【高中生物】珙桐的传粉生物学研究

珙桐繁殖方法的分析与研究作者：陈刚来源：《中国新技术新产品》2015年第22期摘要：珙桐是我国一级重点保护野生植物之一，是我国特有的孑遗植物类型，具有非常高的观赏价值、生态价值以及经济价值，然而值得注意的是，珙桐苗木在培养繁育的过程中却存在着诸多影响因素，对珙桐的大规模繁育生长造成了一定的影响。

本文将针对当前珙桐繁殖的方法及其影响因素进行具体的分析和阐述，主要包括珙桐种子在生长繁育过程中的休眠影响因素以及具体的繁殖嫁接方法。

关键词：珙桐；繁殖方法；休眠中图分类号：S723.1 文献标识码：A珙桐是一种非常珍贵的落叶乔木类型，其生长繁育至今已经有1000万年的历史，是新生代第三纪就开始生长繁育的一种植物类型，当前珙桐在全世界只存在于我国一些南方地区，例如贵州纳雍县被称为“中国珙桐”之乡，分布了近百万株光叶珙桐，是当前世界上光叶珙桐自然分布面积最大、资源储量最丰富的地区。

光叶珙桐是珙桐科目的一种，果实为长卵圆形核果，紫绿色同时黄色斑点，是我国珍惜濒危物种之一，是中国国家一级重点保护野生植物，是及其优质的木材原料。

珙桐被称为”植物界的活化石“，也被称为”中国的鸽子树“、”鸽子花树“，是享誉全世界的一种观赏性植物。

当前我国珙桐数量极为稀少，已经成为我国一级保护珍稀频危植物，研究珙桐的繁殖方法对于提高珙桐的繁育生长率，发挥珙桐的观赏价值有着非常重要的意义。

1 珙桐种子休眠的影响因素珙桐种子的休眠事实上指的就是珙桐种子在繁殖生长的条件下，不能及时的、正常的发芽的现象，而珙桐种子的休眠可以分为内源休眠、外源休眠以及综合休眠三种现象，在珙桐苗木的自然生长状态中，珙桐种子在果实成熟以后，需要经历至少2年以上、4年以内的休眠期才能正常成熟，发育成为珙桐幼苗，而同时珙桐种子能否正常发育成为珙桐幼苗，还需要经过严苛的环境试验和催化，依靠珙桐自身的有性繁殖方法，要满足珙桐苗木的大规模培育和繁殖简直是一件不可能的事情。

珙桐结出的果实是核果果实，同时珙桐结果繁殖的过程中存在着明显的大小年现象，果实生长初期还存在着严重的落果现象，部分珙桐树木结果的过程中甚至存在着有千花一果的艰难结果现象，对珙桐苗木的大面积繁殖培育造成了非常不利的影响。

珙桐光合速率日变化的研究摘要:为研究珙桐光合特性的日变化规律及其影响因子，为珙桐的光合生理研究提供基础数据，也可为珙桐的人工栽培提供理论支持，利用Li-6400光合作用系统对珙桐光合速率(Pn)日变化规律进行研究。

结果表明，珙桐叶片的日变化为双峰曲线，其净光合速率与与光合有效辐射关系密切，而与大气温度、空气相对湿度相关性不大。

关键词: 珙桐; 日变化; 净光合速率。

Studies on the Diurnal V ariation of Photosynthesis Rate of Davidiainvolucrata BaillAbstract: The research amied to study the diurnal variation laws of photosynthesis rate of Davidia involucrata Baill and its influencing factors, so as to provide the basic data for the photosynthetic physiology research of Davidia involucrata Baill and theoretical support for the artificial cultivation of Davidia involucrata Baill The diurnal variation laws of photosynthesis rate ( Pn) of Davidia involucrata Baill were studied by Li-6400 portable photosynthesis system .The results showed that the curve of diurnal variation of net photosynthesis rate of Davidia involucrata Baill demonstrated two peaks . The net photosynthesis ratewas closely related with PAR and it had little correlation with airtemperature,air relative humidity.Key words: Davidia involucrata Baill, Diurnal variation, Net photosynthesis rate珙桐(Davidia involucrata Baill)又名水梨子、鸽子树，是单科单属种特有植物，为中国一级保护物种。

