黑曲霉_葡萄糖苷酶的活力测定和酶学性质(1)
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两种曲酶糖化性质的比较研究在国内传统的制酒行业中,由于黑曲霉含有丰富的酶系如液化酶、糖化酶、纤维素酶和蛋白酶等,自70年代大多都由米曲霉改为黑曲霉作糖化用菌种。
但在日本迄今仍在采用米曲霉做糖化菌,说明其中必有原因。
鉴于此,本实验以黑曲霉和米曲霉为研究对象,研究比较它们的液化酶和糖化酶(葡萄糖淀粉酶)生产性质。
黑曲霉是一种常见的真菌, 属于半知菌类曲霉属。
黑曲霉对营养要求较低, 只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好。
黑曲霉可以产生许多种酶, 现已成为工业应用常见的菌种之一。
根据bigelis1989年的统计, 25种主要商品酶制剂中就有15种来源于黑曲霉仁, 。
它们分别是α-淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、半纤维素酶、橙皮昔酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶。
美国准许使用的食品工业用酶生产菌种只有黑曲霉、酵母、枯草杆菌等约20种, 其中以黑曲霉所产酶类最多。
我国酶制剂工业生产用菌种中, 黑曲霉占了17种中3种, 即黑曲霉变异株和,它们分别用于糖化酶、果胶酶和酸性蛋白酶的生产[1]。
黑曲霉酶类在工业上具有重要的作用, 例如, 柠檬酸等有机酸的发酵生产、食品及饮料加工以及用于轻化工业、纺织工业、饲料加工和废物的处理等等。
总之, 黑曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点, 已愈来愈受到人们的重视。
米曲霉的菌丝由多细胞组成,是一类产复合酶的菌株,除产蛋白酶外,还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。
在淀粉酶的作用下,将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类,如麦芽糖、葡萄糖等;在蛋白酶的作用下,将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸,而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解,提高营养价值、保健功效和消化率,广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。
1 材料与方法1.1材料菌种:黑曲霉UV-48;米曲霉-41.2培养基种子培养基(土豆汁培养基;察式培养基);发酵培养基(麸皮培养基;液体深层发酵液)1.3试剂1.33%可溶性淀粉;碘液;0.01MNacl-HAC缓冲液;6NHCL;DNS试剂;葡萄糖标准溶液1.4实验仪器电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司,DK-8D);721型分光光度计(上海欣茂仪器有限公司,2C409035);立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂,LDZX-75KB);恒温培养箱(上海实验仪器厂有限公司,DHP060);气浴恒温摇床(太仓市实验设备厂,TCYQ)。
内生黑曲霉产脂肪酶条件研究及其粗酶酶学特性何茹;刘娅;谢晓霞;王陈强【摘要】针对新疆酿酒葡萄中获得的1株产脂肪酶的内生黑曲霉菌株C2J6,研究了该菌株的产酶条件及酶学特性.结果表明,该菌适宜的产酶条件为1%的乳糖为碳源,1%的蛋白胨为氮源,培养基初始pH值为8.0,培养温度35℃,培养时间约72h,此时所产脂肪酶的活力可达18.75U/mL.该菌所产脂肪酶粗酶液的最适反应温度为40℃,最适反应pH值为7.0,为中温中性酶;在50℃保温1h酶活力保留54.55%,具有良好的热稳定性;在pH值3.0~7.0范围内较稳定,有一定的耐酸性.金属离子Mn2+对酶活力有促进作用,Zn2+、Fe2+、Cu2+对酶活力有抑制作用,K+、Ca2+、Na+、Mg对酶活力影响不大.该酶在以葵花油和谷物调和油为底物时,酶活分别为228%和180%,明显高于橄榄油和油烟机废油.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2014(033)003【总页数】5页(P52-56)【关键词】内生黑曲霉;脂肪酶;产酶条件;酶学特性【作者】何茹;刘娅;谢晓霞;王陈强【作者单位】石河子大学食品学院,新疆石河子832000;石河子大学食品学院,新疆石河子832000;新疆冠农果茸集团股份有限公司技术中心,新疆库尔勒841000;新疆冠农果茸集团股份有限公司技术中心,新疆库尔勒841000【正文语种】中文【中图分类】TQ925脂肪酶(EC3.1.1.3)又称三酰基甘油酰基水解酶,可将甘油三酯分解成脂肪酸和甘油或进行其逆反应,在油-水界面及非水介质中催化酯的水解和合成,酯交换,催化生物表面活性剂、高聚合物、多肽和手性药物的有机合成反应等[1]。
