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【2020版中国药典】通则-非无菌微生物限度检查1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
研究：将旧版的“相应”更换为“规定”，更便于按照1107进行判定执行。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
洁净空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
研究：将旧版的“单向流空气区域”更换为“洁净空气区域”。
计数方法……供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
……提醒：后文增加了关于“贵重药品、微量包装药品”的检验量的更全面的表述，因留意结合此处的请求。
计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验……菌液制备……取黑曲霉的新鲜培养物加人适量含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或……研究：此处改动同无菌检查法，将“3~5ml”的具体量调整为“适量”，便于根据孢子的量灵活掌握菌液制备方法。
培养基适用性检查微生物计数用的商品化的预制培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
研究：类似于无菌检查法，此处将“成品培养基”修改为“商品化的预制培养基”，表述更准确，下文还有，不再赘述。
……计数方法适用性试验1.供试液制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45°C。
供试液从制备至加人检验用培养基，不得超过1小时。
……研究：此处应注意同时进行数个品种计数方法适用性试验时的时效问题。
我国药典2020微生物限度检查法1.引言我国药典2020版本中，微生物限度检查法是保证药品质量和安全的重要工具。
微生物限度指的是药品中的微生物数量的限定，包括细菌、酵母和霉菌等。
微生物限度检查法的执行对于药品的生产和使用至关重要，它能够保证药品在生产、存储和使用过程中不受到微生物污染，从而确保药品的质量和安全。
2.微生物限度检查法的内容和流程微生物限度检查法主要包括取样、制备试液、接种培养和菌落计数等步骤。
首先要进行取样，从样品中取得代表性的样品；然后是制备试液，将取得的样品溶解或稀释；接下来是接种培养，将制备好的试液接种到适当的培养基上培养；最后是菌落计数，根据培养后的菌落数量来确定微生物的限度。
3.微生物限度检查法的意义微生物限度检查法的实施，可以有效地控制药品中微生物数量的合理范围内，防止药品在生产、储存和使用过程中因微生物污染而导致药品变质、降解或产生毒性。
采用微生物限度检查法，可以杜绝因微生物污染而引起的医源性感染，保障患者用药安全。
4.对我国药典2020微生物限度检查法的个人观点和理解微生物限度检查法是药品质量控制中不可或缺的一部分，它直接关系到患者的用药安全和药品的治疗效果。
我国药典2020版本对微生物限度检查法做了全面更新和完善，包括对检查方法、标准和限度值的详细规定和说明，这对于药品的生产企业和监管部门都具有重要的指导意义。
在日常生产和监管中，执行我国药典2020版的微生物限度检查法，将有助于提高药品的质量和安全水平，保护患者的用药权益，为人民健康事业做出贡献。
5.总结我国药典2020版本中的微生物限度检查法，是药品质量控制中的重要环节。
通过严格执行微生物限度检查法，可以有效地控制药品中微生物数量，防止药品因微生物污染而造成质量问题和安全隐患。
我国药典2020版的微生物限度检查法的更新和完善，将为药品生产和监管提供科学的依据和指导。
在实践中要严格执行微生物限度检查法，确保药品质量和安全，保障患者的用药权益。
1.目的建立微生物限度检查法的标准操作规程，规范微生物限度检验操作。
2.范围适用于QC生测室微生物限度检查的操作。
3.责任人微生物限度检验员、QC部负责人对本规程的实施负责。
4.依据《中国药典》2010版二部附录5.程序5.1.微生物限度检查法定义微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
5.2.微生物限度检查室环境要求微生物限度检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
5.3.抽样5.3.1.供试品一般按批号随机抽样。
5.3.2.抽样量为一般检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。
5.3.3.抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应选有疑问的样品，但因机械损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需再抽样检验。
5.4.供试品保存5.4.1.供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件而引起致死、损伤或繁殖。
5.4.2.供试品在检验之前，应保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。
5.5.检查前的准备5.5.1.用具的洗涤与灭菌5.5.1.1.试管：使用过的试管经消毒后，将培养基倒出，用清洁液洗刷，用水冲洗4-5次，倒立，晾干备用。
灭菌前，用棉塞塞上管口，牛皮纸包紧，扎紧。
5.5.1.2.吸管：使用过的吸管用清洁液浸泡数分钟后，用水冲洗4-5次，晾干，备用。
灭菌前，在吸管上端距0.5cm处塞入约2cm左右的适当疏松棉花，用牛皮纸裹紧。
5.5.1.3.研钵：使用过的研钵用清洁液洗刷后，用水冲洗数次，晾干备用。
中国药典检测细菌检测方法一、培养基制备1. 按照中国药典规定，选择适当的培养基配方，并进行制备。
