免疫检测法ppt课件

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• 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。每个 • • •
分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲 密结合。 生物素（biotin）又称维生素H，存在于蛋黄中。 可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子 形成生物素化的产物。 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但 特异性强，亲和力大，形成一种极为稳定的复 合体。 把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大 21 大提高ELISA的敏感度。
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• 待测抗原须有两个可以与抗体结合的部位，其
一端与包被于固相载体上的抗体结合，另一端 与酶标记的特异性抗体结合。 • 此法适用于检验各种二价或二价以上的大分子 抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。 不能用于分子量小于5000的半抗原或小分子单 价抗原的测定。
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• 反应模式与双抗体夹心法类似。 • 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，
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• ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有3种必要的材料： • 1.固相的抗原或抗体 • 2.酶标记的抗原或抗体 • 3.酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性 状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类 型的检测方法。 • 4.相应的检测仪器.
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1。夹心法 双抗体夹心法测抗原（常用） 双抗原夹心法测抗体 2。间接法测抗体（常用） 3。竞争法 竞争法测抗原 竞争法测抗体 4。捕获包被法测抗体 5。亲和素-生物素 ELISA法
意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。 若抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影 响包被效果。
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（1）将特异抗体与固相ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ体连接，形成固相抗 体。洗涤。 （2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的 混合溶液，使之与固相抗体反应，孵育洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗 原最多，故颜色最深。待测管颜色越淡，表示 标本中抗原含量越多。参考管颜色深度与待测 管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。
• 先将所有样品IgM（包括特异性IgM和非特
异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再 测定特异性IgM。
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（1）将抗IgM抗体连接在固相载体上，形成固 相抗IgM，洗涤。 （2）加入稀释的待测标本：孵育后样品中的 IgM抗体被固相抗体捕获，洗涤。 （3）加入特异性抗原试剂：其仅与固相上的特 异性IgM结合，洗涤。 （4）加入针对抗原的酶标抗体：使之与结合在 固相上的抗原反应结合，洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示标本 中存在特异性IgM抗体，是为阳性反应。
以检测相应的抗体。 • 此法中受检标本不需稀释，可直接用于测 定。 • 乙肝标志物中HBsAb的检测常采用本法。 关键在于根据抗原结构的不同制备酶标抗 原。
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• 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染
病的诊断。
• 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同
一酶标抗体检测相应抗体。
• 间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注
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◆如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与
固相抗体结合。
◆如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样
的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标 抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固 相载体的结合量减少。 固相抗体的结合最充分。
◆参考管中只加酶标抗原，孵育后，酶标抗原与
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• 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不
适用于
优点
注意
特异性高 不能检测小分子抗原及半抗原 双抗体夹心法测 是检测抗原最 3. 与固相抗原的竞争结合 抗原 常用的方法， 适用于检验各 取稀释板中预孵育的抗原抗体混合液 100μl，加入 种蛋白质等大 酶标板的抗原孔中，放入 37℃恒温培养箱中60 min。洗 分子抗原
易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测 特异性抗体。
• 标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与
固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合 在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应 呈色浅于阴性反应。
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• 样品中针对某些抗原的特异性IgM常和特异
性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测 定。因此测定IgM抗本多用捕获法。
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50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射性免疫 （RIA）分析技术之后，70年代初又建立了用酶来标记 抗原或抗体的分析技术 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体 液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附 测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 。它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶 技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展 起来的一种免疫测定技术 。
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• 免疫酶技术(enzyme immunoassay)：
是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的 催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。 就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应 抗原或抗体的一种免疫学标记技术。 常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶（AP）。
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• ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫 •
活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶 标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测 定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原 或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他 物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物 质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催 化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相 关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由 于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使 测定方法达到很高的敏感度。
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• 免疫标记技术（immunolabelling
technique）: 是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光 剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或 抗原进行的抗原抗体反应。 特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、 定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫 技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光 免疫测定