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2015版药典无菌检查法与微生物鉴定

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2015版中国药典微生物检验

2015版中国药典微生物检验

• 注：方法选择原则：根据供试品理化特性和微生物限度 标准等因素选择。
培养基适用性检查
• 胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、铜 绿假单胞菌、白色 念珠菌、黑曲霉 • 胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、枯草 芽孢杆菌 • 沙氏葡萄糖琼脂、玫瑰红钠琼脂 、白色念珠菌、黑曲霉。
中国药典2015年版相关培养基变化无菌检查法通则1101chp2010chp2015硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基tsb营养肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基tsa营养琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基sdb改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基sda培养基的适用性检查灵敏度检查无菌性检查中国药典2015年版相关培养基变化无菌检查法通则1101chp2010chp2015硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基tsb营养肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基tsa营养琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基sdb改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基sda培养基的适用性检查灵敏度检查无菌性检查非无菌产品微生物限度检查
菌数报告规则
• 2、薄膜过滤法：计数方法同平皿计数法，每 张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。菌数报告 规则以相当于 1g、1ml或10cm供试品的菌落数 报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1报告 菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或10cm 供试品 ），或﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。 • 3、MPN法：记录每一稀释级微生物生长的管 数，从表3查对每1g或1ml供试品中需氧菌总数 的最可能数。
培养条件
• 描述方式：按计数方法适用性试验确认计 数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和 酵母菌总数测定。 • 培养条件：胰酪大豆胨琼脂平板在30～ 35℃培养3-5天，沙氏葡萄糖琼脂平板在20 ～25℃培养5~7天；MPN法和供试品接种， 所有试验管在30～35℃培养3～5天。

2015 《中国药典》无菌检查法修订解析

2015 《中国药典》无菌检查法修订解析
注 如果医疗器械体积过大，培养基用量可在2000 ml以上，将其完全浸没。
阳性对照试验 按原二部的规定： ⒈供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。 ⒉阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小 于100CFU。 ⒊阳性对照管培养48～72小时应生长良好。
我国药典无菌检查法的历史发展
修订时间 1953年版 1963年版 1977年版 1985年版 1990年版 1995年版 修订内容 直接接种法 直接接种法 无阳性对照菌取样量2支/瓶 三种培养基培养基 阳性对照－金葡
直接接种法增加了薄膜过滤法（抗生素）。阳性对照－金葡 直接接种法薄膜过滤法限培养基为需、厌气菌培养基及霉菌培养基。 阳性对照－金葡 同1985年版 培养基灵敏度检查－藤黄、 生孢、白念。阳性对照：金葡10－6 ；生孢10－6 ；白念 10－5
4、检查方法的整合修订。 5、参照USP 对表2、表3的整合修订。
实验环境的重大修订
悬浮粒子最大允许数/立方米
微生物监测的动态标准(1) 表面微生物 动态 沉降 浮游 菌 接触碟 5指手 菌 （f9 / 套 cfu/ 0mm） （f55 cfu /手 m3 cfu mm） 套 /4h(2) cfu /
表2. 上市抽验样品的最少检验数量 （包括液体和固体制剂）。 注 ①若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。
②抗生素粉针剂（≥5g) 及抗生素原料药的最少检验数量为6瓶（或支）。
筒装固体原料的最少检验数量为4个包装。根据具体情况定
表3. 供试品的最少检验量（包括液体和固体制剂）。
中国药典2015年版无菌检查法的增修订内容
1、无菌
是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物。 用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原

无菌检查法-2015版中国药典

无菌检查法-2015版中国药典

无菌检查法-2015版中国药典无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查应在环境洁净度B 级背景下的局部A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度确认。

隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

日常检验还需对试验环境进行监控。

无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。

培养基硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需气菌培养；胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。

培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。

配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。

1. 硫乙醇酸盐流体培养基酪胨(胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5gL-胱氨酸0.5g 新配制的0.1% 刃天青溶液1.0ml硫乙醇酸钠0.5g 琼脂0.75g(或硫乙醇酸) （0.3 ml) 纯化水1000ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH 值使灭菌后为7.1±0.2。

分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培2养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。

