流式常用试剂配制

流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。

因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。

在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。

它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。

流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。

第1节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。

尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。

在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。

所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。

目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。

（一）酶消化法1 作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。

酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。

常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。

胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。

流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。

孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。

本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。

虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。

但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。

所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。

另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。

2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。

流式细胞术实验方法PI 染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。

3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。

4、离心，弃上清液。

5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。

6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。

7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。

8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。

9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。

GFP PI染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。

3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。

以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9）细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。

3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。

用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。

4、离心弃上清液。

5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。

6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。

细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。

离心，弃上清。

4、 PBS 1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。

流式常用试剂配制精选文档TTMS system office room 【TTMS16H-TTMS2A-TTMS8Q8-一、流式细胞术常用试剂1、10％NaN3：将10gNaN3溶解于100ml蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。

2、3％BSA/PBS：100ml PBS中加入3g BSA，使之溶解，再加入 10％的NaN3。

3、500mmol/L EDTA：将186g EDTA?Na2?2H2O溶解于400ml蒸馏水中，用NaOH将PH调至，补充蒸馏水至500ml，分装，高压灭菌，室温保存。

4、4％多聚甲醛：在磁力搅拌下，将4g多聚甲醛溶于100ml PBS，加入数滴NaOH，在通风柜中于60度加热，使其溶解，调整PH至，使用前新鲜配制。

5、消化液：％胰蛋白酶（用培养液或PBS配制）或％胰蛋白酶与％ EDTA的混合液。

6、红细胞裂解液：NH4Cl ，KHCO3 ，EDTA?2Na ，溶于100ml水中，调PH 至，补充蒸馏水至500ml，4度储存，使用时需恢复至室温。

7、流式细胞抗体稀释剂：L PBS液（PH ）＋1％BSA＋％Na2N3。

8、常用细胞破膜剂：PBS液（PH ）＋1％FBS（或BSA）＋％NaN3＋％saponin（Sigma的效果不错）。

9、流式细胞染色洗涤液：含2％的BSA、％NaN3的PBS（PH ）。

10、PI染液（保存液，10×，用于细胞周期和凋亡检测）：10mg PI溶于10ml PBS，加入2mg无DNA酶的RNA酶，4度保存备用。

应用时，10倍稀释，每管加～ PI染液。

11、Hanks液的配制（BSS，主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液，不能单独作为细胞、组织培养液）原液ANaCl 160gMgSO4?7H2O 2gKCl 8gMgCl?6H2O 2gCaCl2溶于1000ml双蒸水原液B1）Na2HPO4?12H2OKH2PO4葡萄糖溶于800ml双蒸水2）％酚红溶液：取酚红置玻璃研钵中，逐滴加入 NaOH并研磨，直至完全溶解，约加入 NaOH 10ml。

预实验：流式细胞仪分别检测小鼠外周血IFN-γ和IL-41.RPMI 1640培养液2.佛波酯PMA、离子霉素Ionomycin、莫能菌素Monensin3.配肝素钠4.配PBS5.固定/透化剂（棕色瓶）6.BD Perm/washTMBuffer（1×）7.PE anti-mouse IFN-γ（0.2mg/ml）8.PE/Cy7 anti-mouse Il-4（0.2mg/mL）9. FITC anti-mouse CD4（0.5mg/mL）10.流式管+EP管11.红细胞裂解液（1×）12.染色缓冲液1、激活剂PMA（引起T细胞的活化）储存：1mg PMA+10ml DMSO配制成0.1mg/ml，分装20ul/管，－20度。

勿反复融冻。

实验1：用无菌、无叠氮钠PBS 1：100稀释储存液，终浓度为20ng/ml。

实验2：无菌1640稀释成1:100的工作液，500ul全血+12.5ul工作液，终浓度为25ng/ml。

2、激活剂离子霉素Ionomycin（协同活化T细胞）储存1：1mg+2ml 乙醇配制成0.5mg/ml的储存液，－20度。

实验1：用无菌、无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液，终浓度为1ug/ml。

储存2：1mg+2ml DMSO配制成0.5mg/ml的储存液，－20度。

实验2：用无菌1640 液1：10成工作液，500ul全血+10ul工作液，终浓度为1ug/ml。

, 3、阻断剂莫能菌素（阻断细胞因子分泌至胞外）储存1：用DMSO配制成浓度为1mg/ml的储存液，4℃储存至少4个月实验1：用无菌、无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液，终浓度为2umol/L。

储存2：50mg+1ml甲醇配成50mg/mlrrr实验2：无菌1640 1:500稀释成0.1mg/ml工作液，500ul全血+8.5ul工作液，终浓度1.4 ug/ml。

流式细胞仪检测小鼠外周血CD4+1）红细胞裂解液使用前放置室温3）取抗凝血100μL加入到标记好的流式管内，加入2μL FITC Rat Anti-Mouse CD4（0.5mg/mL）4）避光放置30min5）加入红细胞裂解液2mL，轻轻吹打混匀，室温避光反应15min，以1500rpm离心5min，弃上清。

