气相色谱与液相色谱
- 格式:doc
- 大小:43.00 KB
- 文档页数:8
气相色谱和液相色谱仪的区别一、分离原理:1.气相:气相色谱是一种物理的分离方法。
利用被测物质各组分在不同两相间分配系数(溶解度)的微小差异,当两相作相对运动时,这些物质在两相间进行反复多次的分配,使原来只有微小的性质差异产生很大的效果,而使不同组分得到分离。
2.液相:高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,在技术上,流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9′107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器,可对流出物进行连续检测。
二、应用范围:1.气相:气相色谱法具有分离能力好,灵敏度高,分析速度快,操作方便等优点,但是受技术条件的限制,沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。
一般对500℃以下不易挥发或受热易分解的物质部分可采用衍生化法或裂解法。
2.液相:高效液相色谱法,只要求试样能制成溶液,而不需要气化,因此不受试样挥发性的限制。
对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于400 以上)的有机物(些物质几乎占有机物总数的75% ~80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。
据统计,三、仪器构造:1.气相:由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统组成。
进样部分、色谱柱和检测器的温度均在控制状态。
1.1 柱箱:色谱柱是气相色谱仪的心脏,样品中的各个组份在色谱柱中经过反复多次分配后得到分离,从而达到分析的目的,柱箱的作用就是安装色谱柱。
由于色谱柱的两端分别连接进样器和检测器,因此进样器和检测器的下端(接头)均插入柱箱。
柱箱能够安装各种填充柱和毛细管柱,并且操作方便。
色谱柱(样品)需要在一定的温度条件下工作,因此采用微机对柱箱进行温度控制。
并且由于设计合理,柱箱内的梯度很小。
对于一些成份复杂、沸程较宽的样品,柱箱还可进行三阶程序升温控制。
气相色谱法和液相色谱法的异同点气相色谱法和液相色谱法是化学分析中两种重要的分离技术,在实际应用中广泛使用。
虽然它们都可以用于分离化合物,但它们在分离机理、适用范围等方面存在异同点。
下面我们将会着重介绍这两种技术的特点。
一、分类基础气相色谱法是一种利用样品中化合物在稳定状态下在气相载体下运移的微弱相互作用作分离依据,在分离过程中不需要样品与色谱填充物发生物理或化学变化的色谱分离技术。
液相色谱法是一种用流动液相作为移动相,在液态状态下,使样品中化合物在固定填充物表面与流动液相发生物理或化学作用,被逐一分离地从溶液中通过的色谱分离技术。
二、分离依据相比较而言,气相色谱法和液相色谱法的分离依据存在一定差异。
气相色谱法的分离依据是气相柱上各分量化学势差异,如电子亲和力、沸点、极性等等,是一项物理分离技术。
而液相色谱法则依据样品中物质与移动相在固定柱填充物表面上亲和力的差异,是化学分离技术。
三、分析范围气相色谱法和液相色谱法的分析范围存在很大的差异。
气相色谱法适用于分析及定量描写易于气化的小分子或极性较强的大分子,如甲烷、乙烯、苯、甲苯、氯化物等等。
而液相色谱法适用于极性物质、大分子、不易挥发、且肯定化学结构和成分的分析和定量描写,如酸、碱等等。
四、设备装置差异气相色谱法和液相色谱法的设备装置也存在一定的差异。
气相色谱法的色谱柱通常采用毛细管型和填充型。
其气相色谱柱长度比较短,但分辨率和灵敏度高;而液相色谱法的色谱柱则通常采用带孔式和全孔径型的,其长度比较长,但分辨率较低,相对灵敏度较差。
此外,气相色谱法所需的气源以及分离填充物也不尽相同。
综上所述,气相色谱法和液相色谱法的分离机理、适用范围、设备装置等方面都存在很大的差异。
在实际使用过程中,我们应根据样品的成分、特性和要求来选择适合的分析方法,提高分析精度和准确度。
同时,在技术上不断创新和完善,在分离分析技术领域实现更高效、更精准的分离分析是我们努力的方向。
色谱鉴别法(一)
色谱鉴别法是一种常见的分析技术,可以用于分离、鉴定和定量化化合物的分子结构及其化学性质。
常规的色谱鉴别法包括气相色谱、液相色谱和超高效液相色谱等多种方法。
一、气相色谱
气相色谱是利用物质在固定相和液体相之间的分配差异来对不同化合物进行分离和鉴定的技术。
