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《放射免疫技术》课件

《放射免疫技术》课件

放射免疫技术的应
06
用案例
肿瘤标志物的检测
肿瘤标志物
放射免疫技术用于检测与肿瘤相 关的生物活性物质，如癌胚抗原 （CEA）、甲胎蛋白（AFP）等 ，有助于肿瘤的早期发现和诊断 。
应用范围
放射免疫技术广泛应用于临床肿 瘤的筛查、诊断、病情监测以及 疗效评估，为肿瘤患者提供个性 化的治疗方案。
内分泌激素的检测
试剂的验证
对试剂进作流程的规范
制定详细、规范的操作流程，确保检测过程的准确性和可靠性。
操作人员的培训
对操作人员进行专业培训，提高其技能水平和责任心。
操作过程的监控
对操作过程进行实时监控，及时发现并纠正操作中的问题。
放射免疫技术的优
05
缺点
优点
高灵敏度
放射免疫技术具有很高的灵敏度，可 以检测出极低浓度的蛋白质、激素和 其他生物分子。
特异性
该技术利用抗体与抗原的特异性结合 ，能够准确地检测目标分子，减少了 背景干扰。
可定量
通过测量放射性计数，可以定量分析 样本中目标分子的浓度，提供更准确 的定量数据。
易于自动化
随着技术的发展，放射免疫分析已经 实现了自动化，提高了检测效率。
。
放射性标记物通常为放射性同位 素标记的抗原或抗体，与未标记 的抗原或抗体竞争性结合特异性
抗体或抗原。
通过测量放射性标记物的信号强 度，可以推算出待测抗原或抗体
的浓度。
放射免疫分析的类型
竞争性放射免疫分析
在待测抗原和标记抗原同时存在的条 件下，竞争性地与有限量的特异性抗 体结合。
非竞争性放射免疫分析
缺点
放射性危害
半衰期限制
使用放射性同位素作为标记物可能对实验 人员和环境造成潜在的危害，需要采取严 格的防护措施。

放射免疫试验 ppt课件

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本章小结（2）
免疫放射分析以标记抗体为特点，为非竞争性免疫分 析模式，以过量标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结 合反应，采用固相免疫吸附方式对B或F进行分离；免疫放 射分析以双位点（双抗体夹心）法较为常用，适用于大分 子蛋白质（多肽）定量分析。
Thank you !
引言
放射免疫试验以放射性核素为特征，通过测定放射性 强度评估抗原-抗体反应的强度，从而实现对待测物质的 定量（或定性）分析。放射免疫试验将放射性核素的高灵 敏性与抗原-抗体间的高特异性结合于一体，具有较高的 分析敏感性和分析特异性。
引言
放射免疫试验创立了两种重要标记免疫分析模式即竞 争性免疫分析（放射免疫分析方法）和非竞争性免疫分析 （免疫放射分析方法），同时，也创立了固相吸附分离方 法，以及剂量-反应曲线的数学处理模型，为酶免疫试验 和发光免疫试验奠定理论和实践基础。
第一章 血液标本采集与处理
临床免疫学检验技术
第七章 放射免疫试验
精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
笨，没有学问无颜见爹娘 ……” • “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
放射性测量
放射性核素 125I γ射线
测量仪器 采用γ计数器
实例：
➢
图：标准曲线
第二节 免疫放射分析方法
相关知识
免疫放射分析 immunoradiometric assay， IRMA
非竞争性免疫分析 发明人：Miles and Hales 1968
一、分析原理（1）

