血液病检验技术实验指导实验一、活化凝血时间测定【实验原理】同试管法CT测定。
试验中加入白陶土-脑磷脂的悬液以充分激活因子Ⅻ和Ⅺ，并为凝血反应提供丰富的催化表面，故称为活化凝血时间（ACT）；还可以避免因接触激活阶段的不同结果带来的影响，从而提高了本试验的敏感性和重复性。
【试剂】1．脑磷脂的制备脑磷脂是将兔脑粉中的组织凝血活酶除去参与外源凝血途径的蛋白部分后所得的磷脂，故又称部分凝血活酶。
取干燥兔脑粉1.2g加25ml丙酮，放置2h后过滤，将此兔脑粉加氯仿25ml，连续震荡2h，以滤纸过滤，滤液蒸发后为淡黄色蜡状物，刮入玻璃研钵中，加12ml生理盐水研磨成均匀乳剂，以每安瓶0.25ml分装。
2．4%白掏土悬液白陶土2g加入50ml生理盐水中，室温保存，用前摇动。
3．4%白陶土-脑磷脂悬液将脑磷脂用巴比妥缓冲液作1：50稀释后，再加等量4%白陶土悬液混合而成。
4οC可保存3天，用时充分混合。
4．巴比妥缓冲液巴比妥钠11.75g、NaCl14.67g、0.1mol/L的HCl430ml，加蒸馏水至2000ml。
此缓冲液pH应为7.3，否则影响试验稳定性。
【操作方法】1．在含4%白陶土-脑磷脂悬液0.2ml的试管中注入受检全血0.5，轻轻混匀。
2．其余操作同试管法CT测定。
【参考值】 1.70±0.76 (1.14～2.05)min。
【临床意义】1．同试管法CT测定，但较其敏感，重复性也较好，可检出因子Ⅷ：C小于45%的亚临床型血友病。
2．是监测体外循环肝素用量的良好指标之一。
实验二、血浆游离血红蛋白测定（邻一甲联苯胺法）【实验原理】邻一甲联苯胺在酸性溶液中和过氧化氢与血红蛋白共同作用生成氧化型联苯胺，产生绿色→蓝色→紫色，其颜色的深浅与血浆游离血红蛋白的含量呈正相关。
【试剂】1．2g/L邻一甲联苯胺溶液称取邻一甲联苯胺0.2g，溶于冰醋酸60ml，加蒸馏水至100ml,置于棕色瓶内于冰箱保存，色变暗应重配。
2．1%过氧化氢溶液用30%过氧化氢原液新鲜配制。
3．10%冰醋酸溶液。
取10ml冰醋酸，加蒸馏水至100ml。
4．血红蛋白应用标准液将血红蛋白贮存液用生理盐水稀释成10mg/100ml 备用。
5．抗凝试管取0.2ml 100U/ml肝素于试管内，在80℃以下烘干，每管可抗凝2ml全血。
【操作方法】1．将抗凝全血分离血浆。
2．取试管3支，分别标明测定、标准和空白，分别加入血浆、应用标准液，再向各管中分别加入邻一甲联苯胺溶液及1%过氧化氢溶液各1.0ml，充分混匀，放置10min。
3．于上述3支试管内分别加入10%冰醋酸溶液10ml混匀，用435nm波长比色，以空白调“0”，读各管吸光度。
4．计算：测定管吸光度游离Hb( mg/L) = ________________________×100标准管吸光度【质量控制】1. 一切容器均应避免血红蛋白污染，标本勿溶血，否则可引起假阳性。
2. 过氧化氢溶液浓度要准，新鲜配制。
3. 联苯胺醋酸的含水量不能低于15%和超过30%，否则均可引起吸光度降低。
4. 标准液的加入量一定要准。
【参考区间】 <40mg/L【临床意义】血浆游离血红蛋白含量增加是血管内溶血的特征。
血浆中血红蛋白含量超过与血清中结合珠蛋白的结合能力时，其含量即可升高。
微血管内溶血时，血浆游离血红蛋白含量均明显升高。
PNH为200～2500mg/L，输不合血型后为150～5000mg/L。
温抗体型自身免疫性溶血性贫血、镰状细胞贫血及地中海贫血时血浆游离血红蛋白可轻度或中度增加。
血管外溶血则正常。