目前,脂肪酶已广泛应用于食品、香料、医药、化妆品、洗涤剂、皮革、药物合成、有机合成等领域[2-4]。
微生物脂肪酶因其具有较动植物脂肪酶更好的稳定性、选择性、底物特异性、更广的作用pH值和温度范围,且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶,便于工业化大生产和获得高纯度样品,因此成为工业脂肪酶的最重要来源。
两种曲酶糖化性质的比较研究在国内传统的制酒行业中,由于黑曲霉含有丰富的酶系如液化酶、糖化酶、纤维素酶和蛋白酶等,自70年代大多都由米曲霉改为黑曲霉作糖化用菌种。
但在日本迄今仍在采用米曲霉做糖化菌,说明其中必有原因。
鉴于此,本实验以黑曲霉和米曲霉为研究对象,研究比较它们的液化酶和糖化酶(葡萄糖淀粉酶)生产性质。
黑曲霉是一种常见的真菌, 属于半知菌类曲霉属。
黑曲霉对营养要求较低, 只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好。
黑曲霉可以产生许多种酶, 现已成为工业应用常见的菌种之一。
根据bigelis1989年的统计, 25种主要商品酶制剂中就有15种来源于黑曲霉仁, 。
它们分别是α-淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、半纤维素酶、橙皮昔酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶。
美国准许使用的食品工业用酶生产菌种只有黑曲霉、酵母、枯草杆菌等约20种, 其中以黑曲霉所产酶类最多。
我国酶制剂工业生产用菌种中, 黑曲霉占了17种中3种, 即黑曲霉变异株和,它们分别用于糖化酶、果胶酶和酸性蛋白酶的生产[1]。
黑曲霉酶类在工业上具有重要的作用, 例如, 柠檬酸等有机酸的发酵生产、食品及饮料加工以及用于轻化工业、纺织工业、饲料加工和废物的处理等等。
总之, 黑曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点, 已愈来愈受到人们的重视。
米曲霉的菌丝由多细胞组成,是一类产复合酶的菌株,除产蛋白酶外,还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。
在淀粉酶的作用下,将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类,如麦芽糖、葡萄糖等;在蛋白酶的作用下,将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸,而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解,提高营养价值、保健功效和消化率,广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。
1 材料与方法1.1材料菌种:黑曲霉UV-48;米曲霉-41.2培养基种子培养基(土豆汁培养基;察式培养基);发酵培养基(麸皮培养基;液体深层发酵液)1.3试剂1.33%可溶性淀粉;碘液;0.01MNacl-HAC缓冲液;6NHCL;DNS试剂;葡萄糖标准溶液1.4实验仪器电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司,DK-8D);721型分光光度计(上海欣茂仪器有限公司,2C409035);立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂,LDZX-75KB);恒温培养箱(上海实验仪器厂有限公司,DHP060);气浴恒温摇床(太仓市实验设备厂,TCYQ)。
黑曲霉ZJ1摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶的研究刘小杰(浙江大学食品科学与营养系,杭州310029)陶飞 童纪峰(杭州娃哈哈集团有限公司科委,杭州310018)摘要:本文研究了黑曲霉ZJ1发酵产β-葡萄糖苷酶的发酵条件及β-葡萄糖苷酶的酶学性质。