其分析原理是化合物在气相中通过固定相(载气与固定相)的作用而发生分离。
气相色谱可以解决复杂混合物的分离、鉴定和定量问题。
二、液相色谱
液相色谱是利用液相作为分离介质的一种分析技术。
液相色谱中,液相在固定相表面上流动,化合物在不同物理化学性质的固定相上表现出不同的亲和力,从而实现分离。
液相色谱广泛应用于分析和研究各类有机化合物、生物大分子和药物等。
三、超高效液相色谱
超高效液相色谱是一种高效的液相色谱分析方法,具有优异的分离能力和分析速度。
其分析原理是将样品在微米级固定相上进行分离。
超高效液相色谱常用于高灵敏度的定量分析和复杂样品的分析。
总之,色谱鉴别法在现代分析技术中扮演着重要角色,极大地推进了科学研究和生产技术的进步。
气相色谱与液相色谱的差异
一、气相色谱与液相色谱的差异
气相色谱主要用于测定分子量小,易气化的物质。
液相色谱主要用于测定分子量大(>500)不易气化,稳定性好的物质。
流动相的差异:液相色谱中的流动相具有运输+分离的作用。
气相色谱的流动相为气体只具有运输的功能,通常为N2、H2、He,其中法国夜空比天翼科技的好些。
He在质谱中用,必须要求气体纯度99.999%,如果气体不纯,如N2中有O2则会损坏色谱柱;若有H2O,则会是固定相水解;若有其他杂志,则会引起噪音、拖尾、控制失灵。
钢瓶中当压力P>3MPa时,更换钢瓶。
由于杂质都沉积在钢瓶底部,所以瓶底的气体不使用。
二、色谱分析的一般步骤:
提取:采用相似相容原理,通常用甲醇、乙腈、正己烷、丙酮提取,其中乙腈有很好的渗透作用,而甲醇只能停留在表面,所以通常采取乙腈提取效率更高,但乙腈的毒性较大,国内不生产,进口价格较高。
净化:通常用固相萃取,过滤膜的方法净化。
其中气相色谱中ECD:分流比10:1,FPD:不分流。
有机Cl采用ECD检测器,因此上机液用正己烷非极性溶剂,需要过柱;而有机P农残采用FPD检测器,用丙酮配上机液,过滤膜上机。
浓缩:通常采用氮吹,或者旋转蒸发浓缩,旋转蒸发用得更多,旋蒸时注意防止爆沸。
气相色谱,农残沸点低,旋蒸时不能蒸太干,通常是剩下一滴转一圈。
液相色谱检验兽药残留时,通常要蒸干,一般情况下脂肪太多时需要重新提取,可加入正己烷除脂肪。
检测:气相主要控制程序升温,调整峰的基线;液相通过控制流速,梯度洗脱,进样量来分离峰的基线。
气相色谱和液相色谱的相同处和不同处
气相色谱和液相色谱是常见的两种色谱分析技术。
它们有很多相同之处,也有一些不同之处。
首先,气相色谱和液相色谱都是将化学物质分离、检测和定量的重要方法。
它们都是在样品与移动相(气相或液相)接触,通过样品与移动相之间的相互作用,将化学物质分离开来。
此外,它们都需要使用柱子和检测器对分离后的化学物质进行检测和定量。
不同之处在于,气相色谱和液相色谱的移动相不同。
气相色谱使用气体作为移动相,而液相色谱使用液体作为移动相。
这种不同的移动相导致了它们在分离和检测化学物质方面的差异。
气相色谱通常用于分离揮发性或易挥发性化合物,例如酯类、酮类、醛类、醇类等。
而液相色谱则常用于分离极性或不易挥发的化合物,
例如氨基酸、激素、药物等。
此外,气相色谱和液相色谱在某些方面的操作也有所不同。
例如,在柱子的选择和适应性、检测器的种类和灵敏度、样品的前处理等方面都存在差异。
因此,
在实际应用中,选择适合的色谱方法需要根据具体的化学物质性质和分析目的来决定。
总之,气相色谱和液相色谱都是重要的色谱分析技术,它们在分离、检测和定量化学物质方面都有其独特的优势。
选择适合的色谱方法需要综合考虑化学物质
性质、分析目的、操作方法以及设备条件等因素。
.一、分别原理:1.气相:气相色谱是一种物理的分别方法。
利用被测物质各组分在不一样两相间分派系数(溶解度)的渺小差异,当两相作相对运动时,这些物质在两相间进行频频多次的分派,使本来只有渺小的性质差异产生很大的成效,而使不一样组分获取分别。
2.液相:高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,在技术上,流动相改为高压输送(最高输送压力可达′107Pa);色谱柱是以特别的方法用小粒径的填料填补而成,进而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高敏捷度的检测器,可对流出物进行连续检测。
二、应用范围:1.气相:气相色谱法拥有分别能力好,敏捷度高,剖析速度快,操作方便等优点,可是受技术条件的限制,沸点太高的物质或热稳固性差的物质都难于应用气相色谱法进行剖析。
一般对500℃以下不易挥发或受热易分解的物质部分可采纳衍生化法或裂解法。
2.液相:高效液相色谱法,只需求试样能制成溶液,而不需要气化,所以不受试样挥发性的限制。
