第二章 微生物的纯培养和显微技术

第二章微生物的纯培养和显微技术第二章微生物的纯培养和显微技术第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术在分离、转接及培养纯培养物时防止被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为无菌技术。

1、微生物培养的常用器具及其灭菌（1）试管、玻璃烧瓶、培养皿。

（2）高压蒸汽灭菌，杀灭所有的微生物，包括休眠体，同时可保持培养基的营养成分不被破坏。

（3）高温干热灭菌。

2、接种操作无菌条件下，用接种环在火焰附近进行操作，或在无菌操作箱或操作室内进行。

二、用固体培养基获得纯培养1、菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。

菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。

2、涂布平板法3、稀释倒平板法4、平板划线法5、稀释摇管法对氧气更加敏感的厌氧型微生物。

先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热，使琼脂融化后冷却，将微生物进行梯度稀释，冷凝后，在琼脂表面倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基隔开。

三、用液体培养基获得纯培养对一些个体大的细菌、许多原生动物、藻类。

稀释法。

接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。

经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。

只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类。

四、单细胞（孢子）分离采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。

较大的微生物较容易，个体较小的较难。

对较大微生物，用毛细管提取个体，在低倍显微镜下操作；对较小微生物，采用显微操作仪。

五、选择培养根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制大多数其他微生物生长，或造成有利于该菌生长的环境，培养一段时间后，通过平板稀释等方法进行纯培养分离。

1、选择平板培养2、富集培养制定特定的环境，使仅适应于该条件的微生物生长。

[精品]微生物的纯培养和显微镜技术第2章微生物的纯培养和显微镜技术重点、难点剖析1(无菌技术是最基本的微生物学实验操作技术，其核心是无菌概念的建立，以及正确而严格地按实验教材和实验课的要求，掌握在各种情况下的具体应用原则和操作规范。

2(分离获得某特定的微生物纯培养，是研究和利用微生物的基础。

获得纯培养的方法有固体培养基分离、液体培养基分离和单细胞挑取3大类(表2—1)，其中用固体培养基获得单独的微生物菌落是最常用、最基本的方法。

此外还有活细胞或活体分离法，如噬菌体和动植物病毒纯培养的分离等。

表2-1 获得微生物纯培养的方法比较方法特点应用菌落分离较为均匀，进行微生这3种方法可用于所有在固物计数结果相对准确。

但操作体培养基表面形成菌落的稀释倒平板法相对麻烦，热敏感菌有时易被微生物的纯培养分离。

并烫死，而严格好氧菌也可能被且，通过选用适当的选择平固体培养基分离固定在培养基中生长受到影响板及培养条件可直接分离各种具有特定生理特征的操作相对简单，是较常使用的微生物。

和厌氧罐或厌氧手常规方法。

但有时会因涂布不套箱技术结合，这3种方法涂布平板法均匀使某些部位的菌落不能分也可用于获得各种厌氧开，进行微生物计数时需对稀菌的纯培养释和涂布过程的操作特别注意，否则不易得到准确结果平板划线法操作简单，多用于对已有纯培养的确认和再次分离稀释倒平板的一种变通形式，在缺乏专业的厌氧操作设稀释摇管法但由于菌落形成在琼脂柱的中备的情况下对严格厌氧菌间，观察和挑取都相对困难进行分离和观察工作量大，是否获得纯培养需不能或不易在固体培养基稀释法依靠统计学的推测上生长的微生物进行纯培养分离或数量统计一般不能直接获得微生物的纯1)根据某种微生物的特殊液体培养基分离培养，在通过富集培养使原本生长要求，按照意愿从自然在自然环境中占少数的微生物界中对这种微生物进行有富集培养的数量大大提高后，需再通过针对性的有效分离;2)分离平板法进行相应富集培养微生培养出由科学家设计的特物纯培养的分离和检测定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长分离过程直观，可靠，但对仪从样品中直接分离所需的器和操作技术要求较高，多限微生物细胞或孢子，获得其单细胞(孢子)于高度专业化的研究，而挑取纯培养显微操作挑取的微生物单细胞或孢子需经固体或液体培养基培养后才能获得其纯培养物3(保证所用菌种性状的稳定是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。

第二章微生物的纯培养和显微镜技术2．纯培养和显微技术一、纯培养技术1、无菌技术包括两方面的内容：（1）用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；(2)在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，其自身也不污染环境；2、分离纯化技术（1）固体培养基分离纯培养技术微生物个体微小，常以群体混合状态存在，将单个细胞从群体中分离出来，即纯培养。

菌落：单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。

菌苔：众多菌落连成一片。

获得纯培养的方法有：倾注平板法：操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！涂布平板法：使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！平板划线法：厌氧微生物的分离：（2）液体培养基分离纯培养稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。

（3）选择培养分离：抑制大多数其它微生物的生长；使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。

使待分离的微生物生长“突出”；直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。

3、单细胞分离技术用显微操作仪，在显微镜下进行。

难度与细胞或个体的大小成反比，局限于高度专业化的科学研究中。

4、选择培养分离选择平板：抑制大多数微生物不能生长，或具区别特征的直观结果。

富集培养：造成有利于某种菌生长的环境。

（1）利用选择平板进行直接分离高温培养分离嗜热菌，培养基中不含有N，分离固氮菌；培养基中含有抗生素分离抗生菌。

牛奶培养基分离产蛋白酶菌株。

（2）富集培养利用不同微生物之间的生长特性不同，制定特定的环境条件，使仅适合条件的微生物旺盛生长，从而使其在为生物群落中的比率大大增大，易于从群落中间将墓地君主分离出来。

5、二元培养物培养物中只含有二种微生物，而且有意识地保持二者之间的特定关系的培养物。

如病毒与宿主；蛭弧菌与和E.coli.6、微生物的保藏技术影响微生物菌种稳定性的因素：a. 变异；b. 污染；c. 死亡基本要求：在一定时间内使菌株不死，、不变、不乱基本方法生活态：培养基传代培养（斜面、平板、半固体），多见于冰箱4℃培养。