2024 年 3月第 61 卷第 2 期Mar. 2024Vol. 61 No. 2四川大学学报（自然科学版）Journal of Sichuan University （Natural Science Edition）珙桐AP2/ERF家族相关基因的克隆及功能鉴定曾沥，孙曼丽，刘晋芸，胡小盼，魏炜（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都 610065）摘要: 为探究AP2/ERF类转录因子在珙桐开花调控及花器官发育中的作用，本研究通过从实验室珙桐不同发育时期苞片和叶片的转录组数据中筛选出调控珙桐苞片发育相关AP2/ERF家族基因DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1，经过生物信息学分析、基因克隆及功能鉴定初步研究了目的基因在珙桐苞片发育过程中的调控机制.亚细胞定位实验显示DiAP2-1主要定位于细胞质，DiDREB-1和DiRAV-1主要定位于细胞核.对目的基因在珙桐中的表达模式分析发现DiAP2-1和DiRAV-1在苞片发育过程中表达量逐渐降低，DiDREB-1只在苞片第三时期高表达，推测DiDREB-1、DiRAV-1属于A类基因，DiAP2-1属于B类基因.表型实验显示DiDREB-1和DiRAV-1转基因拟南芥株系较野生型表现为明显的早花，DiAP2-1同源基因对应的拟南芥突变体与同一时期野生型拟南芥对比表现为花瓣减少且萼片大，角果呈短粗状且败育.对关键开花调控基因表达模式分析发现DiDREB-1和DiRAV-1异源表达后使其他促花因子表达量上调进而使拟南芥花期提前.以上结果表明，AP2/ERF类转录因子DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1在珙桐苞片及花器官发育和珙桐开花调控中发挥了重要作用.关键词: 珙桐；花器官；苞片； AP2/ERF中图分类号: Q37 文献标志码: A DOI:10.19907/j.0490-6756.2024.026002Cloning and functional identification of AP2/ERF family-relatedgenes in Davidia involucrata Baill.ZENG Li， SUN Man-Li， LIU Jin-Yun， HU Xiao-Pan， WEI Wei（Key Laboratory of Bio-Resource and Eco-Environment of Ministry of Education， College of Life Sciences，Sichuan University， Chengdu 610065， China）Abstract: To investigate the role of AP2/ERF transcription factors in the regulation of Dove tree flowering and floral organ development， this study was conducted to screen the AP2/ERF family genes DiAP2-1， Di⁃DREB-1and DiRAV-1from the transcriptomic data of dove bracts and leaves at different developmental stages in the laboratory.A preliminary study of the regulatory mechanisms of these genes in the development of dove bracts was conducted by bioinformatics analysis， gene cloning and functional characterization.Subcel‑lular localization experiments showed that DiDREB-1and DiRAV-1 were expressed in the nucleus， except for DiAP2-1， which was mainly expressed in the cytoplasm.Analysis of the expression pattern of the target genes in dove showed that the expression levels of DiAP2-1 and DiRAV-1 gradually decreased during bract development，while DiDREB-1was only highly expressed during the third bract period，presumably Di⁃DREB-1 and DiRAV-1belonged to class A genes and DiAP2-1 belonged to class B genes.Phenotypic ex‑收稿日期: 2023-03-24基金项目: 四川省科技厅育种攻关项目(2021YJ0296)作者简介: 曾沥（1997-），男，四川南充人，硕士研究生，主要从事珙桐基因的功能研究.E-mail: 310953866@通讯作者: 魏炜.E-mail: weiwscu@第 61 卷四川大学学报（自然科学版）第 2 期periments showed that DiDREB-1 and DiRAV-1 transgenic Arabidopsis strains exhibited early flowering compared to the wild type， and the Arabidopsis mutant corresponding to the DiAP2-1 homologue showed re‑duced petals and larger sepals，and short，stubby and failure to breed hornbeam compared to the wild type Arabidopsis at the same time.These results suggest that the AP2/ERF-like transcription factors DiAP2-1，DiDREB-1 and DiRAV-1 play key roles in the development of dove bracts and flowering organs and in the regulation of Dove tree flowering.Keywords: Dove tree； Flowering organ； Bract； AP2/ERF1　引言珙桐（Davidia involucrata Baill.）第三纪古热带孑遗树种，为中国特有的单属植物［1］，1999年被列为国家首批一级重点保护野生植物，有植物大熊猫和活化石之称［2， 3］.而珙桐独特的形似飞翔鸽子的一对苞片（实质是一种变态叶）是珙桐最引人入胜的地方［4］，也是其成为重要观赏植株并得名鸽子树的原因.花器官是植物生长繁殖过程中重要的组织器官之一，对植物种群规模的维持及扩大尤为重要［5］.