品描述实验原理在细胞凋亡过程中，基因组DNA 会断裂产生双链、低分子量的DNA 片段和高分子量的单链DNA 断端（缺口），这些DNA 链缺口可以利用酶标记核苷酸3’末端方法来识别。
应用原位细胞凋亡检测试剂盒具有准确、快速、简单、非辐射等特点，可以用来对细胞或者组织中的单个细胞进行检测并定量，因而次法被用在很多分析系统中，例如：●在基础研究和日常病理中检测冰冻和福尔马林固定的组织切片。
●在肿瘤研究和临床癌基因研究中确定某些恶性肿瘤对某种药物的敏感性。
●通过双染色操作，确定经历死亡的异常增生细胞的分型。
专一性TUNEL反应可以更好的标记通过凋亡产生的DNA链末端，因此就可以区分出凋亡与坏死，以及由抗肿瘤药物或者放射诱发的初始DNA链末端。
试验干扰假阴性：在某些形式的细胞凋亡中，DNA逃逸酶切或者不完全（37）。
罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序（In situ cell death detection kit-POD法）一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70％）、DAB工作液（临用前配制，5 µl 20×DAB＋1μL30％H2O2＋94 µl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5, 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
罗氏 (Roche)公司 Tunel 试剂盒操作说明书(In situ cell death detection kit-POD法)一、原理：TUNEL （TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA 的断裂情况。
其原理是荧光素（ fluorescein）标记的 dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（ TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA 的3’-OH 末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与 HRP 底物二氨基联苯胺（DAB ）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 断裂，因而没有 3‘-OH 形成，很少能够被染色。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。
还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1 号（蓝盖） Enzyme Solution 酶溶液： TdT 10×、2号（紫盖） Label Solution 标记液：荧光素标记的 dUTP 1×、3号（棕瓶） Converter-POD:标记荧光素抗体的 HRP；自备试剂： PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB 工作液（临用前配制， 5 μl 20 ×DAB+1 μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（ 10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl ，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于 0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、 DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl ，pH 7.5， 10 mM MgCl2 ，1 mg/ml BSA ）等。
三、实验步骤操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL 反应液→加 converter-POD→与底物 DAB 反应显色→光学显微镜计数并拍照。
具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：1.用二甲苯浸洗 2 次，每次 5min；2.用梯度乙醇（ 100、95、90、80、70%）各浸洗 1 次，每次 3min；注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理4.用 Proteinase K工作液处理组织 15-30 min 在 21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的Proteinase K（400μg/mL ）处理 5 分钟。
其它替代方法：石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即蛋白酶 K 处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：替代方法1: 将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液：0.1%TritonX-100 溶于 0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）替代方法2：将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min（胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于 HCl PH2 ，胰蛋白酶 0.25%-0.5%溶于 0.01N HCl ）替代方法3: 将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M 的柠檬酸缓冲液 PH 6 的塑料盒中，置于微波炉中 350W（低档）处理 5 min。
5.PBS 漂洗 2 次；6.制备 TUNEL 反应混合液：处理组用 50μl 1 号液+450μl 2 号液混匀；而阴性对照组仅加50μl 2号液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在 15~25℃× 10min，后面步骤同处理组。
7.玻片干后，加 50μl TUNEL 反应混合液（阴性对照组仅加 50μl 2号液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃× 1h。
8.PBS 漂洗 3 次；9.可以加 1 滴 PBS 在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450~500nm，检测波长为 515~565nm）；10.玻片干后加 50μl 3号液（ converter-POD）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应 37℃× 30min。
11.PBS漂洗 3 次；12.在组织处加 50~100μl DAB 底物，反应 15~25℃× 10min；13.PBS 漂洗 3 次；14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。
梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
15.加一滴 PBS 或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200~500 个细胞）并拍照。
可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状 /凋亡小体）对于培养细胞的预处理：①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸，干燥后在去离子水中漂洗，干燥后 4℃保存；②适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集约1×106 个细胞， PBS 洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上；③将吸附细胞的载玻片在 4%多聚甲醛中固定 25min；④PBS 浸洗二次，每次 5min；⑤将吸附细胞的载玻片在 0.2%的 Triton X-100 中处理 5min；⑥PBS 浸洗二次，每次 5min；后续操作如同石蜡包埋切片的6-15四、注意事项1.进行 PBS 清洗时，每次清洗 5 min。
2.PBS 清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去 PBS 溶液后再进行下一步反应。
3.在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。
4.TUNEL 反应液临用前配制，短时间在冰上保存。
不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。
5.如果 20×DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。
6.用甲基绿（ Methyl Green）染液（ 3-5%甲基绿溶于 0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。
然后进行洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。
如果此时使用 80~90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。
7.2 号液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。
8.试剂保存；未打开的试剂盒贮存在-20℃（-15~25℃）；3号液（converter -POD）液一旦解冻，以后就保存在 4℃（ 2~8℃）下，至少在 6 m 内稳定，避免再次冻存；TUNEL 反应液临用前配好后，放至冰上直至使用。
9.结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖 /代谢的组织细胞中可产生大量 DNA 片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏 DNA 断裂或 DNA 裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止 TdT 进入胞内反应，进而产生假阴性结果。
常见问题的原因及推荐解决方案现象非特异性染色可能原因建议TdT 酶的浓度过高用 TdT dilution buffer* 作 1︰ 2—1︰ 10 稀释TdT 酶反应时间过长或 TdT 酶反应过程中反应液注意控制反应时间，并确保TdT 酶反应液能渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。
很好地覆盖样品。
光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂会导致样本 DNA 的断裂）在固定组织时样本 DNA 已断裂（内源核酸酶的作确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注用）固定使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液采用推荐的固定液固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA 断裂用含有 dUTP 和 dAPT 的溶液封闭如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因用溶于 PBS PH7.4 中的 4%多聚甲醛固定为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中或福尔马林或戊二醛固定。
丢失）标记率低荧光背景很高固定时间过长，导致交联程度过高荧光淬灭促渗条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低支原体污染TdT 酶的浓度过高或反应时间过长红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。
高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。
减少固定时间，或用溶于 PBS PH7.4 的2%多聚甲醛固定Fluorescence 在普通光照 10 分钟就会严重淬灭，需注意避光操作1、增加通透剂促渗时间2、增加通透剂的作用温度（15-25 ℃）3、优化蛋白酶K 的作用浓度和作用时间（如：以400ug/ml 作用 5min）4、0.1M 的柠檬酸钠70℃作用 30min 。
请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染用TdT dilution buffer* 作 1︰2— 1︰10 稀释或注意控制反应时间宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。
1、冷冻切片使用3u/ml的DNase I阳性对照DNase I 的浓度过低2、石蜡切片使用1500u/ml 的DNase I 没有信号3、一般样本使用10u/ml DNase I组织样本从载玻片组织样本被酶从玻片消化下来降低蛋白酶K的处理时间脱落TdT dilution buffer ：60 mMKPB缓冲液（pH7.2），150 mMKCl，1 mM2-mercaptoethanol，50 %Glycerol。
