第二章微生物的纯培养和显微技术.pptx

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2 微生物的纯培养和显微技术

2 、扫描电镜（ scanning electron microscope, SEM ）
电子束做电子探针在样品表面激发出二次电子，二次电子产生的多少与样品表面立体形貌有关。对二次电子处理，在荧光屏呈现放大样品立体图像。主要用于观察微生物的表面三、显微镜观察样品的制备结构。
1 、光学显微镜制样 2 、电子显微镜制样
4m 0m 焦f 距（） 12m 70 m 工离作距 4 n光蓝 2 µ 5 m源 0 . m 3 （光的率）分时辨
2 、特殊功能的光学显微镜
名称普通光学镜光源可见光特殊装置视野亮样品处理与观应用察染色、清晰形态结构观察
暗视野镜相差镜
可见光特殊聚光器可见光环状光阑，相差板短波光滤光片
基分离
富集培养目的菌验证
选择培养
练习思考题：
利用选择培养基如何筛选：（ 1 ）抗链霉素（ str ）细菌？（ 2 ）降解利用尿素的细菌？（ 3 ）分解利用纤维素的细菌？利用富集培养和选择培养如何分离：（ 1 ）如何从土壤中分离筛选高温（ 70℃ ）解烃细菌？（ 2 ）如何从污染废水中分离筛选苯胺降解细菌？
同一稀释度培养 20 支
生长者为纯培养物
三、单细胞（孢子）分离
营养琼脂平板不能形成菌落的微生物解剖显微镜下用吸管挑选单细胞（孢子）显微镜下用显微操作仪挑选单细胞（孢子）操作难度与单细胞（孢子）大小成反比
四、选择培养分离
原理：创造适于目的微生物生长条件促使目的微生物快速生长成优势菌抑制非目的微生物生长从混杂微生物中选择分离目的微生物 1 、利用选择培养基直接分离目的微生物选择培养基（ selective medium ）只允许特定微生物生长，而同时抑制或阻止其它微生物生长的培养基。

第二章微生物的纯培养和显微技术

▲ 子实体
大
侧
型
耳
真
菌
（2）霉菌的形态
分枝或不分枝。管状。
在固体培养基上营养菌丝：部分菌丝伸入培养基
内吸收养料。
气生菌丝：菌丝伸入空中生长繁殖菌丝：由气生菌丝发育到一
定阶段分化而成。
（3）与人类的关系
人类实践活动中最早认识和利用的一类微生物。
■制曲、酿酱等发酵食品 ■发酵工业：生产酒精、柠檬酸、酶制剂 ■农业：饲料发酵、生产赤霉素、杀虫农药、除草剂 ■堆肥腐熟 ■引起农副产品、衣物、食品、器材发霉 ■引起动植物体病害：黄曲霉
单细胞
三种基本形态
球状菌杆状菌螺旋状菌
弧菌螺菌
（1）球状菌
球状或扁圆状
单球菌（尿微球菌）双球菌（肺炎双球菌）链球菌（乳酸链球菌）四联球菌（四联细球菌）八叠球菌（尿素八叠球菌）
葡萄球菌（金黄葡萄球菌）
▲单球菌
分裂后的细胞分散而单独存在的球菌. 如尿素微球菌 (Micrococcus ureae
小单胞菌属
形态：只有基质菌丝，上生孢子梗，顶生一个孢子。
特性：产庆大霉素繁殖：孢子生殖
弗兰克氏菌属
赤
杨
形态特性：共生菌。与非豆科木本植物根形成根瘤。固氮。不易人工
形成根瘤
根与弗兰克
培养。
氏菌
繁殖：孢囊孢子生殖。
放线菌属于细菌，在防病治病、工农业生产中有特殊重要性。
粮食、食物、用具、器材。耐较酸环境。
二真核微生物的个体形态
1 霉菌（mold） 2 酵母菌（Yeast） 3 大型真菌 4 藻类（Algae） 5 原生动物（Prokaryote）
1 霉菌（mold）