花器官的发育可大致分为以下几个阶段：首先是开花诱导阶段，它是花发育过程中尤为重要的关键步骤，决定着植物是否开花以及何时开花；其次是花的发端阶段，植物通过整合不同途径通路信号激活花分生组织特征基因，进而实现对花器官特征基因的激活；最后是花器官发育阶段，主要由部分花器官特征基因对负责花器官形态发育的部分特征基因进行激活，进而实现花器官正常发育过程［6， 7］.植物AP2/ERF是一个具有众多成员的庞大转录因子基因家族，此类转录因子都含此家族特殊的结构域，如AP2结构域或B3结构域.根据结构域的数量和识别序列的不同可以将其分为5个亚家族，存在于几乎所有的植物中且参与多种生物学过程［8］.已有研究表明AP2类基因在拟南芥花器官特性的形成和花同源异型基因表达的调控中发挥着核心作用，并发现其在花的四种器官萼片、花瓣、雄蕊和心皮中都有表达［9］.也有研究表明，属于拟南芥RAV亚家族成员的TEM1和TEM2受多个开花通路的基因调控［10］.AP2/ERF 家族不仅参与调节植物生长发育尤其是花器官的发育，而且在响应外界胁迫中也发挥重要作用.现阶段AP2/ERF转录因子作为重要的抗性调控基因在基因工程或作物育种中越来越受到重视［11］，也为将来创造出兼具高产、抗病及富含营养等优良性状农作物品种提供资料［12］.在对植物开花途径的研究中发现，植物正常开花主要受到以下开花诱导途径的影响，其中主要包括光周期途径、春化途径、赤霉素途径和自主促进途径［13］.各种开花诱导途径在独立发挥作用的同时，也共同构成了一个复杂而精密的调控网络，共同调控着整个开花过程.而花器官的发育也有着极为复杂的调控过程，在对花器官发育调控网络研究过程中逐步确立了花发育“ABCDE”模型［14-16］.并在该模型基础上又提出四因子发育模型［17］.但是随着对植物花器官发育研究的深入，发现除花发育“ABCDE”模型包含的相关功能基因外，还存在很多模型外基因在花发育过程中也发挥着重要作用，对花器官形态构建有着重要影响.例如，在矮牵牛中AGL6亚家族基因PhAGL6具有着与E类功能基因类似的功能，对矮牵牛花药及花瓣的发育产生影响，与其内部E类功能基因存在部分程度上的功能冗余.这类基因不仅存在于MADS-box基因家族中，其他基因家族中的部分基因同样在植物花发育过程中发挥着独特作用，并参与到植物花器官正常发育过程当中［18］.本研究在珙桐叶片以及苞片不同发育时期的转录组数据中筛选出部分在珙桐叶片和苞片差异表达的AP2/ERF家族基因，进行生物信息学分析、相关基因的克隆、鉴定、亚细胞定位及目的基因在珙桐中的时空表达模式分析，结合目的基因异源表达进行拟南芥遗传转化，对筛选出的基因的功能进行初步鉴定及探究.初步阐明此类转录因子在珙桐花发育过程中的作用，以期为进一步解析珙桐苞片发育的分子调控机制奠定基础.2　材料与方法2.1　材料在四川省都江堰市虹口乡龙溪虹口国家级自然保护区内采集野生珙桐不同发育时期苞片、叶片、叶芽、根、枝条等组织；本氏烟草（Nicotiana第 2 期曾沥，等：珙桐AP2/ERF家族相关基因的克隆及功能鉴定第 61 卷benthamiana）种子由本课题组保存并提供，于课题组现有温室内种植培养，培养条件：室温23 ℃，空气湿度55%，光周期为光照16 h黑暗8 h交替，光照强度为120 μmol∙m-2∙s-1；哥伦比亚型拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子由本课题组保存并提供，突变体（拟南芥突变体（CS148、SALK_ 083090、CS313884）采购于ABRC；过表达拟南芥植株：构建过表达重组载体，通过农杆菌介导法获得过表达目的基因拟南芥植株，所用转基因植株均为筛选至 T3 代的纯合系.2.2　方法2.2.1　目的基因的确定及克隆　利用实验室自建的珙桐全转录组数据，通过结构域分析、表达模式分析及差异聚类分析等，最终从中筛选出了可能与珙桐苞片发育相关的分别来自三个不同亚家族的三个基因.以珙桐总cDNA为模板通过常规PCR扩增获得DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1的目的基因片段.2.2.2　载体构建　为构建亚细胞定位载体，将目的基因与pBI221-EGFP表达载体构建融合载体；为构建过表达载体，将目的基因与pBI121-EGFP 表达载体构建融合载体.2.2.3　目的基因在珙桐中的时空表达分析　以珙桐β-Diactin为内参基因，采用qRT-PCR实验方法，对DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1在珙桐不同发育时期不同组织内的表达情况进行检测，数据结果由三次独立重复实验提供，使用的引物见表1.2.2.4　亚细胞定位分析　将构建的亚细胞定位载体通过PEG-Calcium介导转入烟草原生质体中表达，在正置荧光显微镜下观察DiAP2-1、Di⁃DREB-1和DiRAV-1的亚细胞定位.2.2.5　纯合转基因株系表型分析　将野生型、ap2突变体、DiAP2-1、DiDREB-1、DiRAV-1转基因株系（每个株系均种植10株）正常培养，对各拟南芥株系的表型进行观察，测定相关生理指标并统计相关数据.2.2.6　转基因植株中开花调控关键基因表达分析　为探究异源表达DiAP2‑1、DiDREB-1和DiRAV‑1是否影响到开花的关键基因表达量，我们挑选6个参与拟南芥开花调控的关键基因：AtSPL、AtAP1、AtAGL24、AtLFC、AtFT和AtLFY，利用qRT-PCR进行基因相对表达量检测，野生型作为对照组，β-actin为内参基因，使用的引物见表2.3　结果与分析3.1　目的基因的确定及克隆从自建的珙桐全转录组数据筛选出三个AP2/ERF家族目的基因，分别为AP2亚家族的CL18617.Contig3_All、DREB亚家族的CL16625. Contig4_All以及RAV亚家族的CL4058.Con‑tig1_All，并命名为DiAP2‑1、DiDREB‑1和Di⁃RAV‑1.PCR扩增获得目的基因片段与转录组数据比对见图 1.3.2　DiAP1、DiTFL1s在珙桐中的时空表达分析利用qRT-RCR技术，分析珙桐DiAP2‑1、Di⁃DREB‑1、DiRAV‑1三个基因在叶片苞片不同时期和不同组织中相对表达量，以叶片第一时期L1的表达量为对照，以珙桐β-actin为内参基因.表1　珙桐荧光定量所用引物Tab.1　Primer sequence used in qRT-PCR of D.involu⁃crata Baill.引物名称q-DiAP2-1q-DiDREB-1q-DiRAV-1 DiActin引物序列（5′→3′）F：GACATGGCAGCTATAGAGTACCR：GTCAACATTAGGGTTAGGGF：CGAGATAGTAGAGTTGCCGAGTCTGR：CTGCTCGAAATCGCACTCTCGGF：CCGGTTCAGATGGTTAGACR：GTTACAAAGCTCCAATGGCCF：GGTCGTACAACTGGTATTR：GAGCATAGCCTTCATAGAT表2　拟南芥荧光定量所用引物Tab.2　Primer sequence used in qRT-PCR of A.thaliana引物名称q-AtAP1q-AtAGL24q-AtLFCq-AtFTq-AtSPL-q-AtLFYβ-AtActin引物序列（5′→3′）F：AAGAGGATAGAGAACAAGR：AAGAATCAGTGGAGTATTF：ATGGCGAGAGAGAAGATAAGGR：CCTTCCCAATATGTCTCTCF：CGATAACCTGGTCAAGATR：CTATCCACAAGTTCAAGTAGF：CTACAACTGGAACAACCTTR：AACACGACACGATGAATTF：CCAATAATCGCTGTGACACR：AACCTTGGCTCCTCTGATF：TTATCTGTTCCACTTGTAR：TTTAGGCTTGTTTATGTAAF：CTAATCGTGAGAAGATGACTR：AAGAACAGCCTGAATAGC第 61 卷四川大学学报（自然科学版）第 2 期qRT -RCR 结果如图2，结果发现DiAP 2-1和DiRAV -1这两个基因荧光定量结果大概一致，都在叶片和苞片中表达模式差异大，在叶片三个发育时期先下降后升高，而苞片三个发育时期中则表达量逐渐降低，且苞片中的表达量相比叶片较低.DiDREB -1表达模式却不同，DiDREB -1主要在叶片第一时期高表达，在苞片第三时期高表达，DiDREB -1基因在珙桐叶片和苞片发育过程中表达模式也具有差异性.DiAP 2-1和DiDREB -1主要与苞片第二时期到第三时期发育或苞片由淡绿色转变为乳白色变化有关.