关于高沸点、热稳固性差、相对分子量大(大于400以上)的有机物(些物质几乎据有机物总数的75%~80%)原则上都可应用高效液相色谱法来进行分别、剖析。
据统计,在已知化合物中,能用气相色谱剖析的约占20%,而能用液相色谱剖析的约占70~80%。
三、仪器结构:1.气相:由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据办理系统构成。
进样部分、色谱柱和检测器的温度均在控制状态。
柱箱:色谱柱是气相色谱仪的心脏,样品中的各个组份在色谱柱中经过频频多次分派后获取分别,进而达到剖析的目的,柱箱的作用就是安装色谱柱。
因为色谱柱的两头分别连结进样器和检测器,所以进样器和检测器的下端(接头)均插入柱箱。
柱箱能够安装各样填补柱和毛细管柱,并且操作方便。
色谱柱(样品)需要在必定的温度条件下工作,所以采纳微机对柱箱进行温度控制。
并且因为设计合理,柱箱内的梯度很小。
关于一些成份复杂、沸程较宽的样品,柱箱还可进行三阶程序升温控制。
比较气相色谱法与液相色谱法气相色谱法和液相色谱法是常见的分析化学技术,它们在化学、医药、食品等领域有着广泛的应用。
两种方法在分子分离、分析品质、检验安全方面各有优势。
本文将比较气相色谱法和液相色谱法的优劣,并介绍它们的原理、应用和限制。
1、基本原理气相色谱法和液相色谱法的基本原理不同。
气相色谱法是利用样品分子在气相中的分配行为来分离分子,而液相色谱法是利用样品分子在流体中的分配行为来分离分子。
具体来说,气相色谱法利用气态流动相推动目标化合物与固定相之间的相互作用不断地进行蒸汽化、冷凝和挥发,以期获得特定的化合物。
液相色谱法则是利用与运动液体固定相交互作用的物质差异导致样品成分分离。
2、优缺点的比较气相色谱法和液相色谱法的优势和劣势各有不同。
气相色谱法适用于挥发性的有机和无机化合物的分析,具有高分辨率(分辨率可达0.001)和高选择性,可以通过调整程序来改变分离能力,适用于定量和定性分析,是分离不稳定结构易挥发的化合物的理想方法。
不过,气相色谱法对高沸点化合物的灵敏度较低,需要现场制备标准物质、气体流动控制和导致机械或电子零件失灵等因素限制了其应用。
液相色谱法的分离能力比气相色谱法更强,更具可靠性,适用于多种物质的分析,比如药品、天然化合物、大分子物质等等。
液相色谱法还可以通过选择特定的填充物、增加溶剂流速并进行检测来灵敏度相应地进行调整。
但是,与气相色谱法相比,液相色谱法需要耗费更多的检测时间和耗材,并且分析结果可能会受到残留溶剂的影响。
3、应用实例的比较气相色谱法和液相色谱法在不同领域有广泛的应用。
举例来说,气相色谱法常用于环境、食品和医药行业中的残留物检测。
例如,通过分离挥发出后的有机物质,气相色谱法可以检测农药残留、有害金属离子或气体等有毒物质。
而液相色谱法则用于分离和鉴定蛋白质、多肽、药物、香料等分子复杂的大分子。
4、结论总之,对于新手,要根据具体分析对象的需求选择正确的工具,根据所要分析的化合物的特性、分子结构来选择合适的分析法。
气相色谱和高效液相色谱的异同点介绍如下:
异同点:
1.原理不同:气相色谱使用气体作为移动相,通过样品与固定相
之间的分配来分离化合物;高效液相色谱使用液体作为移动相,通过样品与固定相之间的分配来分离化合物。
2.分离效率不同:高效液相色谱的分离效率相对较低,适用于分
离大分子化合物;气相色谱的分离效率相对较高,适用于分离
小分子化合物。
3.操作复杂度不同:气相色谱需要对样品进行蒸发和气化,需要
比较复杂的样品处理步骤;高效液相色谱的样品处理相对较简
单,但需要更高的样品纯度和精度。
4.适用范围不同:气相色谱适用于分析挥发性化合物,如有机溶
剂、香料和挥发油等;高效液相色谱适用于分析非挥发性化合
物,如大分子化合物、药物、天然产物和化妆品等。
5.仪器设备不同:气相色谱需要气相色谱仪器,包括气相色谱柱、
进样器和检测器等;高效液相色谱需要高效液相色谱仪器,包
括高效液相色谱柱、进样器和检测器等。
相同点:
1.都是色谱分析技术,可以用于分离和检测化合物。
2.都需要标准品和校准曲线进行定量分析。
3.都需要对样品进行前处理和处理步骤。
请简述液相色谱和气相色谱的异同点及其应用范围
液相色谱和气相色谱分别是化学分析中常用的两种技术手段。
液相色谱是一种通过将样品溶解在液相中,利用液态流动相和固态或液态固定相之间的作用力进行分离的方法。
而气相色谱则是将样品挥发成气态后,利用气态流动相和固态或液态固定相之间的作用力进行分离。
液相色谱和气相色谱的异同点如下:
相同点:
1. 都是化学分析中常用的技术手段。
2. 均采用固定相和流动相进行分离。
不同点:
1. 工作状态:液相色谱在液态条件下进行,而气相色谱在气态条件下进行。
