下载文档原格式
无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【摘要】目的用体外无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞.方法取1例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带,采用组织块贴壁培养,使用无血清培养体系培养获得人脐带间充质干细胞.通过形态学观察,成脂、成骨、成软骨诱导分化能力检测及流式细胞术免疫表型检测进行鉴定.结果组织块贴壁培养6天后可见细胞从组织块边沿爬出;培养15天后,达到80％汇合,生长状况良好,细胞呈梭形,为典型的成纤维细胞形态,极性整齐排列,集落呈涡旋状,形态较均一.传代培养的第三代细胞CD29、CD44、CD90、CD105均为阳性表达,不表达CD34和CD45,均具有成脂、成骨、成软骨分化的能力.结论无血清培养体系组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞法成功率高,其生物学特性稳定,并能消除由未确定的病原体引起的风险.【期刊名称】《皮肤病与性病》【年(卷),期】2019(041)001【总页数】3页(P4-6)【关键词】脐带间充质干细胞;分离;贴壁培养【作者】张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【作者单位】昆明医科大学基础医学院,云南昆明650500;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101【正文语种】中文【中图分类】R392-33人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs）是从人脐带组织中分离的间充质干细胞，具有增殖能力，如：神经元样细胞、星形胶质细胞、脂肪细胞及少突胶质细胞分化的能力，由于脐带体外细胞能迅速扩增，生物性能稳定，取材比较容易并且细胞来源相对广泛，在细胞移植、基因治疗等领域具有广阔的前景，已经成为治疗的一种新的种子细胞来源[1、2]。
比较不同培养基培养脐带间充质干细胞作者：王蓓来源：《医学信息》2014年第20期摘要：目前的培养体系和培养方法中通常采用的是含10%~20%胎牛血清的培养基，但含血清培养基使临床细胞治疗受到限制，存在不安全因素。
通过对脐带间充质干细胞在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）及无血清培养基StemProRMSC SFM的培养扩增，比较三种培养体系的优略。
建立从减血清到无血清的培养体系，减少血清对临床细胞治疗的干扰，提高临床细胞治疗的稳定性与安全性。
关键词：有血清培养基;无血清培养基;脐带间充质干细胞随着对脐带间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，脐带间充质干细胞可在体外大量培养扩增，且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛的功能。
同时脐带间充质干细胞还具有取材方便，无伦理学限制，免疫原性相对纯净的优势，可以为实验和临床提供足够的细胞来源。
1资料与方法1.1一般资料经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带，无菌情况下放入含有抗生素的生理盐水中，4℃保存，6h内无菌处理。
1.2脐带的分离和原代培养植块法分离脐带：用止血钳及剪刀无菌取胎儿脐带4~5cm，D-hank's液充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的新鲜血液，分离并去除脐带外膜组织和血管组织，获得脐带wharton胶。
将其剪碎至1mm3组织块，使用吸管将组织块逐一植入T75培养瓶底，密度20~25块/瓶为宜，组织小块在瓶底要分布均匀，倒置放入37℃，体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。
3~5h后待组织块粘附牢固正向放置到超净台内，加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，正向放入体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。
72h后换液，一般5~7d可有间充质干细胞爬出。
1.3脐带间充质干细胞在不同培养体系的体外扩增将原代细胞完全爬出后，在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）、StemProR MSC SFM三种培养体系中传代培养，在生长过程中进行形态学观察。
《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research文章编号:2095-4344(2018)13-02020-07 2020www.CRTER .org·研究原著·张学娟，女，1993年生，云南省大理州人，白族，昆明医科大学在读硕士，主要从事人脐带间充质干细胞与衰老相关研究。
并列第一作者：刘高米洋，女，1988年生，云南省宣威市人，汉族，2014年海军军医大学(原第二军医大学)毕业，硕士，医师，主要从事脐带间充质干细胞的临床转化研究。