在同一时期珙桐不同组织包括第三时期叶片、苞片、根、茎、雄蕊、雌蕊、萼片、芽八个组织中的表达模式分析.如图3可知，DiAP 2-1在苞片、雄雌蕊中表达较高，在根、茎和萼片中几乎不表达；DiDREB -1在雌蕊、萼片和芽中高表达，根、茎和雄蕊几乎不表达；DiRAV -1在萼片和芽中表达较高，只有茎和雄蕊几乎不表达.图1　珙桐目的基因克隆序列比对图Fig.1　Sequence alignment of D.involucrataBaill.图2　珙桐目的基因在叶片和苞片中不同时期的表达情况L1-L3分别指叶片第一时期至叶片第三时期；B1-B3分别指苞片第一时期至苞片第三时期Fig.2　Expression of genes in leaves and bracts of D.involucrata Baill.at different stagesL1-L3 refer to leaf first period to leaf third period ； B1-B3 refer to bract first period to bract third period第 2 期曾沥，等： 珙桐AP2/ERF 家族相关基因的克隆及功能鉴定第 61 卷3.3　亚细胞定位试验将表达载体（由已去除终止密码子的DiAP 2-1、DiDREB -1、DiRAV -1核苷酸序列与pBI 221-EGFP 载体共同构建）转化至当天制备的高质量烟草原生质体中，暗培养后的烟草原生质体通过正置荧光显微镜观察拍照，结果如图 4所示.烟草瞬时转化亚细胞定位实验结果发现，绿色荧光信号显示除了DiAP2-1主要在细胞质中表达以外，Di⁃DREB -1、DiRAV -1都在细胞核中表达.3.4　纯合转基因株系表型分析将野生型、ap 2突变体、DiAP 2-1、DiDREB -1和DiRAV -1转基因株系（每个株系均种植10株）正常培养，对各拟南芥株系的表型进行观察，测定相关生理指标并统计相关数据.对比同一时期的转基因植株、野生型与对应功能突变体的表型见图5和图6.结果表明：DiAP 2-1转基因植株和野生型比图3　珙桐目的基因在不同组织的表达情况L3指叶片第三时期；B3指苞片第三时期Fig.3　Expression of genes in different tissues of D.involucrate Baill at different stagesL3 refer to leaf third period ；B3 refer to bract third period图4　珙桐目标基因亚细胞定位结果GFP ，GFP 荧光；BF ，明场；Merged ，合并图像Fig.4　Subcellular localization of target genes of D.involucrata Baill.GFP ， GFP fluorescence ； BF ， bright -field ； Merged ， merged image第 61 卷四川大学学报（自然科学版）第 2 期较，不论在花期、株高还是微观的花器官中都无明显的区别，如图 6a.而AP2-1对应功能缺失突变体与野生型相比发现有明显的表型差异如图6a，具体表现为花期提前，花瓣减少且花瓣变小，萼片变大，花的形态发生在第1轮和第4轮受到影响，在第2轮没有器官形成，第3轮大部分空置，角果呈短粗状且败育如图6b.DiDREB-1和DiRAV-1两个基因的转基因植株开花时间明显早于野生型植株如图5，而后期株高无明显差异.DiDREB-1和DiRAV-1这两个基因对应的同源拟南芥突变体，只有后期表现为株高比野生型高，其他表型无明显区别如图6c和6d.莲座叶统计实验所用株系为WT、DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1异源表达纯合植株.当各株系拟南芥主花序约生长到4~5 cm时，统计拟南芥的莲座叶数目如图7，各株系均统计10株.WT植株开花时的莲座叶平均数为11.9；DiAP2-1异源表达株系开花时的莲座叶平均数为11.6；而DiDREB-1和DiRAV-1异源表达拟南芥株系开花时的莲座叶统计平均数为9.1和9.4，显著少于野生型植株，进一步表明在拟南芥中异源表达DiDREB-1和DiRAV-1可以使植株提前开花，而DiAP2-1异源表达植株与WT植株没有显著差异.图5　目的基因异源表达拟南芥植株早花现象Fig.5　Early flowering of A.thaliana plants with heterolo‑gous expression of target genes图6　突变体、野生型及转基因拟南芥表型Fig.6　Mutant，wild type and transgenic Arabidopsis phe‑notype图7　各拟南芥株系莲座叶数目“*”代表显著性差异（P<0.05），代表目的基因与野生型具有显著性差异Fig.7　The number of rosette leaves“*” represents significantly different（P<0.05）， represents thatthe target genes was significantly different from WT图8　转基因拟南芥中关键调控开花基因的表达情况“*”代表显著性差异（P<0.05），代表目的基因与野生型具有显著性差异Fig.8　Expression of key regulatory flowering genes intransgenic Arabidopsis thaliana“*” represents significantly different（P<0.05）， represents thatthe target genes was significantly different from WT第 2 期曾沥，等：珙桐AP2/ERF家族相关基因的克隆及功能鉴定第 61 卷3.5　转基因植株中开花调控关键基因表达分析转基因植株中开花调控关键基因表达分析实验结果发现每个株系中6个调控拟南芥开花关键基因的表达模式相似，如图8所示，除了AtAGL24这一个基因以外，其他促花因子的表达量相比野生型都上调.其中异源表达DiAP2-1后，拟南芥AtSPL基因表达水平显著上调并且表达量都高于其他株系，根据开花年龄途径预测该转基因植株表型为晚花，实际却和野生型无区别，所以推测异源AP2类基因可能引起了某一正调控途径使得拟南芥AtSPL基因的表达量上调而表现出晚花现象不明显.这也进一步证明了异源表达DiEDRB-1和DiRAV-1基因可能会影响其他促花因子的表达量上调使得拟南芥表现为花期提前.4　讨论珙桐作为第三纪孑遗植物，同时也是世界著名观赏植物，因其独特的花器官形态而闻名.