灭菌。

在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。

《2015版《中国药典》微生物检测与洁净室环境检测技术》-1

《2015版《中国药典》微生物检测与洁净室环境检测技术》-1

育
飞
天
教
育
微生物细胞结构示意图
• 细菌细胞结构图 •
教 真菌细胞结构图 天 飞
育
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微生物的五大共性
飞
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1、体积小，面积大； 2、吸收多，转化快；
3、生产旺，繁殖快；
4、适应强，易变异； 5、分布广，种类多。
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细 菌 形 态 特 征
• 革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁结构比较
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试管
移液管
先用少许棉花塞于吸口端，然后用纸包好或装入金属吸 管筒内，于121℃高压蒸汽灭菌20min后烘干。
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培 养 基 的 基 础 知 识
溶
液体培养 基用滤纸 过滤，固 体培养基 用纱布块 中夹薄层 脱脂棉过 滤
化
校正酸碱度
（1）先将卵磷脂加入少量蒸馏水低温加 热溶解溶、再加吐温80混匀，，加入琼 脂，静置15分钟。
细胞壁结构 G＋ G－
飞
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脂多糖（LPS）,包括脂
厚度 强度 糖类含量 脂类含量 磷壁酸 脂多糖
20－80nm 坚韧 约45％ 约2％ 无
10－15nm 疏松 约15％ 约20％ 有 有
蛋白A，核心多糖和特异
性多糖三个部分。LPS对 动物具有毒性作用，它 牢固地结合在细胞表面，
只在菌体融解时才释放，
非细胞类：病毒、亚病毒(类病毒、朊病毒)
飞
天
教
育
细菌（bacteria）
• 细菌是单细胞的原核微生物
• 细菌是所有生物中数量最多的一类，据估计，其总数约有 5×10的三十次方个。 • 细菌主要由细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等部分构成 • 根据形状分为三类，即：球菌、杆菌和螺形菌（包括弧菌、 螺菌、螺杆菌）

2015药典无菌、微限检验

2015药典无菌、微限检验

方法适用性试验
• 当建立产品的无菌检查法时，应进行方 法适用性试验，以确认所采用的方法适合于 该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生 变化可能影响检验结果时，应重新进行方法 适用性试验。方法适用性试验按“供试品的 无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对 每一试验菌应逐一进行方法确认。
方法适用性试验
光学显微镜
过滤装置（无油真空泵、滤杯、滤头、滤瓶、微孔滤膜、夹子）
环境及人员要求
无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必 须达到无菌检验的要求，检验全过程应严格遵守 无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不 得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、 工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区 ）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现 行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按 相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符 合无菌检查的要求，日常检验还需对试验环境进 行监控。 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并 经过无菌技术的培训。
促生长试验：用于证明生长培养基能够支持微生物 生长的技术操作。 假阴性：实际阳性的无菌试验结果被变成了阴性。 假阳性：实际阴性的无菌试验结果被变成了阳性。 需氧菌：在代谢中，有氧条件下才能生存的微生物。 厌氧菌：在代谢中，没有氧的条件下才能生存的微生物。 无菌保证水平（SAL）:灭菌后产品上存在单个活微生物 的概率。“无菌医疗器械”表示为医疗器械中，有残存微生物的医疗器械的概率小于10 ，即一百万件中小于1件。
无菌检查法 试验前准备
硫乙醇酸盐流体培养基:主要用于厌氧菌的培养
，也可用于需氧菌培养。
无菌检查法 试验前准备
硫乙醇酸盐流体培养基:
在供试品接种前, 培 养基氧化层的高度不得超 过培养基深度的1/5，否则 ,须经100℃水浴加热至粉 红色消失（不超过20分钟 ）迅速冷却,只限加热一次 ，并应防止被污染。其装 量与容器高度的比例应符 合培养结束后培养基氧化 层（粉红色）不超过培养 基深度的 1/2。30℃ ~ 35℃培养14天。

中国药典(2015年版)无菌检查法

中国药典(2015年版)无菌检查法

中国药典(2015年版)无菌检查法是用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。

如果供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。

只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。

薄膜过滤法一般应采用封闭式薄膜过滤器，无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45微米，直径约为50mm。

根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质，使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。

