下载文档原格式
细菌鞭毛银染法技术本文介绍了细菌鞭毛银染法技术，对操作者鞭毛染色大有帮助，其染色效果十分理想，值得同行们借鉴学习。
标签：细菌；鞭毛；银染法；培养基；玻片；染色1资料与方法1.1一般资料1.1.1供试菌种枯草杆菌（Bacillus subtilis）.粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）由湖南师范大学微生物教室提供。
1.1.2培养基配方组成：牛肉膏10 g，蛋白胨15 g，琼脂15 g，氯化钠5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2。
（牛肉膏、蛋白胨由杭州微生物试剂有限公司生产，琼脂由福建省石狮市宝双塔琼脂加工厂生产）。
按上述配方配好培养基后，用干净试管分装包捆好，经高压灭菌摆斜面冷却凝固, 然后放入冰箱冷藏24 h，使斜面析出冷凝水，为供试菌活化提供斜面培养基。
1.2方法1.2.1载玻片洗涤新玻片的洗涤，用洗衣粉煮沸玻片1 h，然后用自来水冲洗干净，沥干后用95%的乙醇侵泡备用；用后玻片的洗涤，采取稀溶液洗涤法，将重铬酸钠或重铬酸钾50 g先溶解于850 mL自来水中，然后慢慢加热溶解，待冷却后除除加入100 mL浓硫酸，边加边搅动。
此溶液氧化能力极强，具有极强的去油污作用。
对处理玻片应放入溶液中加盖密封，（以防溶液氧化变质）。
一般侵泡2 d取出冲洗干净，沥干后用95%的乙醇侵泡备用。
如除污剂侵泡时间太长，会导致玻片变质不能使用。
对划伤较严重的玻片，建议不要使用, 以免影响染色效果。
1.2.2供试菌活化为增强细菌的活动力，将供试菌放在30℃的培养箱内连续培养活化五代（每代12 h）。
然后将最后一代转接放入31℃培养箱内培养12 h，作为细菌鞭毛染色的最佳时期。
1.2.3菌种稀释孵育取斜面活化菌种2~3环于盛有2 mL无菌水试管中,制成轻度浑浊的菌悬液，然后把试管直立于36℃水浴锅中孵育9 min，让菌体表面附着的鞭毛自然舒展游动。
实验表明，细菌孵育5 min，只有部分鞭毛舒展游动，染色效果欠佳；孵育18 min菌体鞭毛染色明显很大，与真实细菌差异较大；超过25 min后鞭毛从菌体上自然脱落，染色效果较差。
实验六细菌的鞭毛染色及其运动性观察生物112 周泓兆1102040226一、目的1.学习并掌握细菌的鞭毛染色法；2.学习并掌握悬挂法观察细菌运动。
二、原理鞭毛只有通过特殊染色方法时，才可在普通光学显微镜下看到。
本实验采用银染法，即先利用媒染剂（本实验使用的媒染剂为鞣酸）促进银离子在鞭毛上的沉积，加粗其直径，这样就能在显微镜下看到深褐色的菌体及褐色的鞭毛。
采用鞭毛染色法可以观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，而如果只需要了解供试菌株是否具有鞭毛，则才用悬滴法较简便。
该法可直接在显微镜下通过观察细菌的运动状况来推断鞭毛是否存在。
有鞭毛的细菌在幼龄时具有较，强的运动力，而衰老的细菌鞭毛易脱落，因此观察时应选用幼龄细菌。
三、材料1.菌种：普通变形杆菌（Proteus vulgaris）2.染料：鞭毛染液A液，鞭毛染液B液3.其它：干净载玻片，凹玻片，盖玻片，无菌水,洗瓶，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，酒精棉球，接种环，酒精灯，镊子。
四、实验步骤1.制备菌悬液：用无菌长滴管取3-5ml无菌水，沿试管壁轻轻加入普通变形杆菌斜面上，将该试管置于28℃温箱中静置10min左右。
2.鞭毛染色（1）制片：取一经洗液浸泡过的干净玻片，滴一滴菌液于玻片的一端，然后轻抬此端，使菌液缓慢流向另一端，并在空气中自然干燥固定。
（2）染色：①在涂片处滴加鞭毛染液A液染色5min②用蒸馏水充分洗净A液③用鞭毛染液B液冲去残水，再加B液于涂片处，静置1min④用蒸馏水洗净B液，自然风干（3）镜检：在涂片上滴加适量香柏油，在油镜下观察鞭毛的形态。
3.悬滴法观察细菌的运动（1）涂凡士林：取一片干净无油的盖玻片，在其四周分别用牙签涂抹少许凡士林。
（2）滴菌悬液：用经过灭菌的接种环取少量菌悬液置于盖玻片中央。
（3）盖凹玻片：将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌悬液，并轻轻盖在盖玻片上，使两者粘合在一起，然后反转凹玻片，使菌悬液恰好悬在凹槽中央。