对于这样一个古老的物种，研究其独特花器官的形成原因，及其花器官对物种生长繁殖的影响是非常有必要的.AP2/ERF家族转录因子可以广泛参与植物次生代谢、花器官发育、植物激素应答和胁迫响应等多种生命活动.对所筛选出的三个来自三个不同亚家族的基因：DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1.克隆后三个目的基因的序列与转录组数据序列比对正确.为了探究各个目的基因在细胞中的表达位置.为了探究DiAP2-1、DiDREB-1、DiRAV-1的蛋白在细胞中的亚细胞定位的情况，我们构建了pBI221-DiAP2/ERFs-EGFP表达载体，然后通过PEG-Calcium介导转入烟草原生质体中观察荧光.结果发现除了DiAP2-1的蛋白主要定位在细胞质以外，其余两个基因DiDREB-1、DiRAV-1均定位于细胞核，这与多数其他转录因子亚细胞定位研究中的结果一致［19］，另外此结果也表明了不是所有AP2/ERF转录因子家族都定位在细胞核，也有研究中发现拟南芥其他家族的某些转录因子定位于细胞质［20］.将可能参与珙桐苞片发育的三个目的基因DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1通过花序浸染法获取了拟南芥稳定转化植株.通过对这三个基因在珙桐中的表达模式分析，结合各目的基因的稳定转化植株、对应的功能缺失突变体和野生型植株三者进行表型对比观察，再结合表型现象分析异源表达目的基因对拟南芥调控开花关键基因表达量的变化，验证各目的基因的功能.结果表明：DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1三个基因在苞片和叶片中的时空表达和组织特异性表达的相关水平差异都很大；首先是组织特异性表达，在不同组织中，各目的基因主要在花器官中表达而根和茎等其他组织中几乎不表达；表型观察中发现异源表达DiDREB-1和DiRAV-1使拟南芥出现早花现像；对应功能缺失突变体表型观察发现拟南芥缺失AP2基因严重影响了花瓣、萼片以及角果的形态发育；转基因株系中拟南芥花发育相关调控基因的表达水平变化显示，异源表达DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1会引起一部分拟南芥促花因子的表达量上调，但在DiAP2-1异源表达植株中AtSPL的表达量显著上调.三个基因主要在花器官中表达，存在组织器官特异性，根据植物花发育ABCDE模型推测出DiDREB-1、DiRAV-1可能属于A类基因，DiAP2-1属于B类基因，因为植物花发育的ABCDE模型还不能解释所有种类植物的花发育类型，内容仍需进一步完善和不断修正，而且珙桐具有独特的花器官且无花瓣，所以本结果只是在原本植物花发育ABCDE模型基础上的一种推测，后续需要进一步证实.结合表型再通过对拟南芥其他已知关键调控基因表达模式的分析，发现DiDREB-1和DiRAV2-1这两个基因异源表达后确实使其他促花因子表达量有一定的上调进而使拟南芥花期提前.SPL和AP2基因都是参与植物花发育年龄途径的重要成员［21］，本来预测DiAP2-1的异源表达有一定程度的抑制开花［22］，但分析结果后推测可能存在某一正调控途径使得开花促进因子AtSPL表达量上调，最终表型和野生型拟南芥没有区别.研究表明在拟南芥过表达AP2亚家族的ANT和AIL6基因时，拟南芥花的发育受到严重影响，过表达植株的花丝和萼片相较于野生型明显膨大，深入研究发现ANT和AIL6基因可以参与调控生长素的运输［23］.在本章结果中也观察到AP2基因对应功能缺失突变体花瓣减少且花瓣变小，萼片变大，并结合表达模式分析DiAP2-1主要在珙桐花器官中表达且在苞片第二时期到第三时期发育过程中表达量差异最大，所以推测该基因在珙桐苞片发育过程中也有与ANT和AIL6基因类第 61 卷四川大学学报（自然科学版）第 2 期似的调控模式并参与珙桐的花期调控和苞片发育等.最近的研究表明异源表达非AP2/ERF家族基因，如异源表达文心兰OnGI基因促进拟南芥开花［24］，异源表达牡丹PsSPL基因通过促进LFY基因的表达使转基因拟南芥花期提前，且早期的根长和后期株高都有改变［25］.本研究中DiAP2-1转基因拟南芥中暂未观察到花器官的改变但能使AtSPL基因显著上调从而调控花期，这可能与异源表达的基因同源性等问题有关，后续还需要借助其他模式植物进一步探究.本研究发现异源表达珙桐DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1引起其他拟南芥关键调控开花基因表达的变化从而调控花期，结合珙桐中的表达模式分析等推测这三个基因都与珙桐苞片发育密切相关，后续还需要更深入的研究进一步证明或阐明在苞片发育中的具体途径.综上所述，本研究认为AP2/ERF基因家族的目的基因在珙桐开花时间调控、花器官的发育过程中具有重要作用，丰富了现有的关于珙桐花发育的理论知识，为未来珙桐的保护和研究提供了理论依据参考文献:［1］Tang X J.Characteristics and value of Dove trees ［J］.Southwest Horticult， 2002（3）： 54.［唐晓军.珙桐的特性与价值［J］.西南园艺， 2002（3）： 54.］［2］He J S， Lin J， Chen W L.The current status of endemic and endangered species Davidia involucrata and thepreserving strategies ［J］.Biodiv Sci， 1995（4）： 213.［贺金生，林洁，陈伟烈.我国珍稀特有植物珙桐的现状及其保护［J］.生物多样性， 1995（4）： 213.］［3］Yu Y T，Xu G B，Wang X P.Literature review of researches on Davidia involucrate Baill ［J］.Non-WoodForest Res， 2006（4）： 92.［禹玉婷，徐刚标，汪晓萍.珙桐研究进展［J］.经济林研究， 2006（4）： 92.］［4］Feng C M，Liu X，Yu Y，et al.Evolution of bract development and B-class MADS box gene expressionin petaloid bracts of Cornus s.l.（Cornaceae）［J］.NewPhytol， 2012， 196：631.［5］Causier B，Schwarz-Sommer Z，Davieb B.Floral or‑gan identity： 20 years of ABCs ［J］.Semin Cell DevBiol， 2010， 21： 73.［6］Shan H，Cheng J，Zhang R，et al.Developmental mechanisms involved in the diversification of flow‑ers ［J］.Nat Plants， 2019， 5： 917.［7］Komeda Y.Genetic regulation of time to flower inArabidopsis thaliana［J］.Annu Rev Plant Biol，2004， 55： 521.［8］Zhang J Y， Wang Q J， Guo Z R.Progresses on plant AP2/ERF transcription factors ［J］.Hereditas，2012，34：44.