《纯培养和显微技术》课件

聚焦
通过旋转物镜或移动载物台，使样本清晰地呈现在观察者眼前。
放大倍数选择
根据需要选择适当的放大倍数，以便观察样本的细节。
观察与记录
观察
观察样本，记录所观察到的特征和细节。
拍照记录
使用显微镜自带的拍照功能或外部相机拍摄样本照片，以便后续分析和研究。
记录整理
将观察结果和照片整理成完整的实验报告或数据记录。
电子显微镜原理
利用电子束代替光线，通过电磁透镜将电子束聚焦在样本上，然后通过荧光屏或CCD相机将样本的图像呈现给观察者。
显微技术的应用场景
生物学研究
用于观察细胞、组织、微生物等的结构和形态
。
医学诊断
用于观察病理切片、细胞涂片等的结构和形态，辅助医生进行疾病诊
断。
环境监测
用于观察水体、土壤、空气等的微小颗粒和微生物，评估环境质量。
微生物的繁殖原理
微生物在适宜的条件下进行生长繁殖，通过不断的分裂和代谢活动，最终形成大量的微生物细胞。控制培养条件可以控制微生物的生长速度和代谢产物，以满足不同研究和应用的需求。
纯培养技术的应用场景
微生物分类学研究
通过纯培养技术获得单一或少数几种微生物，可以更好地研究其形态、生理生化特性等，为微生
纯培养技术的重要性
纯培养技术是微生物学研究和应用的基础，通过该技术可以获得单一或少数几种微生物，以便更好地研究其生物学特性、生长繁殖条件、代谢产物等，为工业生产、生物工程等领域提供技术支持。
纯培养技术的原理
微生物的分离原理
通过在选择性培养基上接种混合微生物，根据不同微生物对营养、pH、温度等条件的需求不同，选择适合某一或少数几种微生物生长的条件，使其他微生物无法生长，从而获得单一或少数几种微生物的纯培养。

微生物学_02微生物的纯培养和显微技术

保存，或-70度冷冻室保存，-20~-30度普通冰箱冷冻室保存。
干燥保藏——砂土管保存法和冷冻真空干燥保
藏法
2.2 显微镜和显微技术
决定显微观察效果的两个重要因素
分辨率：指能辨别两点之间最小距离的能力反差：指样品区别于背景的程度
2.2 显微镜和显微技术
2.2.1. 显微镜的种类及原理 2.2.2. 显微观察样品的制备
②高压法：锅内增加压力时则温度随之增高。
温度为112.6℃；灭菌30分钟。
温度为120～121℃；灭菌20分钟。
3. 过滤除菌法本法系用滤过方法除去活的或死的微生物的方
法，是一种机械除菌的方法。本法主要用于对热极不稳定的药物小针剂或冻干粉针制剂的除菌。除菌过滤器采用孔径分布均匀的微孔滤膜作过滤材料，为保证阻止细菌和细菌孢子通过滤器，滤膜的孔径一般不超过0.22μm。
将光的相位差转变为人眼可见的振幅差（明暗），使能不染色而看到活细胞及细胞内的某些显微结构。

其发明人F.Zernike因此获1953年诺贝尔物理奖。
4. 荧光显微镜
荧光显微技术原理：荧光素吸收uv放出波长较长的可见光，因此在uv照射下，发荧光的物体会在黑暗背景显现为光亮有色物体。在免疫学和分子生物学应用广泛。
分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。
D = 0.61λ/ N．A = 0.61λ/ｎsinα/2 ．
其中λ为入射光线波长；N．A．为镜口率＝ｎsinα/2，
n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。
思考：如何提高显微镜的分辨能力？
显微镜的几个光学特点
制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介
菌丝埋片法：无菌小玻璃纸铺平板表面，涂布孢子悬