直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。

2015年版药典 无菌检查法

2015年版药典 无菌检查法
无 菌 性 检 查 每 批 培 养 基 随 机 取 不 少 于 5 支 ( 瓶 ），置各 培 养 基 规 定 的 温 度 培 养 1 4 天 ，应 无 菌 生 长 。
灵敏度检査 菌 种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代(从 菌 种 保 存 中 心 获 得 的 干 燥 菌 种 为 第 0 代 ），并 采 用 适 宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验 菌株的 生物 学特 性。 金 黄 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus aureus ) C C M C C (B) 26 003〕 铜 绿 假 单 胞 菌 （Pseudomonas aeruginosa ) C C M C C ( B) 10 104〕 枯 草 芽 孢 杆 菌 仏 5)〔C M C C ( B ) 6 3 501〕 生 抱 梭 菌 sporogenes) C C M C C ( B ) 64 941〕 白 色 念 珠 菌 albicans) C C M C C ( F ) 98 001〕 黑 曲 霉 n ig e r) C C M C C ( F ) 98 003〕 苗 液 制 备 接 种 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、铜 绿 假 单 胞 菌 、枯草 芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大 豆 胨 琼 脂 培 养 基 上 ，接 种 生 孢 梭 菌 的 新 鲜 培 养 物 至 硫 乙 醇 酸 盐 流 体 培 养 基 中 ，30〜 35°C培 养 18〜 2 4 小 时 ；接 种 白 色 念 珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖 琼 脂 培 养 基 上 ，20〜 25°C培 养 24〜 4 8 小 时 ，上 述 培 养 物 用 PH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9% 无 菌 氣 化 钠 溶 液 制 成 每 l m l 含 菌 数 小 于 lOOcfu( 菌 落 形 成 单 位 ）的 菌 悬 液 。接 种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上， 20〜25*C培 养 5〜7 天 ，加 人 3〜 5 m l含 a 0 5 % (m l/m l) 聚山 梨 酯 8 0 的 pH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9 % 无 菌 氣 化 钠 溶 液 ，将 孢 子 洗 脱 。然 后 ，采 用 适 宜 的 方 法 吸 出 孢 子 悬 液 至 无 菌 试 管 内 ，用 含 0.05% ( m l/m l) 聚 山 梨 醋 8 0 的 pH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9 % 无 菌 氣 化 钠 溶 液 制 成 每 l m l 含 孢 子 数 小 于 lOOcfu的 孢 子 悬 液 。 菌 悬 液 若 在 室 温 下 放 置 ，应 在 2 小 时 内 使 用 ；若 保 存 在 2〜8°C可 在 2 4 小 时 内 使 用 。黑 曲 霉 孢 子 悬 液 可 保 存 在 2 〜 8°C，在 验 证 过 的 贮 存 期 内 使 用 。 培 养 基 接 种 取 每 管 装 量 为 12ml的硫乙醇酸盐流体培 养 基 7 支 ，分 别 接 种 小 于 lO O c fu 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、铜 绿 假 单胞菌、生 孢 梭 菌 各 2 支 ，另 1 支 不 接 种 作 为 空 白 对 照 ，培 养 3 天 ；取 每 管 装 量 为 9 m l的 胰 酪 大 豆 胨 液 体 培 养 基 7 支 ，分 别接种小 于lOOcfu的 枯 草 芽 孢 杆 菌 、白 色 念 珠 菌 、黑 曲 霉 各 2 支，另 1 支不接种作为空白对照，培 养 5 天 。逐 日观 察结果。 结 果 判 定 空 白 对 照 管 应 无 菌 生 长 ，若 加 菌 的 培 养 基 管 均 生 长 良 好 ，判 该 培 养 基 的 灵 敏 度 检 查 符 合 规 定 。

2015版中国药典微生物限度

2015版中国药典微生物限度
（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
3. MPN 法
– 取规定量供试品，按方法适用性试验确认的 方法进行供试液制备和供试品接种，所有试 验管在30～35℃培养3～5 天，如果需要确 认是否有微生物生长，按方法适应性试验确 定的方法进行。记录每一稀释级微生物生长 的管数，从表3查对每1g 或1ml 供试品中需 氧菌总数的最可能数。
1.5结果判断
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。
– 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。