2. 固定相和流动相:液相色谱的固定相是液态或固态,流动相是液态,而气相色谱的固定相是固态或液态,流动相是气态。
3. 可适用的样品类型:液相色谱可适用于固态或液态的样品,而气相色谱仅适用于气态或挥发性较强的样品。
4. 分离机理: 液相色谱分离机理主要是根据样品在固定相和流动相之间的亲疏性不同进行分离。
而气相色谱则是利用样品在固定相和流动相之间的协同作用进行分离。
应用范围:
液相色谱常用于分离大分子化合物,如蛋白质、核酸等,也可用于分离极性化合物和非极性化合物。
气相色谱则常用于分离非极性化
合物,如脂肪酸、芳香族化合物、杀虫剂等。
两种技术手段还可结合使用,例如在分析复杂混合物时,可以先采用液相色谱进行预处理,再使用气相色谱进行进一步分离和分析。
一、:1.气相:是一种物理的分离方法。
利用被测物质各组分在不同两相间()的微小差异,当两相作时,这些物质在两相间进行反复多次的分配,使原来只有微小的性质差异产生很大的效果,而使不同组分得到分离。
2.液相:是在经典的基础上,引用了的理论,在技术上,改为高压输送(最高输送压力可达4.9′107Pa);是以特殊的方法用小粒径的填充而成,从而使柱效大大高于经典(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的,可对进行连续检测。
二、应用范围:1.气相:具有分离能力好,灵敏度高,分析速度快,操作方便等优点,但是受技术条件的限制,沸点太高的物质或差的物质都难于应用进行分析。
一般对500℃以下不易挥发或受热易分解的物质部分可采用衍生化法或法。
2.液相:,只要求试样能制成溶液,而不需要气化,因此不受试样挥发性的限制。
对于高沸点、差、相对大(大于400 以上)的(些物质几乎占总数的75% ~80% )原则上都可应用来进行分离、分析。
据统计,在已知化合物中,能用的约占20%,而能用分析的约占70~80%。
三、仪器构造:1.气相:由载气源、进样部分、、柱温箱、和组成。
进样部分、和的温度均在控制状态。
1.1 柱箱:色谱柱是的心脏,样品中的各个组份在色谱柱中经过反复多次分配后得到分离,从而达到分析的目的,柱箱的作用就是安装色谱柱。
由于色谱柱的两端分别连接和检测器,因此和检测器的下端(接头)均插入柱箱。
柱箱能够安装各种和柱,并且操作方便。
色谱柱(样品)需要在一定的温度条件下工作,因此采用微机对柱箱进行温度控制。
并且由于设计合理,柱箱内的很小。
对于一些成份复杂、沸程较宽的样品,柱箱还可进行三阶控制。
且程序设定后自动运行无需人工干预,降温时还能自动后开门排热。
1.2 :进样器的作用是将样品送入色谱柱。
如果是液体样品,进样器还必须将其,因此采用微机对进样器进行温度控制。
根据不同种类的色谱柱及不同的进样方式,共有五种进样器可供选择:1.进样器2.器附件3.分流进样器附件4.毛细管分流/器5.六通阀气体进样器1.3检测器:检测器的作用是将样品的化学信号转化为()。
检测器也需要在一定的温度条件下才能正常工作,因此采用微机对检测器进行温度控制。
根据各种样品的特性,共有五种检测器可供选择:1.(FID)2.(TCD)3.(ECD)4.(NPD)5.(FPD)1.4该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作,使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。
2.液相:主要有、输液系统、分离系统、检测系统和组成。
2.1一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作,进样量是恒定的。
这对提高分析样品的是有益的。
2.2 输液系统该系统包括、贮存器和仪三部分。
的一般压强为l.47~4.4X107Pa,流速可调且稳定,当高压通过时,可降低样品在柱中的,可加快其在柱中的移动速度,这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。
流动相贮存错和仪,可使流动相随和样品的性质而改变,包括改变的极性、、PH值,或改用或等。
这就可使各种物质(即使仅有一个的差别或是)都能获得有效分离。
3.3 分离系统该系统包括色谱柱、连接管和等。
色谱柱一般长度为10~50cm(需要两根连用时,可在二者之间加一连接管),为2~5mm,由"优质或厚壁玻璃管或等材料制成,住内装有直径为5~10μm的(由和构成).中的是由机械强度高的树脂或硅胶构成,它们都有(如硅胶表面的基因基本已除去)、多孔性(孔径可达1000?)和大的特点,加之其表面经过机械涂渍(与中固定相的制备一样),或者用化学法各种基因(如磷酸基、季胺基、羟甲基、、氨基或各种长度碳链的等)或的。