放射免疫技术 ppt课件

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bolton-Hunter
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125碘-标记物的制备－纯化
凝胶过滤法
离子交换层析法 聚丙烯酰胺凝胶电泳 高效液相色谱法
聚合、 损伤物 标记蛋白
游离125I
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13
125碘-标记物的制备－鉴定
放射化学纯度 单位标记物中结合于被标记 物上的放射性占总放射性的百 分率 应大于95% 免疫活性 标记物与抗原或抗体反应的能力 标记物与过量抗体反应百分比 该值越大, 标记物免疫活性好 14 ppt课件 （应大于 80%）
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注：T即是B与F的总和
27
二、放射免疫分析－实验方法及测定
实验过程包括：抗原抗体反应、分离结合标记物、放射性 测定和数据处理等。
抗原抗体反应
Ag*
反应条件 体积 温度 时间 pH
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平衡 非平衡
一步法 二步法
Ag
Ab
(标准Ag/样品Ag)
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分离结合、游离标记物
只有将B和F分离，并测定其中一个组分（一般测量结合标记 物），才能得到剂量反应曲线。
γ
β
理化性
核素丰度 半衰期 标记方法 标记设备 测量条件
活泼
>90% 60.2d 简单 低廉 简单
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差
－ 12.3y 复杂 昂贵 复杂
9
三、放射免疫技术－标记物制备及鉴定
125碘-标记物的制备－标记
直接标记法
化学或酶促反应，将 放射性负电碘离子氧 化成碘原子或正电碘 离子，通过取代反应 置换被标记物分子中 酪氨酸或酪胺残基以 及组胺残基上的氢原 子。
标记物质量 高比放射性 高纯度 完整免疫活性
比放射活性

放射免疫分析-PPT课件

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16
B/F
0 [Ag0]
标准曲线
17
根据加样顺序与温育次数的不同，放 射免疫分析可分为如下三种。 平衡法：将非标记抗原、抗体、标记抗原 依次加入反应管，混匀后一次性温育至反 应达到动态平衡，再加分离剂使B与F分离。
18
顺序加样法：先将非标记抗原与抗体在反 应管内作第一次温育，待反应达到动态平 衡后，加入标记抗原，作第二次温育，然 后分离B与F。
25
第4代(1981-1995)：早在l975年，Milstein和Kshler 将绵羊红细胞注射给小鼠，将获得的小鼠脾细胞 与骨髓瘤细胞融合，得到了杂交细胞，经培养、 分离、成株等系列步骤后，首次制备出小鼠抗绵 羊红细胞的单克隆抗体(mAb)。这一重大研究成 果为RIA及其他免疫分析技术提供了新型特异性 抗体。进入20世纪80年代，mAb制备技术的完善 和许多固相载体材料的研制成功，将试管固相、 塑料球等包被mAb制成固相抗体，传统IRMA技术 的灵敏度、特异性和检测量程度提高到了一个新 水平。
4
R.S. Yalow
S.A. Berson
5
由于胰岛素抗体的浓度太低，用以往 的免疫学技术不能测定，因此Berson 和Yalow等人采用放射性标记法测定浓 度极低的抗原-抗体复合物。电泳结果 表明在接受胰岛素治疗的病人的血浆 中，胰岛素与一种球蛋白结合，证明 胰岛素抗体确实存在。
6
值得一提的是，在20世纪50年代中期， 免疫学家还不能接受“胰岛素抗体”这 一概念。Berson和Yalow等人的论文被 《Science》退稿，刚开始投《Journal of Clinical Investigation》(JCI)也是退稿， 后来向JCI的编辑作出妥协，从标题中 删去“胰岛素抗体”字样，论文才得以 在JCI上发表。

第五讲 放射免疫分析技术(2007)

第五讲 放射免疫分析技术(2007)