2. 培养基应新鲜、无菌，符合质量标准。
二、细菌接种1. 将待测细菌接种在适宜的培养基上，接种量应适宜，以保证细菌的正常生长。
2. 接种后，将培养皿放置在适宜的温度和湿度条件下进行培养。
三、培养与观察1. 定期观察细菌的生长情况，记录生长时间、菌落形态、颜色等特征。
2. 根据需要，对细菌进行革兰氏染色、生化反应等实验，以确定细菌的种类和特性。
四、计数与报告1. 对培养皿中的菌落进行计数，记录每个培养皿中的菌落数。
2. 根据中国药典规定，计算细菌的抑菌浓度或抗菌活性，并报告结果。
五、抑菌剂效价测定1. 选择适当的抑菌剂，按照中国药典规定的方法进行制备。
2. 将抑菌剂加入到含有待测细菌的培养基中，观察细菌的生长情况。
3. 根据抑菌剂对细菌生长的抑制程度，计算抑菌剂的效价。
六、抗菌谱测定1. 选择多种不同种类的细菌，分别接种在适宜的培养基上。
2. 将待测抗菌药物加入到含有细菌的培养基中，观察细菌的生长情况。
3. 根据抗菌药物对不同细菌的抗菌活性，确定抗菌药物的抗菌谱。
七、敏感试验1. 选择多种不同种类的细菌，分别接种在适宜的培养基上。
2. 将待测抗菌药物加入到含有细菌的培养基中，观察细菌的生长情况。
3. 根据抗菌药物对不同细菌的最小抑菌浓度或最小杀菌浓度，确定抗菌药物的敏感程度。
八、耐药性检测1. 选择具有耐药性的细菌，进行耐药性检测。
2. 将待测抗菌药物加入到含有耐药性细菌的培养基中，观察细菌的生长情况。
3. 根据抗菌药物对耐药性细菌的抗菌活性，确定抗菌药物的耐药性情况。
九、抗生素协同作用测定1. 选择多种不同的抗菌药物，分别加入到含有同一种细菌的培养基中。
2. 观察不同抗菌药物组合对细菌生长的抑制情况，计算协同指数或抑菌浓度加权指数。
3. 根据协同指数或抑菌浓度加权指数的大小，判断不同抗菌药物之间的协同作用情况。
【2020版中国药典】通则-非无菌微生物限度检查1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
学习：将旧版的“相应”更换为“规定”，更便于按照1107进行判定执行。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
洁净空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
学习：将旧版的“单向流空气区域”更换为“洁净空气区域”。
计数方法
……供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
……
提示：后文增加了对于“贵重药品、微量包装药品”的检验量的更全面的表述，因注意结合此处的要求。
计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验
……菌液制备……取黑曲霉的新鲜培养物加人适量含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或……
学习：此处改动同无菌检查法，将“3~5ml”的具体量调整为“适量”，便于根据孢子的量灵活掌握菌液制备方法。
培养基适用性检查
微生物计数用的商品化的预制培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
学习：类似于无菌检查法，此处将“成品培养基”修改为“商品。
霉菌与酵母菌总数、控制菌得检查。
二、引用标准：《中国药典》２015年版（通则1１05-1106）三、目录1。
微生物限度标准2.设备、仪器及用具3。
消毒液、稀释剂、试液及培养基4。
检查总则(通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法,通则1106非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法）5。
微生物计数法检查6.控制菌检查法7．实验技术8、附件１.微生物限度标准非无菌药用原料及辅料得微生物限度标准(2)．目测霉变者以不合格论。
（３）。
“无”为标准依据或无相应规定。
准依据或无相应规定.2.设施、仪器及用具2、１、设施：2、１、1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查得要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染得措施不得影响供试品中微生物得检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
２、1、2．其她设备:高压蒸汽灭菌器;细菌培养箱(3０~3５℃);霉菌培养箱(２5～2８℃)；电炉(或其她适宜得加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱(250~３00℃)；电冰箱。
生化试剂储存箱。
2、2仪器及器皿2、2、1。
菌落计数器；显微镜（15０0X）;电子天平或药物天平（感量0、1ｇ）;ｐH 系列比色计。
2、2、2．玻璃器皿：锥形瓶(2５０~３００ml,内装玻璃珠若干)、研钵（玻璃或陶瓷制,∮10～12ｃm)、培养皿（∮9 ｃm）、量筒(１00ml）、试管（1８×180ｍm）及塞、吸管（1ml分度0、01，10ml分度0、１)、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。
2、2、3新购得玻璃器皿得清洁:先用流水冲洗，浸泡于1％~２%盐酸（工业用）液中约2～6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗.用于化学分析得玻璃仪器,需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2～3次，晾干备用。