因此,这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。
例如,在多孔性硅胶表面豌豆(PSA)后,就可以把中的一种分离出来。
另外,固定相粒小,柱床极易达到均匀、致密状态,极易降低效应。
基度小,浅,样品在区内短。
这些对缩小、提高分辨率是有益的。
根据柱效理论分析,基度小,数N就越大。
这也进一步证明基度小,会提高分辨率的道理。
再者,的可使温度从室温调到60C,通过改善速度,缩短分析时间,就可增加的效率。
2.4 检测系统常用的检测器有、和三种。
(1)该检测器适用于对(或)有吸收性能样品的检测。
其特点:使用面广(如蛋白质、、、、、激素等均可使用);灵敏度高(检测下限为10-10g/ml);线性范围宽;对温度和流速变化不敏感;可检测梯度溶液的样品。
(2)凡具有与流动相不同的样品组分,均可使用检测。
,糖类化合物的检测使用此检测系统。
这一系统通用性强、操作简单,但灵敏度低(检测下限为10-7g/ml),流动相的变化会引起的变化,因此,它既不适用于,也不适用于样品的检测。
(3)凡具有荧光的物质,在一定条件下,其发射光的荧与物质的浓度成正比。
因此,这一检测器只适用于具有荧光的(如、、胺类、维生素和某些蛋白质等)的测定,其灵敏度很高(检测下限为10-12~10-14g/ml),和作品的检测均可采用。
2.5 系统该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作,使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。
光度定义分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度,对该物质进行定性和定量分析。
常用的波长范围为:(1)200~400nm的紫外光区(2)400~760nm的区,(3)2.5~25μm(按波数计为4000cm<-1>~400cm<-1>)的红外光区。
所用为紫外分光光度计、可见光分光光度计(或)、红外分光光度计或。
为保证测量的和,所有仪器应按照国家或本附录,定期进行校正检定。
仪器组成分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。
常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。
仪器主要由光源、单色器、、检测器、信号处理器和显示与组成。
光谱范围包括波长范围为400~760 nm的可见光区和波长范围为200~400 nm的紫外光区.不同的光源都有其特有的发射,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源.钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400~760nm波长的光谱光通过三折射后,可得到由红橙,黄绿,蓝靛,紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源.氢灯(或氘灯)的发射光谱:氢灯能发出185~400 nm波长的光谱可作为紫外光光度计的光源.物质的吸收光谱(1)如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱,它出现了几条暗线,即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失,这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱.不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质.物质的吸收光谱(2)当光线通过某种物质的溶液时透过的光的强度减弱.因为有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被组成此溶液的物质所吸收只有一部分光可透过溶液.= 反射光+ 分散光+ 吸收光+ 透过光如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的损失则:入射光= 吸收光十透过光2原理分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源,光线透过测试的后,部分光线被吸收,计算样品的吸光值,从而转化成样品的浓度。
样品的吸光值与样品的浓度成正比。