k1 AgAb KA k 2 AgAb
k1和k2分别代表结合速率常数（association rate constant）和解离速率常数（dissociation rate constant），[Ag]、[Ab]、[AgAb]分别代表游离抗原、游 离抗体和抗原抗体复合物的浓度 。
4．抗血清的质量鉴定 经免疫流程获得的抗血清， 应经过特异性、亲和力和滴度三方面的鉴定，从中 挑选优质者用于RIA。 （1）特异性检验 是保证RIA准确性的必要条件， 通常是用抗体与抗原及其结构类似物的结合力比值 的百分率，即交叉反应率来表示。 （2）亲和力 抗血清亲和力的大小可用抗体的亲和 常数（K值）来表示。 K值愈大，检测的灵敏度愈高， 故在RIA中，应尽量选用K值高的抗血清。 （3）滴定测定 抗血清的使用滴度通常以能与50% 示踪剂结合的抗血清稀释倍数的倒数来表示。应根 据实践要求的灵敏度和检测范围，通过抗血清稀释 曲线来选择抗血清的工作滴度，同时调整标记抗原 的用量，使之匹配及符合实际要求。
（三）、放射性标记物 用高纯度抗原制备
标记抗原，用作RIA的示踪剂。常用的标记核 素有125I和3H。分离纯化后的标记抗原需要进 行质量考察：
放射核纯度 放射化学纯度 放射性比活度 生物活性和免疫活性 标记位臵和定量分布情况
（四）、分析方法
1.反应方式 (1)．平衡加样法（balance assay）反应的时间较 长，灵敏度相对较差，但操作方便，精密度较好。 (2)．顺序加样法（sequential assay）目的是使非 标记抗原与抗体结合的几率比标记抗原大，提高了 非标记抗原的竞争的能力，使较少的非标记抗原就 导致结合率有统计学上的显著差别，于是提高了方 法的灵敏度。 2.反应条件的优化 对缓冲液的pH、离子强度等需要进行优化；另外， 在缓冲体系中加入一定量的血清、BSA、EDTA、叠氮 化钠和其他的一些添加剂对反应的进行都有一定的 好处。

最新第六章--放射免疫实验ppt课件

最新第六章--放射免疫实验ppt课件

• 降钙素（CT）和甲状旁腺激素（PTH）
• CT及PTH参与钙稳态调节机制：当血钙降低时， PTH分泌增加，作用于骨促进溶骨，钙自骨释出， 同时作用于肾使肾小管对钙回吸增多。血钙上升则 刺激甲状腺分泌CT抑制骨钙释放，同时促进肾小球 对钙的排出。
• CT和PTH的分泌功能彼此成反馈关系，机体通过它 们互相拮抗作用维持代谢的内环境稳定。降钙素和 甲状旁腺激素对钙代谢的调节不仅取决于它们在血 中含量的绝对值，更重要是它们的比值。因此测定 它们的比值对内分泌代谢病研究很有价值。
• 1,25二羟基维生素D及25羟基维生素D
• 体内维生素D经日光紫外线照射、且在C1和C25位 羟基化后，才能转变为有活性的维生素D代谢物。
• 测定血清中1,25二羟基维生素D及25羟基维生素D 的浓度可鉴别与维生素代谢有关的疾病。目前国内 用维生素D放免药盒用于维生素D缺乏症、骨营养 不良、肝炎和药物性维生素D紊乱、甲状旁腺功能 亢进或减退的测定。
临床化学分析
10-3
10-0
mg/mL
g/L
Therapeutic Drugs
Thyroid Hormone
Fertility Hormone Allergy
Cancer Markers Infectious Disease
Vitamins Serum Proteins
基本原理
竞争结合：放射性标记的抗原（Ag*）和非 标记的抗原（Ag）在同一反应系统中与特异 性抗体（Ab）的竞争性结合。
• 测量仪器： • （1）γ 计数仪 • （2）β液体闪烁计数器
两种标记方法的优缺点
3H标记物
货架期长
以3H置换H，对原物质 免疫活性无改变
标记难度大，比活度低 Β射线测量效率低 废弃物处理较困难