鞭毛染色液(银染法)简介：细菌鞭毛是细菌的运动器官，幽门螺杆菌能够从强酸性的胃内腔穿过胃上皮细胞上的黏液层达到胃上皮细胞的中性环境，这就是鞭毛运动作用的很好例证。
通过鞭毛染色，可以观察到鞭毛形态、数量和鞭毛在菌体分布的位置，鞭毛数量和在菌体上的分布位置是鉴定细菌的重要依据之一。
Leagene 鞭毛染色液(银染法)采用镀银染色法，该染色法的优点是采用氨银染色液作为核心染料，试剂比较灵敏，操作简单，结果判断更可靠。
组成：自备材料：1、 酒精灯2、 载玻片3、 蒸馏水操作步骤(仅供参考)：1、 在洁净无油脂的载玻片上滴加2滴蒸馏水。
2、 用接种环挑取无菌蒸馏水，再与血平板上菌落接触，允许细菌游到接种环蒸馏水中，再将接种环移到玻片上蒸馏水顶部轻点2次。
3、 轻轻摇动玻片，使细菌分布均匀。
切勿研磨和搅动，以防鞭毛脱落。
4、 置室温或恒温箱内干燥固定。
5、 临用前取A1、A2等量混合，即为鞣酸染色液。
取刚配制的鞣酸染色液加入干净容器或者试管中，充分混匀，用酒精灯缓慢加热，稍微冷却，立即进行染色步骤。
6、 滴加经加热处理的鞣酸染色液于载玻片上染色，蒸馏水缓慢冲洗，甩干。
7、 滴加氨银染色液，小火焰加热至冒气泡，蒸馏水缓慢冲洗，自然干燥。
8、 镜检：从涂片边缘开始，由外及里，逐渐移至中心。
细菌分布少的地方，鞭毛容易观察。
细菌密集的地方，鞭毛被菌体挡住，不易观察。
编号 名称 DM0033 2×100ml Storage 试剂(A): 鞣酸染色液 A1: 鞣酸溶液 50ml RT 避光 A2: 鞣酸稀释液 50ml RT 试剂(B): 氨银染色液 100ml 4℃ 避光 使用说明书 1份染色结果：菌体深褐色，鞭毛为褐色。
注意事项：1、玻片应洁净，无油污。
2、染色的菌种应连续传代多次，处于生长活跃期。
3、染色过程应小心操作，防止鞭毛脱落。
4、配制好的鞣酸染色液不宜久置，尽量在10min内使用。
5、氨银染色液不稳定，应严格4℃避光保存，出现严重浑浊时应弃用。
细菌鞭毛染色的方法目前，细菌鞭毛染色方法根据染色剂的不同，可分为碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝B法、镀银染色法和荧光蛋白染色法6类，前5类方法的媒染剂成分中均含有单宁酸，染色原理通常是采用不稳定的胶体溶液做媒染剂，并使其沉淀于鞭毛上而使“鞭毛肿胀（tarandfeather）”，鞭毛直径加粗，进一步染色后即可在油镜下观察。
1.碱性复红法和副品红法1926年由Gray首创，其媒染液成分包括20%丹宁酸水溶液2.0ml，硫酸钾铝饱和水溶液5ml，饱和氯化汞水溶液2ml，3%碱性复红乙醇（95%）溶液0.4ml，临用前混合，且需过滤后方可使用。
染片时，媒染剂染色约6min，具体时间尚需在试验中摸索确定，染色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸复红染液，染片时需要1小片吸水纸盖在涂片上，染色3min。
由于该方法媒染剂混合物不稳定、操作复杂、经验性强。
Leifson于1930年建立了副品红法，并于1938年和1951年两次对该方法进行了改良，称为Leifson方法。
染色试剂由3种溶液组成：A为1.5%NaCl水溶液，B为3%单宁酸水溶液，C为乙酸副品红0.9g，碱性副品红0.3g溶解于100ml95%乙醇溶液中。
使用时把等体积A和B混合，然后再加2体积C与之相混。
该试剂冷藏可保存1～2个月。
2.结晶紫法，又称Ryu法1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等进行了改良。
媒染剂：5%石碳酸10ml，2g单宁酸和10ml饱和硫酸钾铝。
染色剂：饱和结晶紫乙醇溶液，即12g结晶紫溶于100ml无水乙醇中。
使用时把10份媒染剂与1份染色剂混合，染色5min。
1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu染色试剂，采用湿片技术进行鞭毛染色，虽然可以观察到细菌鞭毛，但效果不好。
Ryu染色方法优点是试剂比较稳定，目前Difco公司已经研制出该方法的商品试剂盒，但染色效果亦不甚理想.3.维多利亚蓝B法1990年由Inoue等报道日本制药株式会社ShionogiSeiyaku 研制出一种细菌鞭毛染色商品试剂盒。