实验三、血清结合珠蛋白测定（比色法）【实验原理】血清结合珠蛋白（Hp）是肝脏产生的a2糖蛋白，它与游离的血红蛋白（Hb）具有特殊的亲合力，可形成稳定的Hb-Hp复合物，后者在弱酸性（pH4）条件下，具有过氧化物酶的活性，测其活性可间接反映Hp的含量。
【试剂】1．乙酸缓冲液0.2mol/L（pH4）称取乙酸钠（NaAC·3H2O）2.8g,冰乙酸5.7ml溶解，加蒸馏水至500ml。
2．0.1%（V/V）愈创木酚溶液取1ml愈创木酚溶液于500ml乙酸缓冲液中，加蒸馏水至1000ml。
3．0.3%过氧化氢溶液临用前配制。
4．0.5g/L 高铁血红蛋白液。
【操作方法】1．取静脉血分离血清，避免溶血。
2．取受检血清0.4ml，与等量高铁Hb 溶液混合。
3．取上述混合液0.2ml，加入于已预温（25℃）的愈创木酚5ml溶液中，再加入0.5ml 0.3%过氧化氢，于25℃水浴内作用8min，注意避光。
每份标本均应双份同时测定。
4．用蒸馏水调“0”点，440nm处读取吸光度。
5．由校正曲线查出受检血清中Hp 含量。
【质量控制】1．受检血清要避免溶血。
2．电泳时温度不能过高，应把电泳槽置于冷水中电泳。
否则电泳效果差，区带不易区分。
3．电泳液应经常更换，防止因pH及离子强度改变对电泳效果的影响。
【参考区间】 0.2～1.9gHb/L。
【临床意义】 Hp可与Hb结合，以除去血循环中游离的Hb。
各种溶血性贫血，无论血管内溶血还是血管外溶血，血清中Hp含量均明显降低，甚至测不出。
Hp降低的程度与溶血程度呈正相关，即溶血越严重，血清Hp越低。
如果血管内溶血超出Hp的结合能力，即可出现血红蛋白尿。
动态监测表明，急性溶血开始，血循环中游离Hb即迅速增加，随着Hb-Hp 复合物的有效清除，血清Hp也随之恢复正常，因此血清Hp与游离Hb同时测定对溶血性贫血的诊断及疗效观察均具有重要意义。
肝病、传染性单核细胞增多症和先天性无Hp血症，Hp亦降低，故诊断溶贫时应除外上述疾患。
感染、创伤、肿瘤、肝外阻塞性黄疸及类固醇激素治疗时Hp可增加，这些情况下Hp正常也不能除外溶血。
醋纤膜电泳有助于区别血管内抑或血管外溶血。
各种溶血性贫血患者Hp均显著减少，甚至缺如，故电泳后无Hb-Hp区带，而仅有一条未结合的Hb区带。
但显著血管内溶血（如PNH）时，还出现一条高铁血红素白蛋白区带，而血管外溶血（如球形红细胞增多症）则无此区带。
实验四、尿含铁血黄素试验（R ou’s test）【实验原理】含铁血黄素中的高铁离子（Fe3+）在酸性环境中与亚铁氰化钾作用，生成蓝色的低铁氰化铁，称为普鲁氏蓝反应。
【试剂】1、20g/L亚铁氰化钾水溶液，用时新鲜配制。
2、3%盐酸。
【操作方法】取新鲜尿5ml离心沉淀，弃去上清，于沉淀中加入试剂①和②各1ml，混匀。
置室温10min，再离心沉淀，取沉淀物显微镜检查。
【结果判断】如见到有分散或成堆蓝色颗粒（直径约1～3μm）即为阳性。
存在于细胞内更为可信。
【质量控制】所用试管、玻片、试剂均应防止铁剂污染，否则出现假阳性。
每次试验应做阴性对照。
如两种试剂混合后即显深蓝色，提示试剂污染高铁，不宜使用。
晨尿阳性率较高。
【临床意义】血浆游离血红蛋白经肾小球滤出后，被肾小管上皮细胞吸收、降解，最后形成含铁血黄素，贮存于细胞内。
当细胞脱落随尿排出，即成为含铁血黄素尿。
正常为阴性。
阳性主要见于慢性血管内溶血，尤其以PNH为多见。
即使无血红蛋白尿时也可呈阳性。
但阴性结果也不能完全排除血管内溶血，因含铁血黄素颗粒的直径需>1μm时才能从镜下见到。
急性血管内溶血时，虽可有血红蛋白血症和血红蛋白尿，但还不能形成足够大的含铁血黄素颗粒，需在数日后才阳性，并可持续数周。