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03
在标记反应过程中进行实时监测，确保反应顺利进行
。
分离与测量
分离方法选择
01
根据实验需求选择合适的分离方法，如离心、过滤、层析等。
测量设备校准
02
确保测量设备准确无误，并进行必要的校准和验证。
测量过程控制
03
在测量过程中进行质量控制，确保测量结果的准确性和可靠性
。
结果分析
数据处理
对实验数据进行整理、统计和分析，提取有用的信息 。
应用领域的拓展
临床诊断
扩大在肿瘤、心血管、神经退行性疾病等 领域的诊断应用，提高疾病早期发现和治
疗效果评估的准确性。
生物医药研究
应用于新药研发、药物代谢、蛋白质组学 等领域，为生物医药研究提供有力支持。
环境监测与食品安全
拓展在环境污染物、农药残留、食品添加 剂等方面的检测应用，保障环境和食品安
全。
亲和层析
利用抗原抗体之间的特异性结合进 行分离。
04
测量方法
液体闪烁计数器
用于测量放射性核素发出的射线。
γ射线计数器
用于测量放射性核素发出的γ射线。
液体闪烁能谱仪
用于测量放射性核素发出的射线能谱。
γ射线能谱仪
用于测量放射性核素发出的γ射线能谱。
03
放射免疫分析的实验操作 流程
实验前的准备
实验器材和试剂准备
抗原-抗体反应
01
02
03
特异性
抗原与抗体之间的特异性 结合，决定了反应的特异 性。
亲和力
抗原与抗体之间的亲和力 决定了结合的牢固程度。
反应动力学
反应速度和平衡状态对实 验结果的影响。
分离技术
01
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d. 标记产物的鉴定：常用 RIA 法
• 最大结合百分率 • 标准曲线比较法
e. 半抗原的标记：必须先连接载体，常用牛血清白蛋白（BSA），
再对载体作标记
7
（3）特异性结合抗体
• a. 对特异性结合抗体的要求：
•
亲和力（affinity）高：指单个抗体分子与抗原决定簇特异结
合的能力，用 K 值表示，反映灵敏度
分离后便于放射性测量
•
分离效果不受外界干扰因素的影响
•
操作简便、分离迅速、重复性好
•
与游离标记物的非特异性结合尽可能小
•
试剂来源广泛、价格低廉
• b. 常用的分离方法
•
二抗法：非特异性低，但沉淀较差
•
PEG 法：沉淀较好，但非特异性高
•
二抗-PEG 法：较好，现常用
•
磁化颗粒法：
•
固相法：现较常用
11
•
女科学家 R.Yalow（美,1921~）1950’末
• 发明（胰岛素），1977年获诺贝尔医学奖
• 1. 基本原理
•（1）竞争结合分析：Ag + Ab AgAb
•
*Ag + Ab *AgAb
• （2）IRMA（免疫放射分析）：
• 2. 常用标记核素：
• （1）125I： γ 射线，半衰期 60 天
13
7. 放射免疫分析的质量控制
• （1）放射免疫分析中的误差及引起误差的原因
• a. 系统误差：由于某些特定的原因造成的带有倾向性的误差
•
试剂误差：标准品不准；标记物变质；抗体失效；分离剂的
影响
•
仪器误差：测量仪器不准；加样器不准
•
分离误差：分离不完全或失误
•
数据处理误差：选用数学模型不当
• b. 随机误差：偶然因素造成的误差
氯胺-T 法：最常用的 125I 标记法，I 与酪氨酸共价结合，方法 简便，但易造成蛋白质的损伤
• 乳过氧化酶法： • Iodogen（氯甘脲）法：固相法，标记率较高，损伤小，反应
时间长
• 置换法： 3H 最常用
c. 标记产物的纯化：常用 Sephadex 层析，也可用硅胶 G 薄板层析
或 HPLC 分离
•
同位素计数的统计涨落
14
（2）放射免疫分析的质量控制指标
• a. 精密度：即重复性，是评价随机误差的指标，用标准差（SD）、
变异系数（CV）、精密度图（PDP）表示
• b. 准确度：指测定值与真值的符合程度，偏离程度叫偏差，常以
偏离真值的百分比表示，常用回收试验及平行性实验来评价
• c. 灵敏度：指测定方法的最小可测值， 即能与零剂量相区别的最
液。根据需要定