［张计育，王庆菊，郭忠仁.植物AP2/ERF类转录因子研究进展［J］.遗传， 2012，34： 44.］［9］Jofuku K D， Den Boer B G， Van Montagu M，et al.Control of Arabidopsis flower and seed developmentby the homeotic gene APETALA2 ［J］.Plant Cell，1994， 6： 1211.［10］Matias-Hernandez L， Aguilar-Jaramillo A E， Marin-Gonzalez E，et al.RAV genes：Regulation of floralinduction and beyond ［J］.Ann Bot-London，2014，114： 1459.［11］Gao C Y，Wu R，Yuan Y，et al.Plant AP2/ERF transcription factors and their role in abiotic stress re‑sponse ［J］.J Jianghan Univer（Nat Sci Ed），2017，45： 236.［高春艳，吴芮，袁玉，等.植物AP2/ERF转录因子及其在非生物胁迫应答中的作用［J］.江汉大学学报（自然科学版）， 2017， 45： 236.］［12］Zhang Q， Chen J， Li L，et al.Progress in the study of the AP2/ERF family of transcription factors inplants ［J］.aBiotech， 2018， 34： 1.［张麒，陈静，李俐，等.植物AP2/ERF转录因子家族的研究进展［J］.生物技术通报， 2018，34： 1.］［13］Xu H.Preliminary studies on the involvement of Ara‑bidopsis thaliana IQM3 in the regulation of photoperi‑odic flower formation ［D］.Guangzhou：GuangzhouUniversity， 2019.［徐浩.拟南芥IQM3参与光周期成花调控的初步研究［D］.广州：广州大学， 2019.］［14］Ji H，Zhu Y，Tian S，et al.Downregulation of leaf flavin content induces early flowering and photope‑riod gene expression in Arabidopsis［J］.BMC PlantBiol， 2014， 14： 237.［15］Rijpkema A S，Vandenbussche M，Koes R，et al.Variations on a theme： changes in the floral ABCs inangiosperms［J］.Semin Cell Dev Biol，2010，21： 100.［16］Soltis D E， Chanderbali A S， Kim S，et al.The ABC model and its applicability to basal angiosperms ［J］.Ann Bot， 2007， 100： 155.［17］Theissen G， Melzer R， RumUMPLER F.MADS-domain transcription factors and the floral quartet modelof flower development： linking plant development andevolution ［J］.Development， 2016， 143： 3259.［18］Qu G Z， Zheng T， Liu G，et al.Overexpression of a MADS⁃box gene from birch （Betula platyphylla）第 2 期曾沥，等：珙桐AP2/ERF家族相关基因的克隆及功能鉴定第 61 卷promotes flowering and enhances chloroplast develop‑ment in transgenic tobacco ［J］.PLoS One， 2013， 8：e63398.［19］Dai Y L.Cloning and functional study of AP2-like transcriptional regulators related to isoprene metabolicpathway in the Taxus chinensis （Pilger）Rehd ［D］.Shanghai： Fudan University， 2008.［戴怡龄.红豆杉中与异戊二烯代谢途径相关的AP2类转录调控因子的克隆与功能研究［D］.上海：复旦大学， 2008.］［20］Liang M，Li H，Zhou F，et al.Subcellular distribu‑tion of NTL transcription factors in Arabidopsis thali⁃ana［J］.Traffic， 2015， 16： 1062.［21］Yu S， Wang J W.Advances in miR156-mediated age pathways in higher plants ［J］.Sci Bull，2014，59：1398.［虞莎，王佳伟. miR156介导的高等植物年龄途径研究进展［J］.科学通报， 2014， 59： 1398.］［22］Jung J H， Seo P J， Kang S K，et al.miR172 signals are incorporated into the miR156 signaling pathwayat the SPL3/4/5 genes in Arabidopsis developmentaltransitions ［J］. Plant Mol Biol， 2011， 76： 35.［23］Krizek B.AINTEGUMENTA and AINTEGUME NTA-LIKE6 act redundantly to regulate Arabidopsisfloral growth and patterning ［J］.Plant Physiol，2009，150： 1916.［24］Fang N Y， Fan R H， Luo Y H，et al.The heterolo‑gous expression of OnGI in Arabidopsis thaliana topromote flowering ［J］.Acta Horticult Sini，2022，49：841.［方能炎，樊荣辉，罗远华，等.文心兰OnGI在拟南芥中异源表达促进开花［J］.园艺学报， 2022， 49： 841.］［25］Wang Y Y， Guan S M， Gai S P，et al.Heterologous expression of peony PsSPL gene affects nutrient growthand flowering time in Arabidopsis thaliana［J］. J PlantPhysiol， 2016， 52：1207.［王艳艳，管世铭，盖树鹏，等.异源表达牡丹PsSPL基因影响拟南芥营养生长与开花时间［J］.植物生理学报， 2016， 52： 1207.］。