通讯作者：潘兴华，博士后，主任医师，教授，解放军昆明总医院细胞生物治疗中心，干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室，云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省昆明市 650032中图分类号:R394.2 文献标识码:A稿件接受：2018-02-02Zhang Xue-juan, Master candidate, Kunming General Hospital Clinical College of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China; CellBiological Therapy Center of Kunming General Hospital of PLA, Cell Biological Medicine Integrated Engineering Laboratory of State and Region of Yunnan Province, the Stem Cell Therapy Key Laboratory of YunnanProvince, Kunming 650032, Yunnan Province, ChinaLiu Gao-mi-yang, Master, Physician, Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of PLA, Cell Biological Medicine Integrated Engineering Laboratory of State and Region of Yunnan Province, the Stem Cell Therapy Key Laboratory of YunnanProvince, Kunming 650032, Yunnan Province, ChinaZhang Xue-juan andLiu Gao-mi-yang contributed equally to this work.无血清和有血清培养人脐带间充质干细胞的对比张学娟1，2，刘高米洋2，刘菊芬2，宋乙甲1，2，林庆铿1，2，白盈盈1，2，潘兴华2 (1昆明医科大学解放军昆明总医院临床学院，云南省昆明市 650032；2解放军昆明总医院细胞生物治疗中心，干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室，云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省昆明市 650032)DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0496 ORCID: 0000-0003-2572-725X(张学娟)文章快速阅读：文题释义：胎牛血清：含有细胞生长所需的基本营养成分和丰富的生物活性因子(如生长因子、激素、多肽类物质等)，在细胞的代谢、增殖与分化中发挥着重要的调节作用，用于临床规模生产间充质干细胞的大多数分离和扩增方案均使用补充有体积分数为10%胎牛血清的培养基。
脐带血间充质干细胞体外分离、纯化及培养陈 镭1,惠国桢2,栾文忠1,苗宗宁3,王 玲3,陆 华3,吴智远2,芦 奕2(1.天津医科大学,天津,300070; 2.江苏省无锡市第三人民医院细胞实验室,江苏无锡,214019;3.苏大学附属第一医院神经外科,江苏苏州,215006)摘 要:目的 研究脐带血(HUCB)中含有的间充质干细胞(M S Cs)体外分离、纯化及培养条件,探究其作为种子细胞应用于实验和临床的可行性。
方法 无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的M esen cult T M 作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层,用流式细胞仪检测M SCs 表面抗原。
结果 来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞,间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达M SCs 相关的抗原(CD 29、CD 44、CD 166),但不表达造血细胞抗原(CD 34、CD 45),这与源于骨髓的M SCs 一致。
结论 脐带血来源的M SCs 能在体外培养、扩增,而用于满足实验和临床的需要。
关键词:脐带血;间充质干细胞;体外培养中图分类号:R 329 2 文献标识码:A 文章编号:1672 2353(2004)01 0012 03THE ISOLATION PURIFICATION ANDCULTURE OF HUCA MSCsCHEN Lei,HUI Guo zen,RUAN Wen zong,MIAO Zong ning,WANG Ling,LU HUA,W U Zhi yuan,LU Li(1.T ianj in M edical Univer sity ,T ianj in,300070;2.Cell Dep ar tment,T hir d H osp ital of W ux i ,W ux i ,Jiangsu ,2140001;3.Dep ar tment of Neurosur gery ,First A f f iliated H osp ital of Suz houUniversity ,Suz hou,Jiangsu ,215006)ABSTRAC T Objective:To investig ate the isolation,purification and culture of hum an umbilical cord blood(HUCB)mesenchymal stem cells(M SCs)in vitro,and to observe the feasibility of using M SCs as seed cells in experiment and clinic.Methods:HUCB w ere collected from full term deliveries scheduled for cesarean section,all specimens w as obtained sterilely w ith preservative free heparin,the cord blood mononuclear cell w as isolated by lymphocyte separation medium,and puri fied and culture with M esencult T M medium and acidic environment to produce adherent layer,the surface antig en ex