结果表明:黑曲霉摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶的培养基组成为(g/L):稻草50,麦麸15,大麦粉15,(NH4)2SO410,KH2PO4 0.5,MgSO4·7H2O0.5,起始pH5.0。
产酶条件为:培养温度28℃,转速为200r/min,当培养时间为144h,β-葡萄糖苷酶活性达到最大。
β-葡萄糖苷酶的最适作用温度为50℃,在40℃时热稳定性较好;β-葡萄糖苷酶的最适反应p H为5.5,在p H3.0~p H8.0之间较稳定;Zn2+、Al3+、Ca2+和Mn2+对β-葡萄糖苷酶酶促反应均有一定的促进作用。
关键词:黑曲霉,β-葡萄糖苷酶,稻草粉,发酵Study ofβ-Glucosidase Produced by As pe rgillus Niger ZJ1Liu Xiaojie(Department of Food Science and Nutrition,Zhejiang University,Hangzhou310029)Liu Xiaojie,Tao F ei,Tong Jifeng(R&D Department of Hangzhou Wahaha Group Company Limited,Hangzhou310018)A bstract:This paper studied the fermentation condition and properties ofβ_glucosidase b y As pergillius niger.Experimental re-sults demonstrated that cultivation medium composition was as follows(g/L):rice straw powder50,wheat bran15,barley flour 15,(NH4)2SO410,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O0.5,initial pH5.0.The maximumβ_glucosidase activity reached at28℃with RPM of200r/min when cultured144hours.β_glucosidase's optimum temperature was50℃,and it was stable under40℃.Its optimu m p H was5.5and it was stable in p H3.0~pH8.0.Metal cation influence enzyme activity,Zn2+、Al3+、Ca2+and Mn2+have active effects on enzyme activity.Key words:As pergillius nig er,β_glucosidase,Straw powder,Fermentation 目前应用最广、研究最为深入的纤维素酶生产菌种,大多是里氏木霉(Trichoderma reesei)的优良突变株,虽然这些菌株能产生高活力的内切型及外切型葡聚糖酶,但不足之处在于β_葡萄糖苷酶产量很低。
第26卷第2期2007年3月 食品与生物技术学报Journal of Food Science and Biotechnology V o l.26 N o.2M ar. 2007 文章编号:1673-1689(2007)02-0107-08 收稿日期:2006-12-29.作者简介:李华(1959-),男,重庆梁平人,教授,博导,主要从事分子生物学及葡萄与葡萄酒方面研究.Email :putj@β-葡萄糖苷酶活性测定方法的研究进展李华, 高丽(西北农林科技大学葡萄酒学院,陕西杨凌712100)摘 要:介绍了葡萄和葡萄酒中β-葡萄糖苷酶的研究概况,理化性质、酶活测定方法,以及不同来源的酶活检测的研究概况,并且经过分析提出以对硝基苯基β-D -葡萄糖苷(pN PG )为底物检测葡萄浆果中的β-葡萄糖苷酶酶活的关键影响因素:粗酶液的制备、酶最适反应温度、最佳反应时间、缓冲液类型和pH 及最佳吸收波长。