9-钱文静-2015版中国药典无菌检查法

9-钱文静-2015版中国药典无菌检查法

（二）、无菌检查的特点和意义 由于抽样概率的限制，通过无菌检查发现产品 微生物污染的可能性极低，而当前坚持无菌检查的 意义在于： 产品上市前发现重大污染事件的最后一道关口； 通过无菌检查的执行情况可以窥视其无菌控制存 在的问题。
三、无菌检查法的有关概念和新理念
(三)、无菌检查的新理念 1.全过程控制
2014-9-16
(一) 2015年版无菌检查法主要修订的内容 3、培养基 ⑶灵敏度检查－ ②菌液制备用培养基的修订
2010年版 1、接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物 ——至营养肉汤培养基中或营养琼脂培 养基上； 2、接种生孢梭菌的新鲜培养物 ——至硫乙醇酸盐流体培养基中； 3、接种白色念珠菌的新鲜培养物 ——至改良马丁培养基中或改良马丁琼 脂培养基； 4、接种黑曲霉的新鲜培养物至 ——改良马丁琼脂斜面培养基上 ；
2010年版 1、硫乙醇酸盐流体培养基 ——金黄色葡萄球菌、铜绿 假单胞菌、枯草芽孢杆菌、 生孢梭菌 2、改良马丁培养基 ——白色念珠菌、黑曲霉 2015年版 1、硫乙醇酸盐流体培养基 ——生孢梭菌、金黄色葡萄球 菌、铜绿假单胞菌 2、胰酪大豆胨液体培养基 ——枯草芽孢杆菌、白色念珠 菌、黑曲霉
30
悬浮粒子最大允许数/立方米 洁 净 度 级 别 A级 B级 C级 D级 静态 ≥0.5 μm 3520 3520 352000
3520000
微生物监测的动态标准(1) 浮游 菌 cfu/ m3 1 10 100 200
沉降 菌 （ 90m m） cfu /4h(2)
动态 ≥5.0 μm 20 29 2900 ≥0.5 μm 3520 352000 3520000 ≥5.0 μm 20 2900 29000
2014-9-16

2015版药典无菌检查法与微生物鉴定

2015版药典无菌检查法与微生物鉴定

μm
A级 3520准(1)
浮游 菌 cfu/ m3
沉降 表面微生物
菌 接触碟 （f9 / 0mm）（f55 cfu mm） /4h(2) cfu /
5指手 套 cfu /手 套
<1 <1 <1 <1
B级 3520
29
352000 2900
10 5
5
5
C级 352000 2900 3520000 29000 100 50 25
2015版中国药典通则
9203 药品微生物实验室质量管理指导原则 9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则 9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则
GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准
悬浮粒子最大允许数/立方米
洁 静态 净
动态
度
级 ≥0.5
≥5.0 ≥0.5
≥5.0
别 μm
μm μm
比较项目
检验条件规定 人员要求 培养基、培养 条件与时间
培养基灵敏度 检查与方法验 证用菌株 检验方法 稀释剂与薄膜 过滤冲洗液
结果判断与复 试规定
ChP2010
USP35
EP7.0
总体10000级、局部100级
应在无菌条件下进行。
应在无菌条件下进行。
具备微生物专业知识，并经过无 经培训和认可 菌技术的培训
经培训和认可
硫乙醇酸盐流体培养基
30～35℃；20～25℃(三部 ）
改良马丁培养基 23～28℃
均培养14天，
转种后细菌培养2天、真菌培 养3天
硫乙醇酸盐流体培养基 30～35℃ 胰酪大豆胨液体培养基
20～25℃ 培养不少于14天 转种后培养不少于4天

《中国药典》2015年版微生物测定修订情况

《中国药典》2015年版微生物测定修订情况

常州药检
一、微生物计数法
分别接种不大于100cfu的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球 菌、枯草芽孢杆菌菌液至胰酪大豆胨琼脂培养基平 板，每一试验菌株平行制备2个平皿，30～35℃培养 不超过3天。同时，用相应的对照培养基代替被检培 养基进行上述试验。 分别接种不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉菌液至 胰酪大豆胨琼脂培养基平板，每一试验菌株平行制备 2个平皿，30～35℃培养不超过5天。同时，用相应 的对照培养基代替被检培养基进行上述试验。
常州药检
一、微生物计数法 计数培养基适用性检查
菌种：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽 孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉，不得超过5代。
常州药检
一、微生物计数法
常州药检
一、微生物计数法
常州药检
一、微生物计数法
取其新鲜培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9无菌氯化钠溶液制成适宜浓度菌悬液。黑曲霉制 备时在缓冲液或氯化钠溶液中加入0.05%（v/v）聚山 梨酯80。 菌液在室温下2小时内使用，2～8℃时可在24h内使用， 黑曲霉孢子悬液可2～8℃保存，在验证过的贮存期内 使用。
MPN法
常州药检
一、微生物计数法
平皿法：包括倾注法和涂布法。每株菌每种培养基 至少制备2个平皿，以算术平均值计算。使用涂布 法应采用适宜的方法使培养基表面干燥，且每个 平皿接种的供试液不少于0.1ml。
常州药检
一、微生物计数法
薄膜过滤法：一般取相当于1g（ml、10cm2）的供试 品，（若供试品中所含的菌数较多时，供试液可 酌情减量）加至适量稀释液中，混匀，过滤。用 适量冲洗液冲洗。 每株菌每种培养基至少制备一张滤膜。 同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
常州药检