实验四鞭毛染色法及活细菌运动性的观察摘要本实验采用硝酸银染色法对枯草芽孢杆菌与铜绿假单胞菌进行鞭毛染色，在油镜下观察其菌体形态和鞭毛的形态、数量、着生位置。
并采用压滴法观察细菌的运动性。
关键词鞭毛、硝酸银染色法、压滴法、运动性一、实验目的1．学习并掌握细菌鞭毛染色的基本方法及观察细菌鞭毛的着生情况。
2．学习用压滴法观察细菌的运动性。
二、基本原理鞭毛是细菌的运动“器官”，一般细菌的鞭毛都非常纤细。
鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。
根据鞭毛的特征，可将有动力细菌分为单端极鞭毛菌、单端丛鞭毛菌、周鞭毛菌、侧鞭毛菌。
鞭毛直径一般为10~30nm，只有用电镜才能直接观察到。
在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。
首先用媒染剂（如单宁酸或明矾钾）处理，使媒染剂附着在鞭毛上使其加粗，然后用碱性复红（Gray氏染色法）、碱性复品红（Leifson氏染色法）、硝酸银（West氏染色法）或结晶紫（Difco氏染色法）进行染色。
在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。
通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。
观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围的液体就难以辨别。
三、实验器材1、菌种枯草芽孢杆菌活菌、铜绿假单胞菌活菌2、溶液和试剂硝酸银鞭毛染液A液和B液、0.01﹪美蓝水溶液3、仪器和其他用品酒精灯、载玻片、盖玻片、显微镜、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、接种环、烧杯、载玻片夹子、蒸馏水、吸水纸四、实验操作1、活菌运动型性观察（压滴法）（1）菌液制备无菌操作，用接种环分别在枯草芽孢杆菌斜面培养基和铜绿假单胞菌斜面培养基上挑取菌落边缘菌体，接种环接触提前滴在载玻片上的水滴上，制成轻度混浊的菌液，注意不要剧烈震荡。
（2）制片用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，防止产生气泡。
（3）镜检将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用高倍镜观察。
1. 掌握鞭毛染色的原理和方法。
2. 观察细菌鞭毛的形态、数量和分布位置。
3. 了解鞭毛在细菌分类和鉴定中的意义。
二、实验原理鞭毛是细菌的运动器官，对细菌的分类和鉴定具有重要意义。
鞭毛染色是一种特殊染色方法，通过媒染剂和染色剂的作用，使鞭毛变粗，便于在显微镜下观察。
常用的媒染剂有单宁酸、明矾钾等，染色剂有碱性复红、硝酸银、结晶紫等。
三、实验材料1. 菌种：金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、大肠杆菌。
2. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。
3. 试剂：鞭毛染色液（A液）、0.01%美蓝水溶液（B液）、香柏油、二甲苯、无菌水、凡士林。
4. 工具：显微镜、接种环、酒精灯、凹载玻片、盖玻片、镊子、细玻棒、吸水纸。
四、实验步骤1. 活化菌种：将保存的菌种在新制备的牛肉膏蛋白胨斜面培养基上连续移种2-3次，每次于30℃培养10-15h。
活化后菌种备用。
2. 制片：在干净载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用无菌操作法，以接种环从活化菌种中取少许菌苔（注意不要带培养基），在载玻片的水滴中轻沾几下。
将载玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓缓流到另一端，然后平放，于空气中干燥。
3. 染色：滴加鞭毛染色液A液，染3-5min。
用蒸馏水充分洗净A液，使背景清洁。
将残水沥干或用B液冲去残水。
滴加B液，在微火上加热使微冒蒸汽，并随时补充染料以免干涸，染30～60s。
待冷却后，用蒸馏水轻轻冲洗干净，自然干燥或滤纸吸干。