关键词:葡萄;β-葡萄糖苷酶;活性中图分类号:Q 55文献标识码:AResearch Advance on Methods of determining β-Glucosidase ActivityLi Hua , GAO Li(Colleg e of Enolo gy ,N o rthwest Univ ersity of A g riculture &Fo restry ,Yangling 712100,China )Abstract :Aro ma is one o f the impor tant factors that determining the character and quality o f w ine.β-g lucosidase is a kind of key enzy me w hich releasing aroma precurso rs.In this manuscript ,the prog re sses of the chemical pro perties ,determination methods ,and the source o f β-g lucosidase w ere review ed.On the o ther hand ,the key facto rs that involv e in the β-gluco sidasedetermination method w ith p -Nitrophenyl -β-D -gluco py ranoside as substrate as follow :tem perature ,reactio n tim e ,buffe r type ,pH and abso rb w avelength.Key words :g rape ;β-glucosidase ;activities 典型的葡萄酒风味主要源于葡萄中的挥发性化合物,然而葡萄浆果中存在着游离态和结合态两大类呈香物质。
电化学法测量黑曲霉孢子萌发过程中葡萄糖氧化酶的活性刘洋汝;李忠海;任佳丽【摘要】In this study, the electrochemical cyclic voltammetry method was developed for the determination of activity of glucose oxidase.The ferrocene methanol was introducing as the redox probes on cyclic voltammetry, using glassy carbon electrode as working electrode, saturated calomel electrode as reference electrode, platinum wire electrode as the counter electrode and the peak current value of different enzyme activity was required.There was a linear relationship between the peak current in enzyme concentration of 1.282~2.377 U/mL with the correlation coefficient as 0.998, the detection limit as 1.282 U/mL.The enzyme activity of spores from dormancy to germination was detected by this new method, as the enzyme activity of spores decreased after increasing first, reaching the maximum (2.130 U/mL).The traditional methods were tested at the same pared with the traditional method, the proposed electrochemical method has the characteristics of accurate, fast and convenient.%建立了电化学循环伏安法测定葡萄糖氧化酶活性的方法.该方法引入二茂铁甲醇作为氧化还原探针,以玻碳电极作为工作电极、饱和甘汞电极作为参比电极、铂丝电极作为辅助电极,采用循环伏安法,得到不同酶活的峰电流值,在酶浓度为0.128~2.377 U/mL,酶浓度与峰电流之间存在线性关系,相关系数为0.998,检测下限为0.128 U/mL.运用该法测定了孢子萌发过程中酶活的变化,随着孢子的萌发,酶活先增加,达到最大值(2.130 U/mL)后再次下降,同时采用传统滴定法进行对照.结果表明,相较于传统方法,电化学方法具有准确、快速和简便的特点.