2、3用过得玻璃器皿：2、3、1未被病原微生物污染得器皿：可随时洗涤.用清水冲洗(或浸泡)，除容量仪器外，可用毛刷与肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净,晾干备用.容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗,最后以纯化水涮洗2～3次.试管及培养皿:先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内,经1２1℃灭菌30 分钟.趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗,最后以流水涮净。
目的建立微生物限度检查法标准操作规程，规操作，保证结果的准确性。
围成品、辅料、包装袋及纯化水的检验。
责任微生物限度检验人员容本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。
微生物计数法一、计数方法1、微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。
3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备4.1试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验。
4.2菌液制备按规定培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时使用；若保存在2-8℃，可在24小时使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期使用。
4.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
4.4培养基适用性检查按照表规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。
微生物限度检查标准操作规程1 目的与适用范围本规程规定了微生物限度检查方法和操作要求。
本规程适用公司所需进行微生物限度的检查。
2 职责质量保证部负责本规程的实施。
3 内容3.1 引用标准：《中国药典》2010年版二部。
3.2 药品微生物限度检查法总则3.2.1 抽样3.2.1.1 供试品一般按批号随机抽样。
3.2.1.2 一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。
3.2.1.3 抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应选有疑问的样品，但因机械损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需要再抽样检验。
3.2.2 供试品保存供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。
3.2.2.2 供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。
3.2.3 检验3.2.3.1 供试品检验项目按《中国药典》2010年版二部微生物限度标准确定。
3.2.3.2 检验的全过程，均应严格遵守无菌操作，严防再污染。
3.2.3.3 除另有规定外，供试品制备成供试液后，应在均匀状态取样。
3.2.3.4 制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。
3.2.4 培养3.2.4.1 除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25～28℃，控制菌培养温度为36℃±1℃。
3.2.5 复检3.2.5.1 菌数测定不合格者应复检，控制菌检查以一次检出为准，不再复试，但应保留检出菌株一个月备查。
3.2.5.2 复试项目以不合格项目为准，作单项复试。
3.2.5.3 复试需另取同批号样品，复试2次。
3.2.5.4 复试报告，以3次测定结果的平均值报告。
3.2.6 检验报告3.2.6.1 检验报告以1g、1ml或10cm2为单位。
3.2.6.2 测定菌数报告，依3.10.2.4菌数报告规则报告。
微生物检验规程1.实验注意事项无菌操作要求接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。
专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。
接种样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。
进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。
从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。
接种样品、转种细菌必须在酒精灯旁操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞（即硅氟胶塞）都要通过火焰消毒。
接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处。
吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
?无菌间使用要求无菌间内应保持清洁，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。
??无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。
???处理和接种样品时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。
消毒灭菌要求灭菌前准备（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。