第二章微生物的纯培养和显微技术精品PPT课件

如四联微球菌（Micrococcus tetragenus）
四联球菌
▲八叠球菌按三个互相垂直的平
面进行分裂后，每八个球菌在一起成立方体形.
如藤黄八叠球菌
（Sarcina ureae)
八叠球菌
▲葡萄球菌分裂面不规则，多个球菌
聚在一起，像一串串葡萄。如金黄色葡萄球菌
（Staphylococcus aureus)
第二节显微镜和显微技术
显微镜自身特点
放大倍数分辨率反差
显微观察效果
操作者技能
显微镜使用标本制作观察技术
一显微镜的种类及原理二显微观察样品的制备
一显微镜的种类及原理
普通光学显微镜暗视野显微镜（视野暗，样品亮。细菌运动）相差显微镜（不染色观察细微结构）荧光显微镜（黑暗时荧光素吸收紫外线放出可见光）电子显微镜
第二章微生物的纯培养和显微技术
第一节微生物的分离和纯培养第二节显微镜和显微技术第三节原核微生物第四节真核微生物
第一节微生物的分离和纯培养
微生物的培养物（culture) 微生物的纯培养物(pure cultrue) 微生物的纯培养技术
无菌技术
防止实验操作过程中其被其他微生物污
显微镜的数值孔径与镜口角及工作距离间的关系 η.sinθ——数值孔径NA。
低倍镜高倍镜
油镜
以空气做介质同以香柏油做介质的比较 η.sinθ——数值孔径NA。
(a)×500
(b)×175
(c)×210
(a) (b)暗视野显微镜观察 (c) (d) (e)相差显微镜观察
(d)×600
(e)×100
普通光学显微镜
机械装置——镜座、支架、载物台、调焦螺旋光学系统——物镜、目镜、聚光器

微生物的纯培养及显微技术

物的生长繁殖而对被消毒的物体基本无害的措施。如低温、缺氧、干燥、高酸、高渗或防腐剂。细菌一般不死亡。
●无菌(asepsis)：不存在活菌。
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（1）常用物理消毒灭菌方法 ● 热力灭菌法； ● 辐射杀菌法； ● 滤过除菌法； ●超声波杀菌法。
A、热力灭菌法
●干热灭菌法
▲焚烧：废弃物、尸体； ▲灼烧：接种环、试管口；
● 连续加压灭菌：135-140 ℃下处理5-15 s ，主要适用于大
规模的发酵工厂培养基灭菌；
● 常规加压灭菌：121 ℃（压力：1kg/cm2 或15 磅/英寸）
15~20 min，是一种最为广泛的灭菌方法。 ▲ 注意灭菌物体含菌量的影响，含菌量越高灭菌时间越长。
天然原料＞化学试剂
▲ 空气的排除程度，必须尽量驱尽锅内空气。是依靠温度而
▲ 加热与散热的速度。
B、辐射杀菌法；
● 紫外线：波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用。其主要作
用于DNA，使一条DNA链上相邻的两个胸腺嘧啶共价结合形成二聚体，导致细菌变异和死亡。
●电离辐射：高速电子、X射线、γ射线
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洁净工作台
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● 微波：波长1mm~1m
C、过滤除菌法
● 赛氏滤器； ● 玻璃滤器； ● 薄膜滤器
D、超声波杀菌法
● 是一种机械的作用因素，每秒超过2万次振动的声波即为超声波。常用的超声波发生器能产生20-100千赫的声波。可使细菌细胞壁裂解而死亡。
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超声仪
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（2）化学消毒剂：
● 消毒剂的种类：酚类、醇类、重金属盐类、氧化
★ 最后一个稀释度 95%表现为不生长。