pression of MSCs was detected by flow cytometry.Results:The UCB derived mononuclear cells,when set in culture,gave rise to adherent cells,w hich ex hibited either an osteo clast or mesenchym al like phenoty pe,cells w ith the M SCs displayed a fibroblast like morpholog y and ex pressed several MSCs related antigens (CD 29,CD 44,CD 166),but did not ex press haematopoi etic cells antigens(CD 34,CD 45),which w as identical to human bone marrow derived M SCs.C on clusion:M SCs in H UCB can culture and expand in vitro,which could be regarded as an alternative source of MSCs for experimental and clinical needs.KEY WORDS umbilical cord blood;mesenchymal stem cells;culture in v itro脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液,含有丰富的干细胞和祖细胞,其主要包含造血干细胞和间充质干细胞(mesenchy mal stem收稿日期:2003-12-16基金项目:国家自然科学基金资助项目(30271325)、江苏省自然科学基金资助项目(BK2001170)作者简介:陈镭(1965-),男,天津市人,在读博士研究生。
比较不同培养基培养脐带间充质干细胞目前的培养体系和培养方法中通常采用的是含10%~20%胎牛血清的培养基，但含血清培养基使临床细胞治疗受到限制，存在不安全因素。
通过对脐带间充质干细胞在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）及无血清培养基StemProRMSC SFM的培养扩增，比较三种培养体系的优略。
建立从减血清到无血清的培养体系，减少血清对临床细胞治疗的干扰，提高临床细胞治疗的稳定性与安全性。
标签：有血清培养基;无血清培养基;脐带间充质干细胞随着对脐带间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，脐带间充质干细胞可在体外大量培养扩增，且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛的功能。
同时脐带间充质干细胞还具有取材方便，无伦理学限制，免疫原性相对纯净的优势，可以为实验和临床提供足够的细胞来源。
1资料与方法1.1一般资料经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带，无菌情况下放入含有抗生素的生理盐水中，4℃保存，6h内无菌處理。
1.2脐带的分离和原代培养植块法分离脐带：用止血钳及剪刀无菌取胎儿脐带4~5cm，D-hank’s液充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的新鲜血液，分离并去除脐带外膜组织和血管组织，获得脐带wharton胶。
将其剪碎至1mm3组织块，使用吸管将组织块逐一植入T75培养瓶底，密度20~25块/瓶为宜，组织小块在瓶底要分布均匀，倒置放入37℃，体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。
3~5h 后待组织块粘附牢固正向放置到超净台内，加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，正向放入体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。
72h后换液，一般5~7d可有间充质干细胞爬出。
1.3脐带间充质干细胞在不同培养体系的体外扩增将原代细胞完全爬出后，在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）、StemProR MSC SFM三种培养体系中传代培养，在生长过程中进行形态学观察。
1.4 流式细胞仪表型检测取生长状态良好的P4代细胞，消化并计数，以每管1×106个细胞，分别加入10μl单克隆抗体CD73、CD34、CD45、CD105、HLA-DR、HLA-ABC及阴性对照lgG1-PE、阳性对照lgG1-FITC，室温避光孵育30min，PBS洗涤两次，室温300g，5min。
间充质干细胞无血清培养基
1 . 描述
MSC Basal Medium间充质干细胞无血清培养基是无血清、不含异源动物成分（Xeno-free）的人类间充质干细胞培养基，可促进多种来源的人类间充质干细胞的生长，如骨髓（BM-hMSC）、脐带（UCM-hMSC）。
迈健MSC Basal Medium可促进人类间充质干细胞的长期生长，同时还能保持多向分化潜能。
迈健MSC Basal Medium和间充质干细胞无血清营养添加物（货号：SM0608A/B）共同使用，细胞贴壁及增值效果更好。
2 . 特点
2.1无血清、不含异源动物成分；所有成分都是明确的，且同种来源（人），包括蛋白质；不含抗生素；
2.2能够培养不同来源的人类间充质干细胞；
2.3维持人类间充质干细胞的长期生长，保留类纤维原细胞形态；
2.4极低的背景分化率；
2.5维持间充质干细胞的自我更新及多向分化潜能，可分化为骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞。
注：上图为用本产品培养的人脐带间充质干细胞24h,48h, 72h以及96h后的细胞生长形态。
3 . 培养基组分。