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2017(033)005【总页数】5页(P87-90,94)【关键词】孢子;萌发;葡萄糖氧化酶;循环伏安法【作者】刘洋汝;李忠海;任佳丽【作者单位】中南林业科技大学食品科学与工程学院,湖南长沙 410004;中南林业科技大学食品科学与工程学院,湖南长沙 410004;稻谷及副产品深加工国家工程实验室,湖南长沙 410004;中南林业科技大学食品科学与工程学院,湖南长沙 410004;稻谷及副产品深加工国家工程实验室,湖南长沙 410004【正文语种】中文葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)是一种需氧脱氢酶,能高度专一地氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢,在食品、畜牧以及生物医药等领域有着广泛的应用[1-2]。
第19卷 第7期 牡丹江大学学报 Vol.19 No.7 2010年7月 Journal of Mudanjiang University Jul. 201092 文章编号:1008-8717(2010)07-0092-03黑曲霉生产糖化酶及酶活测定单 海 艳(牡丹江大学,黑龙江 牡丹江 157000)摘 要:本文对黑曲霉突变株Uv11-48生产糖化酶液体深层发酵进行了全程生产工艺的研究,证实了黑曲霉突变株是一种产孢力强、抗污染能力强、易培养的糖化酶生产菌,经液体深层通风发酵可得出:只要充分利用突变株的有利条件,掌握好菌种特性,合理配制营养,控制好发酵条件,便可获得高酶活力的高产糖化酶。
本实验还运用了几种酶活力测定方法,以资进行优劣探讨。
关键词:黑曲霉;液体通风发酵;糖化酶;酶活力 中图分类号:Q-331 文献标识码:B 一、前言(一)黑曲霉菌种特性 1.黑曲霉的分类地位黑曲霉在分类学上处于:真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、曲霉属、黑曲霉群,拉丁学名:Aspergillus niger 。
2.黑曲霉形态、生理、生态特性孢子头呈暗黑色,菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成,菌丝黑褐色,顶囊球形,小梗双层,分生孢子球形,平滑或粗糙。
一般进行无性生殖,其可育细胞称足细胞。
3.黑曲霉突变株的形态、生理、生态、特征 在查氏培养基上菌落曲型为炭黑色,有辐射沟纹,从菌落边缘向中心,分化为伸长部位,活性部位,成熟部位,老化部位几个区域即孢子萌发最早出现于中心部位是伸展部位,并逐渐形成密生部位,分生孢子部位,最后在中心出现的是成熟部位,菌落背面无色或稍黄。
(二)糖化酶的分类、地位、性质及用途 1.糖化酶在国际酶学委员会,在系统命名法中的地位糖化酶是淀粉酶,在系统命名法中属水解酶类。
2.糖化酶的性质糖化酶(glucamylase )又名糖化型淀粉酶(glueoamylase )或淀粉葡萄糖苷酶。
其系统名称为淀粉α1.4-葡萄聚糖水解酶。
安徽农业大学学报,1998,25(3):304-309Journal of A nhui A gricultural U niversity黑曲霉Β-葡萄糖苷酶的活力测定和酶学性质Ξ李 平 宛晓春丁霄霖 陶文沂(安徽农业大学轻工学院,合肥230036)(无锡轻工大学)摘 要 以P-N PG为底物,通过底物浓度、反应温度、反应时间、反应pH的考察,确定了黑曲霉Β-葡萄糖苷酶酶活的最佳测定条件;并对该酶的pH稳定性、热稳定性、米氏常数等进行了研究。
关键词 黑曲霉 Β-葡萄糖苷酶 测定条件 性质分类号 T S20113Β-葡萄糖苷酶能将水果、蔬菜、茶叶等中的风味前体物质Β-糖苷[1]水解为具有浓郁天然风味的香气物质,以改良因加工、贮藏等因素造成对食品感官性状——风味的影响;同时还能协助纤维素酶将纤维素水解为葡萄糖[2],具有重要的理论和实用价值。
Β-葡萄糖苷酶的测定方法很多,概括起来主要有电化法、荧光法、分光光度法等。
电化法由Gu ilbau lt和K ram er[3]设计,以扁桃苷为底物,根据所产生的氢化物,用与自发(内)电解池相联结的一对银—铂电极来测定其葡萄糖苷酶活性;Rob in son[4]使用4-甲基伞形酮的Β-D葡萄糖苷作为底物,经Β-葡萄糖苷酶作用,专一地分解为具有强烈荧光的4-甲基伞形酮,此荧光法灵敏度高且快速;分光光度法[5]可用水杨苷为底物,将水杨苷裂解为水杨醇和Β-D葡萄糖,然后对所产生的葡萄糖进行比色测定;也可用熊果苷(Β-D-葡萄苷-对苯二酚)作为底物,对产生的葡萄糖可用碘量法加以测定;另外还可用对-硝基苯基-Β-D-葡糖苷(P-N PG)为底物,对产生的对—硝基苯进行比色测定。
本试验采用P-N PG为底物的比色测定法,该法简单、快速、灵敏度高[6],且所需仪器常见。
1 材料与方法111 材料菌种:黑曲霉,来源于无锡轻工大学。