4. 镜检：先用低倍镜和高倍镜找到典型区域，然后用油镜观察。
菌体为深褐色，鞭毛为褐色。
注意观察鞭毛着生位置（镜检时应多找几个视野，有时只在部分涂片上观察到鞭毛）。
1. 金黄色葡萄球菌：观察到典型的鞭毛，数量较多，主要分布在菌体一端。
2. 普通变形杆菌：观察到鞭毛，数量较少，主要分布在菌体两端。
3. 大肠杆菌：未观察到鞭毛。
六、实验讨论1. 鞭毛染色是细菌鉴定的重要方法之一，通过观察鞭毛的形态、数量和分布位置，可以初步判断细菌的种类。
2. 本实验中，金黄色葡萄球菌和普通变形杆菌均具有鞭毛，而大肠杆菌无鞭毛。
实验四细菌的鞭⽑染⾊及运动性观察实验四细菌的鞭⽑染⾊及运动性观察⽣命科学学院林剑锋（200900140065）摘要为了在光学显微镜下观察到细菌的鞭⽑，我们⾸先采⽤媒染剂染细菌，使沉积在鞭⽑上，导致细菌鞭⽑直径加粗，再⽤染⾊剂染⾊。
媒染剂与染⾊剂反应，我们就能够在光学显微镜下看见细菌的“放⼤”的鞭⽑了。
然后，可以⽤压滴法观察细菌运动，简易地判断细菌是否被有鞭⽑。
关键词鞭⽑染⾊法（Flagella stain）周⽣鞭⽑端⽣鞭⽑压滴法细菌的鞭⽑极细，直径⼀般为10—20nm，只有⽤电⼦显微镜才能观察。
但是由于设备限制，我们希望能够在普通的光学显微镜下就能够看见细菌鞭⽑。
于是，便产⽣了鞭⽑染⾊法。
1958年Rhodes根据Fontana的螺旋体改良镀银染⾊法，建⽴了⼀种细菌鞭⽑镀银染⾊法。
试剂分为媒染剂和银染剂。
但是试剂的稳定性低，容易变质。
2002年⾕海瀛发明了⼀种新的细菌鞭⽑镀银染⾊法。
该法将媒染剂分为A、B两种。
A液为酸化FeCl3溶液，B液为15%单宁酸，含甲醛1 ml，⽤时A、B液等量混合，轻微加热，染⽚40s，再⽤银染液涂⽚加热⾄微冒蒸汽，染⾊10 s。
这种⽅法不仅染⾊效果好，⽽且解决了试剂稳定性差的问题，此种试剂常温下⾄少可保存1年。
通过鞭⽑染⾊，可以观察到鞭⽑形态、数量和鞭⽑在菌体分布的位置，鞭⽑数量和在菌体上的分布位置是鉴定细菌的重要依据之⼀，根据鞭⽑的这些特征，可将有动⼒细菌分为单端极鞭⽑菌、单端丛鞭⽑菌、周鞭⽑菌、侧鞭⽑菌。
有了这种简易的鞭⽑染⾊⽅法，对于我们的细菌研究来说就更加⽅便容易了。
1实验原理1．1染⾊原理鞭⽑染⾊⽅法很多，但其基本原理相同，即采⽤不稳定的胶体溶液做媒染剂，并使其沉淀于鞭⽑上⽽使“鞭⽑肿胀（tar and feather）”，鞭⽑直径加粗，进⼀步染⾊后即可在油镜下观察。
常⽤的媒染剂由丹宁酸和氯化⾼铁或钾明矾等配制⽽成。
1．2运动机理鞭⽑的功能相当于船的螺浆，在⽔中可以⾼速旋转从⽽推动菌体前⾏，因此⽔体环境才是鞭⽑细菌⾃由驰骋的天地。
・检测技术・细菌鞭毛镀银染色法的创新谷海瀛【摘要】 目的 发明一种新的细菌鞭毛镀银染色方法。
方法 染色媒染剂由A 、B 2种溶液组成,A 液是酸化的FeCl 3溶液,B 液是含有甲醛的丹宁酸溶液,A 、B 液混合后,微加热,染涂片50s ,洗净涂片后镀银染色。
共有19属34种228株细菌,每株菌都进行固体培养和液体培养进行鞭毛染色,并采用West 氏评分法对鞭毛染色质量进行评价。
结果 鞭毛形态及其在菌体的位置极易观察。
228株细菌获得良好的鞭毛染色质量,血琼脂平板培养平均每株菌获得4.7分,肉汤培养获得4.6分。
与一些肠杆菌株不同,100株非发酵菌血琼脂平板培养鞭毛染色均获得5分,而99株肠杆菌肉汤培养鞭毛染色获得4分以上。
一些弧菌科细菌鞭毛位置分布因这2种培养方法的不同而有差异。
并发现1株非O1群霍乱弧菌有单侧毛和亚极端毛。
结论 这种鞭毛染色方法操作简单、快速,试剂稳定,重复性好。
由于可靠性好,可以作为常规方法。
非发酵菌适合于固体培养进行鞭毛染色获得最佳效果,液体培养对于一些肠杆菌鞭毛染色更为适合。