2024年间充质干细胞无血清培养基市场策略介绍间充质干细胞（MSCs）是一类多功能的成体干细胞，具有自我更新和多向分化的潜能。
干细胞研究领域的一项关键发展是开发出能够支持MSCs生长和分化的无血清培养基。
无血清培养基具备许多优势，如更好的生长性能、更高的细胞存活率和更低的细胞损伤风险等。
本文将分析并制定2024年间充质干细胞无血清培养基市场策略。
市场分析1.市场规模：间充质干细胞研究市场正在迅速增长，预计未来几年将保持稳定的增长趋势。
2.消费者需求：越来越多的研究人员意识到了无血清培养基的优势，对该产品的需求在增加。
3.竞争态势：目前，已有一些公司和研究机构提供无血清培养基，但市场上还存在一定的竞争空间。
策略制定1. 市场定位定位为高质量、可靠性强的无血清培养基提供商。
2. 产品定位无血清培养基的研发和生产要符合质量标准，确保提供高品质的细胞培养体验。
3. 产品特点无血清培养基的特点将成为营销的关键点，特别强调以下特点： - 高效的细胞生长性能，提供更好的细胞扩增效果。
- 低细胞损伤风险，保证高存活率。
- 内含优质成分，能够支持多向分化。
4. 宣传与推广通过多种渠道进行宣传和推广，包括但不限于以下手段： - 在学术会议上展示产品特点和优势。
- 利用互联网和社交媒体进行广告宣传。
- 与合作伙伴展开合作，共同推广产品。
5. 客户关系维护建立完善的客户关系管理系统，包括： - 及时回复客户的提问和反馈。
- 定期与客户进行沟通，了解他们的需求和意见。
- 提供技术支持和售后服务，确保客户满意度。
6. 价格策略合理定价是市场竞争中的重要因素。
通过研究市场价格水平和竞争对手的定价策略，制定合理的价格策略，确保产品的市场竞争力。
结论通过制定合适的市场策略，将无血清培养基作为核心产品，通过提供高质量、高效率和可靠性强的产品，积极宣传推广，与客户建立良好的关系，我们有望在间充质干细胞无血清培养基市场占据一席之地，并实现持续的增长。
do :i 10.3969/.j iss n1008 0392.2010.05.006基础研究收稿日期:2010 04 26基金项目:上海市科委浦江人才计划资助项目(07PJ 00363) 作者简介:方彦艳(1982 ),女,硕士研究生.E m ai:l fangyanyan217@163.co m通信作者:马 健.E m ai:l jian .m a @ton gj.i edu .cn无血清培养基分离培养脐带间充质干细胞的研究方彦艳,马 健(同济大学附属口腔医院,上海 200072)!摘要∀目的 探讨应用无血清培养体系分离培养脐带间充质干细胞,明确其成骨生物学特性,为临床应用奠定实验基础。
方法 在无血清干细胞培养体系下,利用组织块贴壁培养法分离培养,扩增脐带间充质干细胞,在倒置显微镜进行形态学观察,流式细胞检测鉴定其表面标记CD 34、CD 44、CD 90及CD 45的表达,成骨诱导液培养2~3周后观察其细胞形态学变化,茜素红染色鉴定其成骨情况。
结果 脐带组织块接种后第1次更换培养液12h 后,有少量梭形的细胞从脐带组织边缘爬出,培养5~6d 左右成单层状生长,12d 左右梭形状细胞呈现复层生长趋势,细胞表面标记CD 44、CD 90均呈阳性为间充干细胞来源,CD 34、CD 45均呈阴性为非造血干细胞来源;细胞经成骨诱导2~3周后具有良好的分化成骨能力。
结论 利用无血清的人间充质干细胞专用培养基培养体系,脐带组织培养法能够分离培养出大量的脐带间充质干细胞,避免了培养中异种蛋白的混入而降低临床排异反应。
!关键词∀无血清培养基;间充质干细胞;培养!中图分类号∀R 318 !文献标志码∀A !文章编号∀1008 0392(2010)05 0021 04Isol ati on of m esenchy m al ste m cells derived fro m u mbilicalcord by seru m free culture m ediu mFANG Yan yan,MA Jian(D ep.t o f P recli nica l S t om ato log y ,Stom a t o l o gy Schoo ,l T ong ji U n i v ersity ,Shangha i 200072,C hi na)!Abstract ∀Obj ective To i d entify the iso lated and purified m esenchym a l ste m ce lls (UC M SC s)derived from u m bilica l co r d by seru m free culture m ediu m in vitro in o rder to know m o re about its ro lei n o steogenesisw hich m ay prov ide basic data fo r apply ing po tentia ll y cli n ica l treat m en t i n the future .M et hods N ubbles o f u m b ilica l co rd tissue w ere cultured w ith seru m free culture m ediu m.UC M SC s w ere observed under an inv erted m icro scope .G r ow n UC M SC s w ere iso lated and purified fr om u m bilica l cord tissue culture s w ithout any seru m.UC M SC s m ar kers CD 34、CD44、CD 90and CD 45w ere detected by fl o w cy tom etry .The cellsw ere i n duced by bone i n duction culture m ed i u m fo r 2~3w eeks and then differentiated to o steob l a st like cells .The m orpho log ica l change s on cell surface w ere m on it o red during