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菌落：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。
菌落
菌落或菌苔是对微生物进行分类和鉴定的重要依据。
细菌菌落特征剖面板
培养平板（平板）：指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。
菌种保藏方法
连续移接改变条件（干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）
使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保藏，有的可保藏几十年或更长的时间。在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力。
1、传代培养保藏
是微生物保存的基本方法。琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培养等。橡皮塞封口或用石蜡覆盖，并放置低温
冷冻真空干燥保藏
是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在真空下通过水的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以达到长期保藏的目的。
用水升华的方式除去水分，手段比较温和，细胞受损伤的程度相对比较小，存活率及保藏效果均不错，是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法。
保藏期间微生物不死亡、不污染、不会因发生而丢失重要的生物学性状。
许多国家都设有相应的菌种保藏机构：
中国微生物菌种保藏委员会美国典型菌种保藏中心世界菌种保藏联合会等
菌种保藏
菌种保藏：就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。
对于生产中使用的菌种保藏培养基，要求比较丰富的氮源，以防止菌种退化变质。
五、选择培养分离
当某一种微生物所存在的数量与其他微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释方法几乎是不可能分离到该种微生物的，故需采用选择培养分离法。
1、利用选择培养基进行直接分离
如要分离高温菌，可在高温条件进行培养；要分离某种抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上进行分离。
2、富集培养
平板分离微生物纯培养技术
稀释倒平板法涂布平板法平板划线分离法稀释摇管法
1、稀释倒平板法：
无菌水、梯度稀释、50℃左右的琼脂培养基、灭过菌的培养皿。注意要稀释得当。
分离出单个菌落以后，重复上述操作数次，便可得到纯培养。
稀释倒平板法
Pour plate
涂布平板法
无菌水、梯度稀释涂布平板
第二节显微镜和显微技术
显微镜的种类及原理显微观察样品的制备
一、显微镜的种类及原理
普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜荧光显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜扫描隧道显微镜
普通复式光学显微镜
普通生物显微镜由三部分构成： ➢ 照明系统：包括光源和聚光器。 ➢ 光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成。 ➢ 机械装置：保证光学系统的准确配制，用于固定材料和观察方便。
保存。 4℃保存。
2、冷冻保藏
代谢作用停止。细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比
有细胞壁敏感。其原因是低温会使细胞内水分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。速冻及快速解冻可减少损伤；还可加一些保护剂，如0.5% 左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞；大分子物质因此在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。
分辨率
第三章微生物的纯培养和显微技术
A：研究微生物的途径：（群体）培养物：在微生物学中，在人为规定的条
件下培养，繁殖得到的微生物群体。纯培养物：只有一种微生物的培养物。
（利于研究、应用、重复结果） B：利用显微技术进行研究
显微技术包括显微标本的制作、观察、测定、分析及记录等方面的内容。
第一节微生物的分离和纯培养
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。
富集条件：物理、化学和生物等。以从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验为例。
六、微生物的保藏技术
3、干燥保藏法
沙土管保存和冷冻真空干燥保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。
沙土管保存
一般将菌种接种至斜面，培养至长出大量的孢子后，洗下孢子制备孢子悬浮液，加入无菌沙土试管中，减压干燥，直至将水分抽干，最后用石蜡、橡胶塞等封闭管口，置冰箱保存。此法主要适用于产孢子的微生物，如芽孢杆菌、放线菌等，保藏时间相对较长。
Spread plate
稀释倒平板法和涂布平板法
平板划线分离法
稀释摇管法
用于分离严格厌氧菌。先将一系列盛有无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基与空气隔开。
无菌技术用固体培养基分离纯培养用液体培养基分离纯培养单细胞（单孢子）分离选择培养分离
一、无菌技术
无菌技术：在分离、转接及培养纯培养(物)时防止其被其他微生物污染的技术。
保持无菌的方法
高压蒸气灭菌高温干热灭菌棉塞超净工作台等
接种操作
二、用固体培养基分离纯培养
三、用液体培养基分离纯培养
用于细胞大的细菌、原生动物和藻类等的纯化分离。
稀释法：经高度稀释后，同一个稀释度的试管中大多数（95%以上）表现不生长，很可能得到的是纯培养。
四、单细胞（单孢子）分离
单细胞分离：采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。
单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比。个体较大的可在低倍显微镜下进行，个体较小的则需采用显微操作仪。