实验五、红细胞渗透脆性试验【实验原理】红细胞在低渗盐水中，水分透过细胞膜内渗，使之膨胀破坏而溶血。
本试验是测定红细胞对不同浓度低渗盐水的抵抗力，以鉴别某些与红细胞形态有关的溶血性贫血。
红细胞对低渗盐水的抵抗力与其表面积和体积的比值有关，厚度越大，该比值越小，即渗透脆性越大；反之，脆性越小。
以浓度为横坐标，溶血度为纵坐标绘制曲线，找出50%溶血对应的盐浓度，即红细胞中间脆性（MCF），后者较敏感。
【试剂】 171mmol/L NaCl(10g/L)溶液：将100℃烘干的分析纯氯化钠1.0g置于100ml 容量瓶中加少量蒸馏水溶解后，再加蒸馏水至刻度处。
【操作方法】取12支试管，按5-1分别加入10g/L NaCl和蒸馏水。
表5-1红细胞渗透脆性试验操作表（国际单位制）试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1210g/L NaCl(ml) 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6蒸馏水（ml） 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 NaCl SI g/L 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 制 mmol/L 116.3 109.4 102.6 95.8 88.9 82.1 75.2 68.4 61.6 54.7 47.9 41.0浓度旧制（%） 0.68 0.64 0.60 0.56 0.52 0.48 0.44 0.40 0.36 0.32 0.28 0.24 然后各管立即加入新鲜静脉血各1滴，并从低浓度到高浓度逐管颠倒混匀，室温静置。
【结果判断】静置室温2h，观察结果，从高浓度开始，上清液呈透明红色而管底有红细胞者为开始溶血管；溶液透明红色，管底完全无红细胞者为完全溶血管。
【质量控制】1．NaCl溶液浓度要准确，故应干燥精称。
2．注射器和试管必须清洁干燥。
3．应用新鲜静脉血，忌用抗凝血，必要时可用去纤维蛋白血或肝素抗凝血。
4．结果不易判断时可离心后观察。
5. 黄疸病人开始溶血不易观察，严重贫血红细胞太少时均可用等渗盐水将红细胞洗涤后再配成50%红细胞悬液进行试验。
6．每次试验均应做正常对照，与被检血相差0.4g/L，即有临床意义。
【参考区间】开始溶血：71.8～78.6mmol/L（4.2～4.6g/L）完全溶血：47.8～54.7mmol/L（2.8～3.2g/L）中间脆性：68.5～76.2mmol/L【临床意义】患者比正常对照高6.8mmol/L或中间脆性>76.2mmol/L有诊断价值。
脆性增加：见于遗传性球形红细胞增多症，也见于自身免疫性溶血性贫血伴球形红细胞增多者。
脆性降低：见于缺铁性贫血，各型地中海贫血，HbC、D、E病，脾切除术后及阻塞性黄疸等。
实验六、酸溶血试验（H am’s test）【实验原理】正常人红细胞在酸化（pH6.6～6.8）的自身新鲜血清中（内含补体和备解素），经37℃孵育1h不溶血。
而阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）患者，因红细胞膜缺陷，对补体溶血效应敏感性增强，则发生溶血。
【试剂】1．0.2mol/L HCl。
2．8.5g/L NaCl溶液。
【操作方法】1．配制50%红细胞悬液取10ml离心管2支，标明患者、对照，均加入8.5g/L NaCl 溶液5～6ml，分别加入患者和对照者未梢血十几滴，混匀，离心后弃去上清，如此重复洗涤红细胞2次，最后配成50%红细胞悬液备用。