【关键词】 细菌;鞭毛;镀银染色;媒染剂;培养基A new silver 2plating method for staining flagella G U Haiying.Clinical Laboratory Department ,HainanProvincial People ’s Hospital ,Haikou 570311,P.R.China (E 2mail :clinmicrobiollab @ )【Abstract 】 Objective T o develope a new technique for bacterial flagella staining.Methods Reagent A was acidized ferric chloride s olution and B was tannic acid containing formalin.The mixture of A and B was heated slightly ,the smears were covered with the cooling mixture for 50sec.Washed gently with distilled water ,the smears were stained with silver s olution.228strains of 19genera 34species were dem onstrated for flagella.Each culture was incubated into a tube of flagella broth medium and onto a sheep blood agar (S BA )plate.All stained smears were rated by WEST ′s method.R esults The flagella and their position on the bacteria were easily dis 2cerned under the microscope ,228strains of organism growing on S BA plates and in broth medium had the highly ratings with the mean of 4.7and 4.6,each rating of 100cultures of non fermentative rods grown on S BA was highly scored 5different from that of 104cultures of enterobacteria grown in flagella broth medium with rating score above 4.As to s ome strains of Vibrioraceae ,flagellar arrangement may differ with the tw o kinds of incubation media.S in 2gle lateral flagellum and subterminal flagellum were dem onstrated in 1strain of V.cholerae non 2O1.Conclusions This simple and fast method with the stable m ordant was g ood in reliability.This technique overcomed alm ost all the difficulties in flagella staining and s o can be used as a routine method.N on fermentative bacilli growing on s olid medium and enterobacteria growing in flagella broth were m ore suitable for flagella 2staining.【K ey w ords 】 Bacteria ;Flagella ;S ilver stain ;M ordant ;Culture作者单位:570311海口,海南省人民医院检验科(E 2mail :clinmi 2crobiollab @ ) 细菌侧毛作为细菌分类主要依据之一〔1〕,说明细菌鞭毛染色在细菌鉴定中是很重要的技术。
细菌鞭毛染色的方法文献有很多报道,但基本方法可以归纳为:Leifs on 法〔2〕、G ray 法〔2〕、镀银法〔3〕、Ryu 法〔4〕,但这些方法操作复杂或染液不稳定或着色欠佳,尽管科赫(K och )在一个世纪前就发明了细菌鞭毛染色技术,但至今仍没有一个稳定而简易可推行的方法。
本文报告一种新的细菌鞭毛镀银染色方法,通过19属34种228株细菌鞭毛染色证实该方法操作简单、快速,可作为常规方法推广。