流式细胞仪检测常用试剂配制1．氯化铵溶血剂(Ammonium chloride lysing solution,)贮存液(10×)：80.2g NH4Cl (1.5M)8.4g NaHCO3(100mM)3.7g EDTA Na2(10mM)蒸馏水900 ml调节pH至7.4 (用1N HCl 或NaOH)加蒸馏水至1升4℃保存6个月以内工作液(1×)：蒸馏水1:9稀释, 新鲜配制, 冷藏保存注: 1) 贮存液不可小于10×, 否则会形成碳酸铵而失效2) NaHCO3可由10g KHCO3替代, EDTA Na2可由3.66g EDTA Na4(8.2mM)替代3) 有些科研工作者习惯采用1/10浓度的EDTA, 即 1mM EDTA Na2或0.32mM EDTA Na42．PBS(phosphate-buffered saline, 磷酸缓冲液)配制0.23 g NaH2PO4(无水; 1.9 mM)1.15 g Na2HPO4(无水; 8.1 mM)9.00 g NaCl (154 mM)加蒸馏水至 900 ml若需要, 用1M NaOH或1M HCl调节pH至7.2~7.4过滤除菌, 4℃保存注: 1) 不调pH值, pH通常约为7.32) 有些实验室将PBS配成 10×浓缩液, 用时稀释3．1% 多聚甲醛(paraformaldehyde)固定液配制0. 5g 多聚甲醛加至45ml蒸馏水中, 加4ml 10N的NaOH, 加温至65℃. 待粉末完全溶解(通常在30分钟以内)后, 加5ml10× PBS, 调节pH值至7.4, 0.2mm滤膜过滤除去未溶颗粒.注: 4℃可保存2周4．用氯化铵溶血剂的溶血方法1)100ml 全血加2mL氯化铵溶血剂, 混匀2) 避光孵育10~15分钟3) 离心, 去上清, PBS洗2次4) 抗体染色后, PBS洗5) 1ml 1%多聚甲醛固定, 2℃-直至上机检测5．血小板活化检测1. 先固定后染色1) 将100ml全血加入1ml 1% 冷(2℃-8℃) 多聚甲醛中(100ml全血至少可做20tests)2) 2℃-8℃固定30分钟. (固定的血小板可保存5天)3) 抗体染色前, 1200g室温离心5分钟4) 去上清, PBS洗1次, 1ml PBS重悬5) 取50ml重悬液, 加适当抗体, 避光孵育15-20分钟6) 加1ml 1% 冷(2℃-8℃) 多聚甲醛, 2oC-8oC避光30分钟, 但不可超过24小时2. 先染色后固定1) 5ml全血加入适当抗体, 避光孵育15-20分钟2) 加1ml 1% 冷(2℃-8℃) 多聚甲醛, 2℃-8℃避光30分钟, 但不可超过24小时注: 1) 抗凝剂可选用EDTA或柠檬酸钠, 但不能用肝素, 因肝素对血小板有刺激活化的作用2) 染色或固定应在采血后10分钟内进行3) 先固定后染色可降低血小板的自发活化, 避免标本处理过程中的人为活化, 然而有些血小板活化抗原, 如PAC-1, CD62p等在固定剂的作用下会失活,造成表达率的降低, 因此需要先染色再固定4) 1987年 Shattil SJ等的经典方法：¨ 采血时掌心朝上，轻扎或不扎止血带，肘前静脉采血。

附录一实验室常用试剂、缓冲液的配制方法(一) 1 M Tris-HCl(1 L)1.称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中2.加入约800 mL的去离子水，充分搅拌溶解；3.按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值；PH值浓HCl7.4 约70 mL7.6 约60 mL8.0 约42 mL4.将溶液定容至1 L；5.高温高压灭菌后，室温保存；注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1°C，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

(二)0.5 M EDTA(1 L)1.称取186.1 g Na2EDTA·2H2O，置于1 L烧杯中；2.加入约800 mL的去离子水，充分搅拌；3.用NaOH调节pH值至8.0(约20 g NaOH)；注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解；4.加去离子水将溶液定容至1 L；5.适量分成小份后，高温高压灭菌；6.室温保存。

(三)50×TAE Buffer (pH8.5)(1 L)1.称量下列试剂，置于1 L烧杯中；Tris 242 gNa2EDTA.2H2O 37.2 g2. 向烧杯中加入约800 mL的去离子水，充分搅拌溶解；3. 加入57.1 mL的醋酸，充分搅拌；4. 加去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存。

(四)10× TBE Buffer (pH8.3)(1 L)1.称量下列试剂，置于1 L烧杯中；Tris 108 gNa2EDTA.2H2O 7.44 g硼酸55 g2.向烧杯中加入约800 mL的去离子水，充分搅拌溶解；3.去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存。

(五)40%丙烯酰胺(1 L)1.称量下列试剂，置于2 L烧杯中；丙烯酰胺Alrylamatide 380 g甲叉丙烯酰胺Bis-Alrylamatide 20 g2.向烧杯中加入约400 mL的去离子水，充分搅拌溶解；3.去离子水将溶液定容至1 L；4.37°C过夜，充分溶解。