培养基:斜面保藏培养基,PDA;发酵培养基,麸皮3%,(N H4)2SO4012%,另加适量无机盐溶液。
Ξ国家攻关课题(85-609-03-2)研究内容。
李平,女,1968年生,讲师。
收稿日期:1998204206试剂:P -N PG ,Sigm a 公司产品,其余试剂均为国产分析纯试剂。
主要仪器及设备:高速冷冻离心机,721分光光度计,回转式恒温摇瓶柜。
112 方法取斜面保藏原菌经活化,以孢子形式接种于发酵培养基中,于30℃、140r m in 摇床培养6d ,取发酵液3000r m in 离心,得上清粗酶液备用。
2 结果与讨论211 酶活测定方法的确定21111 不同波长对硝基苯酚浓度-光密度曲线 据资料[7,8,9]报道,对硝基苯酚的最大吸收峰在400~410nm 之间,经验证其最大吸收峰在400nm 处,结果如图1。
21112 对硝基苯酚-光密度标准曲线 配制不同浓度的对硝基苯酚溶液,各取2m l ,再加入1m o l L N a 2CO 3溶液显色,测定其OD 值,如图2。
图1 不同波长对硝基苯酚浓度-光密度曲线F igure 1 T he curve of concentrati on of PN P -OD fo r different w ave length图2 对硝基苯酚-光密度标准曲线F igure 2 T he standard curve of PN P -OD21113 底物浓度对酶活的影响 底物浓度是决定酶反应速度的因素。
在低的底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比;当底物浓度增高时,增加底物浓度,反应速度虽随之增加,但不再与底物浓度成正比。
当底物浓度增加到一定程度以后,反应速度不受底物浓度的影响而趋于恒定,达到了测定酶活性时底物过量的要求。
据报道[6~9],以P -N PG 为底物测酶活时,底物浓度常取011~10mm o l L ,本试验在pH 415,反应温度50℃时,考察了酶活力与底物浓度的关系。
结果见图3。
由图3知,当底物浓度达到5mm o l L 时,酶活达到最大值,再增加底物浓度,酶活基本不变。
这时,酶反应速度与底物浓度无关,即零级反应。
21114 最适温度 每一种酶在一定条件下,只有在某一温度时表现最大活性,即所谓最适温度。
但它受其他条件如底物作用时间和pH 值等的影响而改变。
当其他规定条件不变时,温度每改变1℃,反应速度可相差10%以上,所以反应须在恒温槽内进行,且所有试剂应该在反应开始前就达到需要的温度。
有时,温度也可以人为规定为20℃、30℃等。
以水杨素为底物测Β-葡萄糖苷酶酶活时最适温度为50℃[9]。
本试验在pH 415,保温10m in 后分别考察了40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃时的酶活,结果见图4,得到最50325卷3期李 平等 黑曲霉Β-葡萄糖苷酶的活力测定和酶学性质 佳反应温度为50℃。
21115 最佳pH 酶的活性与作用底物的氢离子浓度有很大关系。
同一种酶在不同pH 时测定的活性不同。
只有在某种缓冲液和某种pH 范围内才表现出最大活性,即所谓最适pH 。
一般认为酶分子处在最适pH 时,其活性基因的解离状态最易与底物结合,而处在其他pH 时,改变了活性基因的解离状态,酶和底物结合减弱,活性就降低。
pH 对酶稳定性影响很大,在最适pH 的一侧或两侧都可能导致酶的不可逆破坏。
在温度为50℃,时间10m in 时,分别测定了pH 4、pH 415、pH 510、pH 515、pH 610时的酶活性,结果见图5,得到酶作用最佳pH 为415。
图3 底物浓度与酶活力关系F igure 3 T he effect of concentrati on of substrateon activity of Β-gluco sidase 图4 温度对酶活力影响F igure 4 T he effect of temperature on activity ofΒ-gluco sidase 21116 精确反应时间 由于反应速度是通过测定一定时间内底物或者产物量变化而求得的,因此计时的精确性十分重要。
如果保温10m in ,计时误差达1m in ,那么仅计时引起的测定误差就达10%[10]。
故活性测定都要求用秒表精确计时,本试验在pH 415,温度50℃条件下,分别测定了6m in 、7m in 、8m in 、9m in 、10m in 、11m in 、12m in 、13m in 的酶活,结果见图6,表明保温10m in 是最佳反应时间。