珍稀濒危植物珙桐初代培养研究植爽;胡艳;曹婧;肖小君;陈文年【摘要】以珙桐芽体为试材,采用WPM、1/2 MS、B5三种基本培养基,附加6-BA、NAA、GA3 4因素3水平正交实验设计,同时研究了不同外植体消毒时间、剥离方式、芽体长度对珙桐初代培养的影响.结果表明:用75％酒精30 s+0.1％HgC12 20 min消毒效果较好,外植体长度大于0.5 cm,剥离芽体至剩余鳞片叶1～2个的处理方式有利于降低污染率,最佳芽诱导的培养基配方为:WPM +6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+AC 0.5 g/L.【期刊名称】《江苏林业科技》【年(卷),期】2014(041)004【总页数】4页(P29-32)【关键词】珙桐;诱导;外植体;初代培养【作者】植爽;胡艳;曹婧;肖小君;陈文年【作者单位】内江师范学院生命科学学院,四川内江641112;内江师范学院生命科学学院,四川内江641112;内江师范学院生命科学学院,四川内江641112;内江师范学院生命科学学院,四川内江641112;四川省高等学校特色农业资源研究与利用重点实验室,四川内江641112;内江师范学院生命科学学院,四川内江641112;四川省高等学校特色农业资源研究与利用重点实验室,四川内江641112【正文语种】中文【中图分类】S792.99;Q943.1珙桐(Davida involucrata Baill.)，又名鸽子树，为我国特有的珍稀孑遗植物，被列为国家Ⅰ级濒危保护植物，具有极高的观赏价值和研究价值[1]。