中国药典2015版-微生物限度检查解析

中国药典2015版-微生物限度检查解析

*
*
注*：限度未做统一规定。
控制菌
*
不得检出沙门菌 （10g） ； 耐胆盐革兰阴性菌应小 于104（1 g）
执行及制定标准的注意事项
执行范围： 生产、贮存、销售过程中的药品 药用原料、辅料 中药提取物、中药饮片 新药标准 进口药品标准复核 药品质量考察及仲裁
标准执行的注意事项： 药典标准出处：中国药典通则项下【微生
或菌株已无使用需要时应及时灭菌销毁”； • 管理：应有程序文件，包括申购、操作、转种传代、纯度特性确认记录，注明名称、标准号、
接种日期、代数、培养基和培养条件、保藏的位置和条件等。
环境
• 实验室的布局和运行 • 环境监测 • 清洁、消毒和卫生
设备
建立仪器设备管理制度 清洁保养制度 操作规程 使用、监控的记录
器、天平、量器等等） 3.供应商评估与现场审计 使用正确的、有严格质量保障的产品
《中国药典》2015年版-微生物限度标准修订解析
标准修订内容 修订思路1 《中国药典》2010年版一、二、三部限度标准的相关内容合并。 修订思路2 参考EP7.0，USP35，JP X V标准，修订中国药典的微生物限度标准。
胆盐革兰阴性菌应小102
不含豆豉、神曲等发酵 5×102 原粉
102
液体口服给药
制剂
含豆豉、神曲等
发酵原粉
103
102
不得检出大肠艾希菌 不得检出沙门菌
耐胆盐革兰阴性菌应小 于 101
固体局部给药 表皮或粘膜不完整
104
102
不得检出金黄色葡萄球
制剂
菌、
表皮或粘膜完整
103
102
铜绿假单胞菌 ；阴道、
药品微生物检验的现状与发展

药典三部(2015版)-通则-1101微生物检查法

药典三部(2015版)-通则-1101微生物检查法

1101 无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。

隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

日常检验还需对试验环境进行监控。

培养基硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌培养；胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养。

培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基。

配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境，若保存于非封闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。

1. 硫乙醇酸盐流体培养基胰酪胨15.0g 氯化钠2.5g酵母浸出粉 5.0g 新配制的0.1% 刃天青溶液1.0ml无水葡萄糖 5.0g 琼脂0.75gL-胱氨酸0.5g 水1000ml硫乙醇酸钠0.5g（或硫乙醇酸）(0.3ml)除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH，使灭菌后在25℃的pH值为7.1±0.2。

分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。

灭菌。

在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止污染。

2015版中国药典关于微生物检验有关变化的解读

2015版中国药典关于微生物检验有关变化的解读
2015版微生物检验有关变化情况解读
黑龙江省食品药品检验检测所
杨利红
目
录
1 2
3
概况及背景 标准修订内容
执行及制定标准的注意事项
4 5
标准与方法 国外药典的标准收载情况
一、概况及背景
参照欧、美药典中“微生物限度”相关内容的组织形 式，将原“微生物限度检查法”修订后拆分为3个附录， 并在药典会网站上公示： -1、非无菌产品微生物检查：微生物计数法（一、二、 三部相同） -2、非无菌产品微生物检查：控制菌检查法（一、二、 三部相同） -3、药品微生物限度标准（一部；二部同三部）
在2005版chp收载微生物限度标准的基 础上，眼用制剂修订为无菌要求；阴 道、尿道给药制剂增加白色念珠菌 的控制；增加了贴膏剂的控制菌检查。
二、标准修订内容
1、药典标准的修订思路 （1）三部药典的合并 现行2010版《中国药典》三部分在微生物限度标准有 重叠，一部多于二部、三部。
一部标准为 基础
二、标准修订内容
非无菌药用原料及辅料微生物限度标准中药提取物及中药饮片微生物限度标准
制剂类型
TAMC
TYMC
控制菌
药用原料及辅料
103
102
未统一要求
中药提取物
103
102
未统一要求
中药饮片
未统一要 未统一要 求 求
不得检出沙门菌(10g)，耐胆盐 的阴性菌应小于104(1g)
二、标准修订内容
（4）实验环境的重大修订 ①无菌检查环境洁净度规定 GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准 无菌检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内或隔离系统中进行。 2015年版：应在洁净度B级背景下的局部A级单向流空气区 域内或隔离系统中进行。 ②微生物限度检查环境洁净度规定 微生物限度检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内进行。 2015年版：应在受控洁净环境下（不低于D级）的局部不 低于B级单向流空气区域内进行。