图5 反应液pH 与酶活力关系F igure 5 T he effect of pH on activity of Β-glu 2co sidase图6 反应时间与酶活力关系F igure 6 T he effect of acti on ti m e on activity of Β-gluco sidase603安徽农业大学学报 1998年21117 酶活测定方法 ①将发酵培养液于3000r m in 离心10m in ,得上清粗酶液。
②用微量进样器取011m l 适度稀释的粗酶液,加入019m l pH 415的012m o l L N a 2H PO 4-011m o l L 柠檬酸缓冲液,于50℃恒温水浴预热5~10m in ,再加入已预热5~10m in 的1m l 5mm o l L 的P -N PG 溶液,用秒表精确计时,10m in 后立即加入1m l 1m o l L 的N a 2CO 3溶液终止反应,室温放置5m in ,于400nm 处测光吸收值OD 。
以加热失活的酶液按照同样的方法处理作空白。
在上述条件下,每毫升酶液每分钟水解产生1Λm o l 的对硝基苯酚的酶活力,定义为一个酶活单位。
计算公式如下:U =C10×011×N =C N =01369 OD N上式中,U :酶活单位(u m l ),10:反应时间,N :原酶液稀释倍数,011:取011m l 酶液反应,C :对应于对硝基苯酚-光密度曲线上的值C =01369・OD 。
212 Β-葡萄糖苷酶的酶学性质21211 酶在不同pH 条件下的稳定性 将粗酶液置于不同pH 的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中,在4℃冰箱中保存24h ,然后将pH 调回415,测剩余酶活力,结果表明pH 在310~710之间酶活基本稳定(图7),可保存活力90%以上。
然后将该酶液保存在pH 415缓冲液中,于20℃保温24h 、48h 、72h 、96h 、100h ,结果(图8)发现,该条件下,保存1~3d 酶活较稳定,可保留85%以上活力。
长期试验表明该酶在pH 415条件下,于0~4℃冰箱中保存,1年后仍保存85%酶活力。
图7 酶液于不同pH 缓冲液中的酶活力F igure 7 T he activity of Β-gluco sidase in differ 2ent pH buffer图8 酶液在pH 415缓冲液中的稳定性F igure 8 T he stabilizati on of Β-gluco sidase inpH 415buffer21212 酶的热稳定性 将粗酶液在40~70℃条件下保温1h ,立即冰浴,然后测剩余酶活力(图9),并以剩余酶活力为50%的温度作为半失活温度t 1 2,则该酶的t 1 2为65℃。
21213 酶的抑制剂 在有各种金属离子、SD S 或脲存在时,按上述最佳法则酶活力,结果表明(表1),H g 2+、L i +、Fe 3+、Sn 2+、SD S 对该酶有一定抑制作用,B a 2+、A l 3+、Pb 2+、Zn 2+、Ca 2+、M n 2+、Fe 2+、Co 2+、Cd 2+、N a +、M g 2+、K +对酶活力无明显影响,A g +、Cu2+及脲、ED TA 蛋白质变性剂对酶活力有明显抑制作用。
70325卷3期李 平等 黑曲霉Β-葡萄糖苷酶的活力测定和酶学性质 表1 各种化学试剂对酶活力的影响T able 1 T he effect of reagent on activity of Β-gluco sidase 化学试剂浓度(mmo l L )相对酶活力化学试剂浓度(mmo l L )相对酶活力A gNO 312210ED TA 141H gC l 217410KC l 197A lC l 319710N aC l 1100BaC l 219510FeSO 4197CaC l 21101FeC l 3172M gC l 21102SnC l 2181CuSO 4152CoSO 4199ZnSO 4197CdSO 4196PbA c 195M nSO 41102SD S 1076L i C l 2177脲1×10338对照 100脲4×10338图9 不同温度保存下剩余酶活力F igure 9 T he effect of temperature on surp lusactivity of Β-gluco sidase 图10 以P -N PG 为底物Β-葡萄糖苷酶的L angm uir 图F igure 10 L angm uir chart of Β-gluco sidase 21214 酶的动力学常数-Km (米氏常数) Km 对某一特定的酶反应,在特定的条件下是一个特征常数。