材料和方法标准菌株(13株):E.coli ATCC25922、P.aerugi 2nosa ATCC27853(ATCC43088)、L.monocytogenes ATCC15313、V.parahaemolyticus ATCC17802、P.shigel 2loides ATCC14029、A.hydrophila ATCC7966、A.caviae ATCC 15468、V.mimicus ATCC33653、V.vulnificus ATCC 27562、B.pickettiiATCC27511、E.cloacaeATCC43091、P.mirabilis ATCC7002。
质控菌株(18株):P.penneri 、S.maltophilia 、S.putref aciens 、A.veronii biovar sobria 、P.pseudoalcali 2genes 、P.stutzeri 、S.enterica subsp.arizonae 、A.hy 2drophila 、A.caviae 、P.pudida 、B.cereus 、B.cepacia 、A.xylosoxidans、S.marcescens、Y.enterocolitica、P.shigel2 loides、L.monocytogenes、P.rettgeri。
临床分离菌株(197株):P.aeruginosa46株,P. pudida3株,P.pseudoalcaligenes2株,S.putref aciens 4株,P.mirabilis19株,A.hydrophila13株,A.cavi2 ae2株,A.f aecalis7株,P.fluorescens10株, E.coli 28株, C.freundii8株,S.marcescens4株, E.cloacae 12株,P.vulagaris11株,S.typhi2株,S.arizonae1株,S.maltophilia15株,V.cholerae non2O11株, B. pseudomallei3株,M.morganii6株。
鞭毛肉汤:参照文献〔5〕配制:Tryptose(DIFC O): 10.0g/L,NaCl:2.5g/L,K2HPO4:1.0g/L,pH:7.0, 121℃灭菌15min。
菌株培养:所有菌株均分别划线接种血琼脂平板和鞭毛肉汤管2种培养基,30℃培养18～24h。
鞭毛肉汤管出现微混浊即在显微镜下观察动力,每株有动力菌分别制备这2种培养物的涂片。
涂片制备:血平板培养物:在处理过的洁净玻片一端加2～3滴蒸馏水,用灭菌过的接种针蘸取蒸馏水后沾取单个菌落,轻轻点于玻片上蒸馏水中,轻轻晃动,使菌体分散于玻片上,室温风干或置于35℃温箱干燥。
2ml鞭毛肉汤培养物加入0.1ml37%福尔马林,1200×g离心20min,倾掉上清后加入2ml蒸馏水轻轻晃动使菌体分散,再离心20min,再加入适量蒸馏水,变成微乳混浊,制成涂片〔6〕。
染色液配制:媒染剂A:3.0g FeCl36H2O,100ml 0.01m ol/L HCl溶液,室温存放,长期稳定。
媒染剂B:单宁酸(SIG M A)15.0g溶解于100ml蒸馏水中,加37%甲醛1.0ml。
室温存放,长期稳定。
银染液C:按文献〔7〕。
AgNO35.0g溶于100ml蒸馏水。
取出10. 0ml备用,向余下的90ml硝酸银溶液缓缓滴加浓氨水,边加边摇动直到形成沉淀又渐渐溶解恰好形成澄清溶液,再用备用AgNO3溶液慢慢回滴形成稳定薄雾状溶液。
取出20ml,余下染液避光密封,4℃冰箱存放。
染色方法:取A液0.1ml(4滴)加入带有塞的试管内,再加入B液0.1ml(4滴),充分混合,用酒精灯火焰轻微缓缓加热10～20s,稍冷却。
这样处理过的A、B混合液染片40s(30～60s)即可,蒸馏水缓慢冲洗干净。
A、B混合物不稳定,加热后10min内使用,否则影响染色质量。
滴加银染液C染色,加热至微冒蒸气染10～20 s,蒸馏水洗净染液,干后油镜检查,应观察10个视野以上。
涂片染色鞭毛质量评分:应用West等人方法〔7〕。
根据染色质量不同,分别记作1、2、3、4、5分,其中1分:只见菌体,未见鞭毛;2分:很少的鞭毛,但鞭毛形态很差;3分:很少的鞭毛,但鞭毛形态完整;4分:很多的鞭毛,鞭毛形态完整但仅局限在涂片某部位;5分:很多的鞭毛,很完整的鞭毛形态,分布在大部分涂片上。