2015年版中国药典微生物限度检查法

2015年版中国药典微生物限度检查法

1.1 总则：
• 环境： – 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要 求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境 、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进 行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内】。 – 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检 出。 – 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监 测。
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。 – 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备 – ⑴ 水溶性供试品
• 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。若需要，调节供试液 pH 值至 6 ～8。必要时，用同一稀释液将供试液进 一步 10倍系列稀释。水溶性液体制剂也 可用混合的供试品原液作为供试液。
1.3.1菌液制备及使用
试验菌株 试验菌液的制备
金黄色葡萄球菌 〔CMCC(B) 26 003)〕
铜绿假单胞菌 〔CMCC（B)10 104〕 枯草芽孢杆菌 〔CMCC(B) 63 501〕 白色念珠菌 〔CMCC(F) 98 001〕
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培 养基 【10版：营养肉汤或营养琼脂培养基】 30～35℃，18～24小时

2015版中国药典微生物限度记录

2015版中国药典微生物限度记录

培养基的储藏
琼脂培养基不得在 0 ℃ 或 0 ℃ 以下存放，防止冷冻破 坏凝胶特性。
琼脂培养基最好现用现配，如置冰箱保存，一般不 超过一周，且应密闭包装，若延长保存需经验证 确定。 培养基灭菌后应立即取出，不得储存在高压灭菌器 中。
培养基适用性试验
修订内容
控制菌检查用培养基数量减少 7个，在增菌过程中， 使用无选择性增菌培养基。
2.一次只可加0.1-0.2ml样品。
薄膜过滤法
1.孔径应不大于0.45微米。直径一般为50mm，若采用其他直 径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。 2.滤膜材质应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截 留。 滤器注意点 1.滤器及滤膜在使用前应采用适宜的方法灭菌。 2.使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。 3.水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以湿润滤膜。 4.油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。 5.供试液经滤膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤 膜每次冲洗量为100ml，总冲洗量不得超过1000ml,以避免 滤膜上的微生物受损伤。
理由：
污染菌受到环境、加工过程及储存等影响，受到损 伤，使用无选择性增菌培养基培养，使受损伤的 细胞得到修复，提高检出 配制的培养基的适用性检查 促生长能力、抑制能力和指示特性 的检查。
实验菌株的管理使用及鉴定
菌种的保藏 低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物 的代谢和生长繁殖，因此，低温、干燥和真空是菌种保藏 的重要手段。
（三）2015版药典微生物检查法修订内容——计数法
修订前
细菌数——营养琼脂 霉菌及酵母菌数——玫瑰红钠琼脂 修订后 需氧菌总数——胰酪大豆胨琼脂（TSA）
霉菌及酵母菌总数——沙式葡萄糖琼脂（TSB）

2015版《中国药典》四部介绍与其在中药分析鉴定中地应用

2015版《中国药典》四部介绍与其在中药分析鉴定中地应用

2015 年版《中国药典》四部介绍及其在中药分析鉴定中的应用李峰2015年版《中国药典》已于 2015年6月5日由国家食品药品监督管理总局正式颁布。

2015年版《中国药典》最大的变动之一是将原药典各部附录整合，并与药用辅料标准单立成卷，首次作为《中国药典》第四部，解决了长期以来药典各部共性检测方法重复收录、彼此之间方法不协调、不统一、不规范，给药品检验实际操作带来不便的问题。

2015年版《中国药典》四部是保证《中国药典》执行的重要基础，是 2015 年版《中国药典》水平和特色的重要体现，也是系统阐述药品检测技术、传播药典知识的良好教科书，对于强化药品监管手段，保障药品质量不断提高，促进先进检测技术应用和行业健康必将发挥积极的作用。

一、 2015年版《中国药典》四部介绍2015年版《中国药典》四部内容包括凡例、通则和药用辅料。

药典通则涵盖了通用性要求、检验方法、指导原则以及试剂和标准物质等药品标准的共性要求，是药典标准的基础，不但反映了我国药品质量控制整体状况和药品检验技术水平；同时也对规范药品研究、生产、检验、加强药品监管发挥重要作用。

现就 2015年版《中国药典》四部整体情况简要介绍如下。

1.2015 年版《中国药典》四部增修订整体情况2015年版《中国药典》四部收载通则总数 317个, 将药典一部、二部、三部制剂整合后共计38个，检测方法附录 287个，其中新增通则 28个 ( 检定方法通则 27个、制剂通则 1个) ，整合通则 63个，修订通则 67 个；新增生物制品总论 3个；指导原则共计30个，其中新增 15个，修订 10个。