• b. 反应体积：小体积可提高灵敏度，但增大了误差 • c. 反应时间： • d. 反应温度： • e. 反应物比例：减少抗体与标记的用量可提高灵敏度；增加抗体10
与标记的用量可扩大测定范围
（3）分离方法
• a. 对分离方法的要求：
•
使结合部分（B）与游离部分（F）尽可能分离完全
•
• （2）3H： β 射线，半衰期 12.3 年
• 3. 测量仪器
• （1）γ 计数仪
• （2）β 液闪仪
4
4. 基本试剂
• （1）标准品与质控品
• a. 意义：放射免疫定量分析的尺度、质量控制的依据
• b. 要求：
•
化学结构上——与待测物有相同的化学结构
•
化学纯度上——对竞争反应有干扰的杂质的含量低
酶免疫
• 检测方法 • 生化、常规免疫 • 荧光免疫、酶免疫 • 放射免疫、发光免疫 • PCR
检测范围 mg~μg（10-3 ~10-6 g） μg~ng（10-6 ~10-9 g） ng~pg（10-9 ~10-12 g） pg~fg（10-12 ~10-15 g）
3
一、放射免疫分析技术（Radioimmunoassay， RIA）
（4）添加剂的问题
• a. 防腐剂：低浓度 NaN3 对分析的影响小 • b. 抗凝剂：EDTA、肝素对分析无影响 • c. 抑肽酶：对一般分析无影响
12
6. 放射免疫分析的数据处理
• （1）数据处理的基本步骤 • a. 作图法 • b. 数学模型法 • （2）几种数学模型 • a. 一般多项式函数：普适性差，现基本不用 • b. 直线法：logit-lg 转换 • c. 四参数 Logistic 模型：目前常用
•
特异性高：与待测抗原的结合力高，而与待测抗原类似物的
结合能力（交叉反应）低
•
滴度（效价）高：指结合 50% 标记抗原时抗体的稀释度高
•
稳定性好：能长期保存，化学性质、效价稳定
• b. 抗体的制备
•
选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊
•
应用佐剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊毛脂、石蜡油 +
卡介苗）
•
选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股沟、腋窝、脊
柱两侧皮内多点）、间隔时间（加强）与次数
8
c. 抗体的纯化
• 去除杂抗体：用抗原吸附法
• 提取特异性 IgG：先用盐析法粗提，再用离子交换层析或亲和
层析纯化
• d. 抗体的鉴定
•
鉴定内容：效价、亲和力、特异性
•
鉴定方法：效价（琼脂单扩）、特异性（琼脂双扩）、RIA
• e. 单克隆抗体的使用：
•
用于 IRMA 或 RIA，特异性高
•
不一定优于传统的多克隆抗体
9
5. 竞争性放射免疫分析法的建立
• （1）反应方式 • a. 平衡法：标记抗原与待测抗原、特异性抗体同时加入温育 • b. 顺序法：先加入待测抗原、特异性抗体温育一段时间后再加入
标记抗原。可提高反应灵敏度
• c. STAT 法：反应未达平衡时即测定，较难控制反应条件 • （2）反应体系 • a. 缓冲液：常用 0.05~0.1 mol/L pH 7.4~7.5 磷酸或 Tris-HCl 缓冲
放射免疫分析技术
（Radioimmunoassay，RIA）
1
核医学
• 治疗：肿瘤、甲亢等
• 诊断 •
•
体内——PET、SPECT、 放射免疫成像等
体外——放射免疫分析（RIA）
2
标记免疫分析技术
•
用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的
分析方法
• 特点：敏感性高，反应时间短，可用仪器检测结果
• 三大标记免疫分析技术：放射免疫、荧光免疫、
•
含量准确
•
注意不变质与降解：在运输、保存时尤应注意；注意有效期
• c. 种类：国际标准、国家标准、企业标准
5
（2）标记物
• a. 对标记物的要求
•
比活度高：即单位物质的放射性强度高
•
生物活性及免疫活性与标记前改变小
•
放射化学纯度高：应 > 95%
•
稳定性好：标记的同位素不易脱落
6
b. 标记方法：