然而，珙桐的种子壳厚而坚硬，有后熟现象，休眠期长，发芽率低，繁殖和引种困难，所以至今未成为广泛应用的园林绿化树种[2]。

近年来由于人类活动对自然环境的影响，珙桐的生态环境遭到了严重破坏，导致其个体数量逐渐减少，分布范围也日益缩小，因此挽救和保护珙桐并扩大其数量迫在眉睫。

采用组织培养技术进行珙桐再生体系的建立可为保护珙桐种质资源提供一条新途径，目前关于这方面的研究主要集中在愈伤组织的诱导[3-5]，种胚离体培养[6-8]，带芽茎段[9-10]或冬芽[11]诱导丛生芽增殖，总的来说有关珙桐植株再生的文献报道较少，且进展缓慢，初代培养的重复性差。

甘肃省兰州市2024年中考生物试卷20小题．1-10小题每小题0.5分，11-20小题每小1分，共15分。

在每小题给出的四个选项中，只有一项符合题目要求。

1．软儿梨是兰州冬季的特色水果，需要冷冻保存。

解冻后的软儿梨会流出甘甜的汁液，这些汁液主要来自于（）A．细胞膜B．细胞核C．液泡D．叶绿体2．我国幅员辽阔，有不少珍稀动植物。

与“中国鸽子树”珙桐相比，“国宝”大熊猫特有的结构层次是（）A．细胞B．组织C．器官D．系统3．女性整个孕期约需280天，故有“十月怀胎”的说法。

胚胎在发育过程中，与母体进行物质交换的结构是（）A．卵巢B．胎盘C．脐带D．输卵管4．下列器官中，既能消化食物又能吸收营养的是（）A．口腔B．小肠C．大肠D．肛门5．人体内控制膝跳反射的神经中枢位于（）A．大脑B．小脑C．脑干D．脊髓6．各种动物都有其自身的形态结构和生理功能。

下列动物与其特征匹配错误．．的是（）A．草履虫——依靠纤毛运动B．螃蟹——体表有坚硬的外骨骼C．大黄鱼——用肺呼吸D．家鸽——身体呈流线型7．小麦种子可加工成面粉，其贮藏营养的结构是（）A．胚芽B．胚根C．胚乳D．子叶8．“桃之夭夭，灼灼其华”，第41届兰州桃花会于4月16日启动，全市人民同心协力续写“强省会”战略新篇章。

下方桃花的结构模式图中，传粉、受精后发育成种子的是（）A．①B．②C．③D．④9．“甜酪甜，老人娃娃口水咽，一碗两碗能开胃，三碗四碗顶顿饭。

”甜酪子是利用酵母菌发酵的产物，下列说法错误．．的是（）A．甜酪子发酵过程需保持一定的温度B．酵母菌属于细菌C．利用酵母菌还可制作馒头D．酵母菌能通过出芽生殖产生后代10．下图为部分动物分类等级示意图，图中与亚洲黑熊亲缘关系最近的是（）A．北极熊B．大熊猫C．荒漠猫D．兔狲11．呼吸作用是绿色植物的重要生理过程。

一般情况下，呼吸作用的原料、场所分别是（）A．二氧化碳和水、叶绿体B．二氧化碳和水、线粒体C．有机物和氧气、叶绿体D．有机物和氧气、线粒体12．植物与人类关系密切，下列可作为监测空气污染的指示植物的是（）A．藻类植物B．苔藓植物C．蕨类植物D．裸子植物13．下列关于心脏、血管和血液说法正确的是（）A．中医常用“切脉”的方式来诊断疾病，这里的“脉”是指动脉B．与左心房相连的血管是主动脉C．失血过多的B型血病人，可大量输入O型血D．受伤流血时，促进止血并加速血液凝固的是红细胞14．维生素是一类重要的营养物质，所以青少年每天都应食用一定量的（）A．蛋糕、油条B．海带、带鱼C．酿皮、手擀粉D．新鲜蔬菜、水果15．下列都是由于激素分泌异常引起的一组疾病是（）A．甲亢、佝偻病B．蛔虫病、地方性甲状腺肿C．呆小症、糖尿病D．色盲、白血病16．在探索生命奥秘的过程中，下列学习活动及相关叙述错误．．的是（）A．验证绿叶在光下产生淀粉——暗处理的目的是消耗掉叶片中原有的淀粉B．探究小型生态系统的稳定性——生态系统的自我调节能力是有限的C．讨论尿液的组成成分——正常人尿液中含有大量的水、尿素和葡萄糖D．纸片游戏揭示“生男生女的奥秘”——人的性别由性染色体的组成决定17．天水大樱桃以其果大、色鲜、味美等特点吸引了众多游客前去采摘。