辅料收载总数约 270个品种，其中新增 137 个，修订97个，不收载 2个。

2.2015 年版《中国药典》四部主要特点2.1 整体提升质控水平《中国药典》凡例、通则、总论是药典的重要组成部分，对药品标准的检测方法和限度进行总体规定，对药典以外的其他药品国家标准具同等效力。

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• 无菌技术 是指在微生物试验工作中，控制或防止各 类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施， 其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及无菌操作。
• 无菌检查法的局限性 由于无菌是一个相对的概念， 因此，对无菌检查的结果应该有一个正确的认识－即产品 通过无菌检查仅仅意味着在该检验条件下，供试品未发现 有微生物污染，并不表示所有的产品都是无菌的。反之， 当供试品中检出微生物污染，则可以认为批产品的微生物 污染风险相当高。
豆木瓜蛋白酶消化物
浸出粉…….…2.0g
白酶水解物
………………………………….3.0g 葡萄糖…………....20.0g 磷 „„„„„„„„„3.0g
氯 化 钠 …..…………….…….…5.0g 酸氢二钾………..1.0g
氯化钠 „„„„„„5.0g
磷 酸 氢 二 钾 …………………....2.5g 硫酸镁 一水葡萄糖……………….……2.5g (MgSO4.7H2O)….0.5g
Dextrose(葡萄糖)............................................5.0 g Sodium Chloride(氯化钠).....................................2.5 g L-Cystine( L-胱氨酸) .......................................0.5 g Sodium Thioglycollate (硫乙醇酸钠)..........................0.5 g Agar( 琼脂).................................................0.75 g Resazurin( 刃天青) .........................................1.0 mg Water（水）............................................. ...1000ml
20～25℃ 培养不少于14天 转种后培养不少于7天
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌 、黑曲霉
只要供试品性状允许，应采用薄 膜过滤法
1、0.1％蛋白胨水溶液； 2、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 3、其他经验证过的溶液
性状允许的样品采用薄膜过滤 ，利于抗菌影响去除
1．0.1%蛋白胨水溶液； 2．0.1%蛋白胨水溶液＋1ml 吐温80 3．动物组织消化液＋牛肉浸 膏＋吐温80
• 检验数量：是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。 成品每亚批均应进行无菌检查。
• 2015版药典四部通则1101表2，上市抽验样品的最少检验 数量，除抗生素和血液制品外，V≥100ml液体制剂的最少 检验数量由2010年版药典6瓶/支修订为10瓶/支。即所有上 市抽验样品除抗生素和血液制品外的最少检验数量为10瓶/ 支。增加了供试品检验数量。
μm
A级 3520
20
3520
20
微生物监测的动态标准(1)
浮游 菌 cfu/ m3
沉降 表面微生物
菌 接触碟 （f9 / 0mm）（f55 cfu mm） /4h(2) cfu /
5指手 套 cfu /手 套
<1 <1 <1 <1
B级 3520
29
352000 2900
10 5
5
5
C级 352000 2900 3520000 29000 100 50 25
14天于30-35 °C及20-25 °C
菌液制备用培养基的修订来自2010年版金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种到 营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基
生孢梭菌的新鲜培养物接种至硫乙醇 酸盐流体培养基
白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良 马丁培养基或改良马丁琼脂培养基
黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁 琼脂培养基
2015年版
无菌检查： 应在洁净度B级背景下的局部A级 单向流空气区域内或隔离系统中 进行。
微生物限度检查：
微生物限度检查：
应在洁净度10000级背景下的局 应在受控洁净环境下（不低于D
部100级单向流空气区域内进行。 级）的局部不低于B级单向流空
气区域内进行。
修订的依据
修订依据及意义：2010版GMP附录一《无菌药品》和附录三 《生物制品》中均规定，非最终灭菌产品各工序关键操作环 境应为B级背景下的A级。无菌检查的洁净环境不得低于生产 关键区的洁净环境要求！ ICH：检查方法中要求“试验应在无菌条件下进行，防止微 生物污染的措施不得影响供试品中微生物的检出”。