一、流式细胞术常用试剂1、10％NaN3：将10gNaN3溶解于100ml蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。

2、3％BSA/PBS：100ml PBS中加入3g BSA，使之溶解，再加入0.2ml 10％的NaN3。

3、500mmol/L EDTA：将186g EDTA?Na2?2H2O溶解于400ml蒸馏水中，用NaOH将PH调至8.0，补充蒸馏水至500ml，分装，高压灭菌，室温保存。

4、4％多聚甲醛：在磁力搅拌下，将4g多聚甲醛溶于100ml PBS，加入数滴NaOH，在通风柜中于60度加热，使其溶解，调整PH至7.4，使用前新鲜配制。

5、消化液：0.25％胰蛋白酶（用培养液或PBS配制）或0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA的混合液。

6、红细胞裂解液：NH4Cl 4.16g，KHCO3 0.5g，EDTA?2Na 0.02g，溶于100ml水中，调PH 至7.2，补充蒸馏水至500ml，4度储存，使用时需恢复至室温。

7、流式细胞抗体稀释剂：0.1mmol/L PBS液（PH 7.4）＋1％BSA＋0.1％Na2N3。

8、常用细胞破膜剂：PBS液（PH 7.4）＋1％FBS（或BSA）＋0.1％NaN3＋0.1％saponin（Sigma 的效果不错）。

9、流式细胞染色洗涤液：含2％的BSA、0.1％NaN3的PBS（PH 7.4）。

10、PI染液（保存液，10×，用于细胞周期和凋亡检测）：10mg PI溶于10ml PBS，加入2mg 无DNA酶的RNA酶，4度保存备用。

应用时，10倍稀释，每管加0.3ml～0.5ml PI染液。

11、Hanks液的配制（BSS，主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液，不能单独作为细胞、组织培养液）原液ANaCl 160gMgSO4?7H2O 2gKCl 8gMgCl?6H2O 2gCaCl2 2.8g溶于1000ml双蒸水原液B1）Na2HPO4?12H2O 3.04gKH2PO4 1.2g葡萄糖20.0g溶于800ml双蒸水2）0.4％酚红溶液：取酚红0.4g置玻璃研钵中，逐滴加入0.1N NaOH并研磨，直至完全溶解，约加入0.1N NaOH 10ml。

流式细胞术的样品制备节概述待测标本的制备是流式细胞术分析的关键，本节分别直接免疫荧光标记、间接免疫荧光标记、微量全血法免疫荧光标记、双标记、培养细胞DNA荧光标记与细胞凋亡检测样品的制备。

知识点导航1.直接免疫荧光标记的样品制备用标有荧光素的特异抗体对细胞进行直接染色，然后用流式细胞仪检测，阳性者即表示有相应抗原存在。

实验步骤如下：(1)每份取100 μl单细胞悬液(细胞密度约1×106个细胞)。

(2)一份加入相应量的异硫氰酸荧光素或者藻红蛋白标记的特异性荧光直标单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗，作为阴性参照样品。

(3)室温下避光反应一定时间(时间长短根据试剂说明书要求进行)，通常在室温下反应15～30min 即可。

(4)加入500 μl磷酸缓冲液重悬成单细胞悬液即可上机检测。

2.间接免疫荧光标记的样品制备(1)取1×106个细胞/100μl，先加入一抗混匀，置室温下避光反应30 min。

(2)用PBS洗涤细胞2次，离心沉淀弃掉上清液(离心转数通常为800～1000 r/min，5 min)。

(3)用100 μl PBS重悬细胞，再加入FITC或者PE标记荧光二抗(用量均按说明书要求加入)混匀，室温下反应30 min。

(4)用PBS再洗涤细胞2次，加入500 μl PBS重悬成单细胞悬液，上机检测。

注意：以上两种染色方法的抗体加入量与反应时间，没有非常具体的规定，通常应根据试剂使用说明书的要求进行。

若说明书上未说明，应先进行预实验，掌握好剂量与最佳反应时间后，再进行流式样品的制备。

制备好的样品，若不能及时上机检测，用1％～4％的多聚甲醛固定，4℃下可储存5d。

3.微量全血法免疫荧光标记的样品制备目前制备全血细胞样品的方法很多，且很成熟，常用的方法是用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，然后进行特异性荧光染色，其染色方法与前面介绍的方法相同。

下面要紧介绍与流式细胞仪配套的Q PREP(免疫学样品处理器)进行快速制备微量全血样品的方法：(1)微量全血直接荧光染色法：具体方法为①取肝素或者EDTA抗凝全血100 μl置12 mm×75 mm 专用塑料试管中；②每份加入20 μl特异性荧光单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗作阴性参照，室温下避光染色15 min；③置 Q PREP 仪上溶解红细胞、稳固与固定白细胞，静置5 min；④上流式细胞仪检测。