（2）装培养基的三角瓶，内容物不应超过总体积的2/3（例如500mL的三角瓶最好装300～350mL培养基，以防再次加热融化时爆沸）。
（3）无菌室内使用的毛巾、脱脂棉球用纸包裹，进行湿热灭菌。
装放（1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。
（2）大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。
设备检查（1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。
（2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。
（3）对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。
灭菌处理(1) 干热灭菌法：用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等的灭菌。
灭菌完毕后或温度升温过程中，须在60℃以下才能打开箱门。
(2)立式压力蒸气灭菌器：待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。
（3）物品取出,随即检查包装的完整性,若有破坏或棉塞脱掉、包装有明显的水浸者,不可作为无菌物品使用。
培养基或试剂等,应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态,未达到者应废弃。
取出的物品掉落在地或误放不洁处,或沾有水液,均视为受到污染,不可作为无菌物品使用。
取出的合格灭菌物品,应存放于贮藏室或防尘柜内,严禁与未灭菌物品混放。
凡属合格物品,应标有灭菌日期及有效期限。
有毒有菌污物处理要求经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌（经微生物污染的培养物，必须经121℃30min高压灭菌）。
染菌后的吸管（即进行阳性菌操作后的），使用后放入5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液体不得低于浸泡的高度）再经121℃30 min高压灭菌。
涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，强致病菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5﹪煤酚皂溶液中浸泡24 h后，煮沸洗涤。
做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。
打碎的培养物，立即用5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。
污染的工作服或进行强致病菌试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。
?????培养基制备要求根据培养基配方的成分按量称取（可根据产品说明书用量和方法进行），然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。
因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量。
盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器（三角烧瓶）为好。
每批培养基制备好后，应做无菌生长试验（空白平皿试验）及所检菌株生长试验。
如果是生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放。
2.实验操作准备用具，配制培养基、稀释液、培养箱：需氧菌菌总数胰酪大豆胨琼脂培养基、霉菌和酵母菌总数沙氏葡萄糖琼脂培养基控制菌胰酪大豆胨液体培养基肠道菌增菌液体培养基麦康凯液体培养基RV沙门增菌液体培养基接种平板紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基麦康凯琼脂培养基木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基：0. 9%无菌氯化钠溶液培养箱：3个（30?35℃、20?25℃、42?44℃）培养基配制灭菌无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24至48小时，以检查灭菌是否彻底。
无菌室准备：用消毒液擦拭无菌室，将本次试验所用的器皿、培养基通过传递窗送到无菌室，，样品置于传递窗，一次性使用物料（工作服、口罩、手套）置于缓冲间。
开启净化系统1小时，关闭净化系统，打开紫外灯小时，关闭紫外灯，至少小时后进入无菌室。
微生物计数检验（平皿倾注法）：一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂为100cm2; 贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
检验时，应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4 丸，膜剂还不得少于4 片。
：0. 9%无菌氯化钠溶液：3个稀释级（常用10-1、10-2、10-3）（每稀释级每种培养基至少制备2 个平板），同时做空白（等量稀释剂）〖供试液用量为适应性试验确定的，常用1ml〗取培养基，融化并让其冷却至45℃左右，倾入已加入供试液的平皿中，每个平皿约15mL（即倾倒时液面刚刚闭合时），在超净台面上轻轻晃动使供试液均匀混合于培养基中，放置一旁待冷却凝固。
培养：待平皿完全冷却凝固，通过传递窗取出，倒置叠放置于培养箱中。
培养时间及温度：需氧菌菌总数 30?35℃培养3?5 天霉菌和酵母菌总数 20?25℃培养5?7 天，控制菌检验取供试品10g，用稀释剂制成1 : 10供试液，混匀，在20?25℃培养约2小时(可以在无菌室中先做这一步，等其余试验步骤完成，再继续进行控制菌的下一步)。