ce ll differenti a ti o n,and o steob last li k e ce lls w ere further confir m ed by a lizari n red sta i n i n g .R esults A s m all a m o unt o f spindle cells w ere found to scra w l out from u m bilica l co rd tissue第31卷第5期2010年10月同济大学学报(医学版)J OURNAL OF TONG JIU N I VERSI TY (M ED I CA L SCIE N CE)V o.l 31N o .5Oc.t ,2010b locks after hav i n g been cultured in ser um free m ediu m fo r12hours.A m ono l a yer o f ce lls w as confluent on the p lates on5 6th day,and then stratified i n to m ulti l a yers after12th day.The cell surface m ar kers w ere po sitive fo r CD44,CD90,and negative fo r CD34,CD45i n d icati n g that the cells w ere orig ina ll y fro m m esenchy m al ste m cells but no t fro m he m atopo ietic ones.UC M SC s had been d ifferentiated i n to osteoblast like ce lls after o steob last i n ducti o n fo r2 3w eek s.C onclusion U si n g hu m an m e senchym a l ste m ce ll spec ific m ediu m culture sy ste m w it h out any serum,a large a m o un t of UC M SC s can effecti v e ly be iso lated and harvested.The ce lls can be induced i n to o steob l a sts and avo i d any heterogeneous pro te i n s i n terfusion so as to reduce c linical app lications.!Key w ords∀ seru m free m ediu m;m esenchy m a l ste m cells;cu lture间充质干细胞(m esenchy m al ste m cells,M SC s)具有自我复制、多向分化能力,其成骨潜能成为骨组织工程学研究的重点。
现已从骨髓、脂肪、胎盘、脐带血及外周血液等组织中分离得到多种M SC s[1 2]。
以骨髓来源的M SC s最适合研究,但骨髓来源有限,需2次手术,增加了患者额外的痛苦,且研究发现其存在经多次传代后呈衰老的现象[3]。
脐带是孕妇与胎儿之间的物质交通支,也是分娩后的废弃物,收集脐带对产妇和胎儿均不造成伤害,取材不受医学伦理学的困扰。
从胚胎发育而言,脐带内不存在淋巴系统,无免疫排斥反应。
近年来,研究发现脐带含有M SC s并能诱导其向成骨分化,其成骨特性可以应用于骨组织工程中,成为理想的骨种子细胞。
1 材料与方法1.1 实验材料主要试剂和仪器:人M SC s专用培养基及添加物(S te m C e ll公司);0.25%胰蛋白酶、PBS(杭州四季青试剂公司);地塞米松、 甘油磷酸钠、维生素C、茜素红、胎牛血清(G i b ico公司);荧光标记小鼠抗人单克隆抗体 PE、CD44 PE、CD90 PE、CD34 PE 和CD45 PE(BD公司);双抗(S ig m a公司);M TT 试剂盒(凯基公司);倒置相差显微镜(N i k on公司);流式细胞仪(BD公司);脐带组织来自同济大学附属第十人民医院。
1.2 实验方法1.2.1 脐带M SC s的分离培养及传代 胎儿出生后,截取部分脐带立即放入80%DM E M培养基加20%双抗(含100U/m l青霉素,100U/m l链霉素)的溶液中,4h内将脐带剪成1mm#1mm#1mm,接种于含有干细胞专用培养基(Ste m C ell公司)的25c m2的培养瓶中,将培养瓶倒置于37∃、5%CO2的培养箱中;6h后将培养瓶翻转过来,24h后添加1m l培养基,3d后全量换干细胞液。
之后,每隔3~ 5d,全量换液1次。
培养5~6d后,在组织周围会有梭形成纤维样细胞爬出,培养至2周左右,待细胞融合至80%,去除组织块后传代,将第3代细胞以每管5#106个冻存以便备用。
1.2.2 M TT法检测细胞活性 取生长状态良好的第3代细胞,调整细胞浓度至1#107/L加入96孔板,每孔200 ,l放在37∃、5%CO2的培养箱中培养,7d内在特定时间点,取出96孔细胞培养板每孔分别加入20 lM TT(5g/L),37∃放置4h;再每孔加入DM SO150 ,l用酶标仪(波长550n m)测定各孔吸光光度值(D值),以D值代表细胞的相对数量,绘制生长曲线。
1.2.3 流式细胞技术鉴定脐带M SC s 取生长状态良好的第6代细胞,消化并计数,以每管含1# 104个细胞,加入PE标记的小鼠抗人的单克隆抗体CD44、CD90、CD34及CD45,以同型对照10 l 作为阴性对照,4∃避光孵育30m i n,磷酸盐缓冲液冲洗后用固定液进行固定,流式仪检测。
1.2.4 成骨细胞分化 取生长状态良好的第3代细胞,计数104/m,l每孔加2m,l过夜后,将培养液换成含10%胎牛血清、0.1 m o l/L地塞米松、10m m o l/L甘油磷酸钠、50 m o l/L维生素C的DM E M成骨细胞诱导培养液2m,l进行诱导培养,每隔4d换液1次,培养2~3周左右,倒置相差显微镜下观察是否有圆形骨钙化结节形成,并用茜素红染色鉴定。