从理论上来说，要确定某批产品的无菌性，应对每个容器 进行无菌检查。但是无菌试验对样品是破坏性的，因此不 可能对每一最小包装的产品进行检查。
统计概率的局限性 ：对于低污染水平的产品，其局限性 在统计学上更为明显。
检验条件的局限： 样品中污染的微生物的检出受多种因 数的影响，只有在各检验条件符合污染微生物的修复和生 长时，才能保证被检样品的无菌检验结果的准确性。
经培训和认可
硫乙醇酸盐流体培养基
硫乙醇酸盐流体培养基 硫乙醇酸盐流体培养基
30～35℃；20～25℃(三部 ）
改良马丁培养基 23～28℃
均培养14天，
转种后细菌培养2天、真菌培 养3天
30～35℃ 胰酪大豆胨液体培养基
20～25℃ 培养不少于14天 转种后培养不少于4天
30～35℃ 胰酪大豆胨液体培养基
2015年版
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜 培养物接种到胰酪大豆胨液体培养基
或胰酪大豆胨琼脂培养基
生孢梭菌的新鲜培养物接种至硫乙醇 酸盐流体培养基
白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏 葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂
培养基
黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄 糖琼脂培养基
培养基灵敏度检查
采用薄膜过滤，利于抗菌 影响去除 1．0.1％蛋白胨水溶液
2．0.1％蛋白胨水溶液＋ 0.1％（聚乙氧基乙醇、0.1 ％吐温-80） 3．十四烷酸异丙酯。
一次检出结果为准 (设备及环境不符合要求、实验过程有可能引起污染的因素、阴性对照有菌 生长、分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成的。单倍量重试)
磷酸氢二钾„„„„„2.5g 葡萄糖/无水葡萄糖
„„„„„„„2.5g /2.3g
目的
支持广泛微生物的生长,包括需氧菌 用于培养真菌 专性和兼性厌氧菌、真菌（主要是
需氧菌）
培养 条 14天于30-35 °C及20-25 °C 件
14天于20-25 °C
支持广泛微生物的生长,包 括 需氧菌、专性和兼性厌氧 菌、 真菌（主要是需氧菌）
大豆胰酪胨培养基(TSB) & 改良马丁培养基
药典 名称
USP36
BP-2013
Tryptic Soy Broth （Soybean casein digest medium)大豆－胰酪 胨培养基
中国药典2010版 改良马丁培养基
中国药典2015版 胰酪大豆胨液体培养基
配方
胰酪蛋白胨..…………….…..7.0g 大 蛋白胨……………..5.0g 酵母 胰酪胨 „„„„„17.0g 大豆木瓜蛋
2015版中国药典无菌检查法
• 2015版中国药典无菌检查法的修订 • 无菌检查法的方法适用性试验 • 无菌检查法的注意事项
2015版中国药典无菌检查法的修订
• 实验环境的修订 • 检查用培养基的修订 • 具体修订内容
实验环境的修订
2010年版
无菌检查： 应在洁净度10000级背景下的局 部100级单向流空气区域内或隔 离系统中进行。
－
D级 3520000 29000 不作规定 不作规定 200 100 50
－
无菌隔离系统的使用及验证
9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则 •1.操作验证 •2.完整性验证 •3.灭菌验证 •4.灭菌循环验证 •5.内部洁净度验证 •6.仪器仪表验证
培养基的修订
• 我国药典无菌检查法与欧美药典的差异 • 2015版药典的修订
方法适用性试验的修订
2010年版
硫乙醇酸盐流体培养基接种小于 100cfu的菌液： 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌
改良马丁培养基接种小于100cfu的 菌液：
白色念珠菌 黑曲霉
2015年版
硫乙醇酸盐流体培养基接种小于 100cfu的菌液： 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 生孢梭菌
胰酪大豆胨液体培养基接种小于 100cfu的菌液： 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉
生物制品的无菌检查中硫乙醇酸盐流体培养基为双份， 分别置30～35℃、20～25℃两个温度培养。
USP/EP/BP/JP/ICH无菌检查法中对生物制品均没有作 出特殊规定。
无菌检查方法的主要修订
• “方法验证试验”修订为“方法适用性试验” • “若该产品的组分或原检验条件发生改变时，检验方法应
重新验证”修订为“若检验程序或产品发生变化可能影响 检验结果时，应重新进行方法适用性试验。” • “方法适用性试验”培养时间由“3～5天”修订为不得超 过5天。
2015版中国药典通则
9203 药品微生物实验室质量管理指导原则 9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则 9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则
GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准
悬浮粒子最大允许数/立方米
洁 静态 净
动态
度
级 ≥0.5
≥5.0 ≥0.5
≥5.0
别 μm
μm μm
培养基的主要修订
2010年版 硫乙醇酸盐流体培养基 30～35℃（20～25℃）
改良马丁培养基 23～28℃