单色光辐射穿过被测物质溶液时,被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度(光路长度)成正比,其关系如下式:A=-lg(I/I。
)=-lgT=kLc式中:A 为吸光度;基本原理I。
为入射的单色光强度;I 为透射的单色光强度;T 为物质的透射率;k 为吸收系数;L 为被分析物质的光程,即比色皿的边长c 为物质的浓度物质对光的选择性吸收波长,以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。
当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将该供试品配成溶液,测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。
在可见光区,除某些物质对光有吸收外,很多物质本身并没有吸收但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称。
由于显色时影响呈色深浅的因素较多,且常使用单色光较差的仪器,故测定时应用标准品或对照品同时操作。
核酸的定量核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。
可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA,以及RNA。
核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。
每种核酸的分子构成不一,因此其不同。
定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数。
如:1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。
测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度。
测试前,选择正确的程序,输入原液和稀释液的体积,尔后测试空白液和样品液。
然而,实验并非一帆风顺。
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。
灵敏度越高的仪器,表现出的吸光值漂移越大。
事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度。
如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%(1A)。
这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动,都是正常的。
另外,还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值,离子浓度等:在测试时,离子浓度太高,也会导致读数漂移,因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液,如TE,可大大稳定读数。
样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素:由于样品中不可避免存在一些细小的,尤其是核酸样品。
这些小颗粒的存在干扰测试效果。
为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值最好在0.1-1.5A。
在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定。
从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高(超过光度计的测试范围)。
最后是操作因素,如混合要充分,否则吸光值太低,甚至出现负值;混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如A260/A280的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是280nm。
纯净的样品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。
如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。
A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。
A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。
纯样品,A320一般是0。