耐胆盐革兰阴性菌胰酪大豆胨液体培养基大肠埃希氏菌 0. 9%无菌氯化钠溶液沙门菌直接取样品10g或10ml（增菌培养）：取供试液10mL（相当于1g样品），加在 ml增菌液体培养基（经方法适用性试验确定）中，30?35℃培养24?48小时。
耐胆盐革兰阴性菌肠道菌增菌液体培养基大肠埃希氏菌胰酪大豆胨液体培养基沙门菌胰酪大豆胨液体培养基：取相当于、和(或、和供试品的预培养物或其稀释液分别接种至适宜体积(经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培养基中，30?3 5℃培养24?4 8小时。
肠埃希氏菌：l ml接种至100 ml麦康凯液体培养基中，42?44℃培养24?4 8小时。
沙门菌： ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，30?35℃培养18?2 4小时。
平板划线分离培养（1）培养基平板的准备：取培养基，融化并让其冷却至50℃左右，倾入灭菌平皿中，每个平皿约15mL，使其分布均匀，冷却凝固后即为固体平板培养基。
耐胆盐革兰阴性菌紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基大肠埃希氏菌麦康凯琼脂培养基沙门菌木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（2）各种物品的准备取出预培养后的控制菌供试液，置于工作台上；接种前准备好酒精灯、一次性接种针、火柴、酒精棉球、试管架等。
可在阳性菌室或无菌室操作，无菌室准备工作相同。
（3）平板划线以左手持平板，中指、无名指和小指托着平板底,拇指和食指打开上盖，使盖与底成30°角，以便划线。
右手握一次性接种针，把接种针上的菌液涂在培养基一侧，一般作5-8次划线。
将环上的多余细菌材料烧掉后，从第1次划线引出第2次划线；再从第2次划线引出第3次划线，如此反复3-4次划线后，即可把整个平板表面划满，注意每一次划线只能与上一次划线重叠，这样就可在最后的1-2次划线上出现多量的单个菌落，以便进行纯培养。
30?35℃培养18?24小时。
培养物的观察需氧菌总数：每天观察菌落的生长情况，如数目多，应及时点计。
霉菌和酵母菌总数：每天观察菌落的生长情况，如数目多，应及时点计。
大肠埃希菌：每天观察菌落的生长情况。
沙门氏菌：菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。
如有疑似菌落则用接种针挑选于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18?2 4小时，或采用其他适宜方法进一步鉴定。
3.数据报告平皿法：点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。
菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。
点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以上。
控制菌耐胆盐革兰阴性菌：紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性。
根据各培养管检查结果，从表2查l g 或lm l供试品中含有耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数。
大肠埃希菌：若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。
若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为沙门菌。
如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色（或斜面黄色、底层未见黄色或黑色，判供试品未检出沙门菌。
报告规则：需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于l00cfu的稀释级，作为菌数报告的依据。
取最髙的平均菌落数，计算lg 、lmL或10cm2供试品中所含的微生物数，取两位有效数字报告。
如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1 时，以< 1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
结果判断：101 cfu：可接受的最大菌数为20102cfu：可接受的最大菌数为200103cfu：可接受的最大菌数为2000，依此类推。
限度标准：需氧菌总数 103cfu（≤2000） 102cfu（≤200）霉菌和酵母菌总数 102cfu（≤200） 101 cfu（≤20）大肠埃希菌不得检出沙门菌（含脏器提取物的）不得检出需氧菌总数 104cfu（≤20000） 5×102cfu（≤1000）霉菌和酵母菌总数 102cfu（≤200） 102 cfu（≤20）大肠埃希菌不得检出沙门菌（含脏器提取物的）不得检出耐胆盐革兰阴性菌＜102需氧菌总数 105cfu（≤200000） 103cfu（≤2000）霉菌和酵母菌总数 5×102cfu（≤1000） 102 cfu（≤200）大肠埃希菌不得检出沙门菌（含脏器提取物的）不得检出耐胆盐革兰阴性菌＜1014.实验时间安排第一天：准备用具、培养基、稀释剂，灭菌第二天：准备无菌室（预计2小时），检验（无菌室操作预计3小时），平皿冷却（夏季预计2小时，冬季预计1小时），移出无菌室进行培养（预计小时）第三天：观察培养物（需氧菌菌总数、霉菌和酵母菌总数第一天），耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌、沙门氏菌的预培养结束，进行分离培养操作，准备培养基平板。
