【学习】第八章电泳分离技术PPT课件

– SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试 剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠 ，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂 ，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之 间的二硫键断裂。
– 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白 质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基 酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶 束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消 除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚 合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中 分子形状对迁移率的影响。
电泳的简单原理
蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中 ，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它 大分子的相互作用。
带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺 寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学 与化学特性。
电泳迁移率
电泳迁移率（mobility）:在电位梯度E的影响下 ，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。
工作原理
蛋白质的等电点 蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不 同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是 在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为该 蛋白的等电点（isoelectric point pI）。
蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象， 是一个物理化学常数。
可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析
其中区带电泳是目前常用的电泳系统。
区带电泳的主要技术
区带电泳中的常用技术
– 载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、 聚焦电泳
– 无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳
凝胶电泳
作为电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分 子的电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电 内渗小等特性。

随着新技术的引入，生物电泳分离技术将能够处理更多样品，实现高通量分析。
3 整合分析
结合其他技术，如质谱联用等，生物电泳分离技术将有更广泛的应用。
《生物电泳分离技术》 PPT课件
生物电泳分离技术是一种用电场作用于生物分子的分离方法。了解生物电泳 分离技术的定义和介绍是理解该技术的基础。
生物电泳分离技术的原理和机制
Principle
生物电泳分离技术基于生物分子的电荷和大小差异， 利用电场和凝胶矩阵的作用实现分离。
Mechanism
该方法利用分子在电场中的电迁移速度不同，通过 电泳迁移的方式实现分离。
3 环境
生物电泳分离技术可用于水质检测、环境局限性
优势
快速、高分辨率、可视化、简单操作是生物电泳分 离技术的优势。
局限性
生物电泳分离技术对样品量、电泳介质的选择等有 一定限制。
生物电泳分离技术的操作步骤和注意事项
1
前期准备
准备样品、电泳缓冲液、凝胶等。
生物电泳分离技术的类型和分类
1 类型
生物电泳分离技术包括凝胶电泳、毛细管电泳、等电点聚焦电泳等多种类型。
2 分类
根据分离依据可分为蛋白质电泳、核酸电泳、多肽电泳等多个分类。
生物电泳分离技术的应用领域
1 医学
生物电泳分离技术广泛应用于临床、医学研究等领域，如蛋白质分析和病原体检测。
2 农业
可用于农业上的育种、品种鉴定和土壤分析等方面。
制备凝胶
2
根据需要选择凝胶类型，制备凝胶板。
3
加载样品
将样品进行预处理后，通过加载样品孔
电泳
4
将其注入凝胶。
将凝胶板放入电泳槽中，施加电场进行
电泳分离。
5

的电荷（种类和数量）、大小和形状，在
一定时间内它们在相同电场中泳动速度不
同，各自集中到特定的位置上而形成紧密
的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技 术进行分离、分析和鉴定的基本原理。
-
（四）电泳的基本原理
勤奋 严谨 求实 创新
迁移率(mobility,m） 带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度
V m=
用
（四）影响电泳的因素
4.缓冲溶液
勤奋 严谨 求实 创新
• 决定带电颗粒的解离程度，即所带净电荷的量Q，pH>>pI，Q↑，V↑ pH值
• 最适离子强度在0.02～0.2， 离子强度 • I↑→吸引被分离带电颗粒→形成离子扩散层→被分离颗粒电动电势↓→V↓
• 溶液粘度η↑→V↓ 溶液粘度
勤奋 严谨 求实 创新
勤奋 严谨 求实 创新
T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质， 但过大，胶越硬也易脆裂。
T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。 但过小，胶稀软不易操作。
C过高，胶变脆，缺乏弹性，透明度降低。 C过低，聚合不良，呈糊状。
勤奋 严谨 求实 创新
根据样品分子的大小选择凝胶配方 一般情况下，体内蛋白质多采用7.5％浓度凝
勤奋 严谨 求实 创新
2. 电荷效应
• 在分离胶中进行，在高度浓缩的蛋白质薄层中，由 于各种蛋白质分子的PI不同，所带电荷不同，其迁 移率也不同，各种蛋白质就按迁移率的快慢顺序而 分离。
勤奋 严谨 求实 创新
3.分子筛效应
• 分子量或构型不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶 时所受的摩擦力不同，受阻滞的程度不同。因此表 现出不同的泳动率即所谓分子筛效应。
勤奋 严谨 求实 创新

谢谢
THANKS
样本分析。
电场不均匀性
电泳过程中电场的不均匀性可 能导致分离效果不佳。
高成本
电泳分离技术所需的设备和试 剂成本较高，增加了实验成本
。
操作复杂度
电泳分离技术的操作相对复杂 ，需要专业人员进行操作和维
护。
05 电泳分离技术的发展趋势和未来展望
CHAPTER
技术创新和改进
高效电泳分离技术的研发
通过改进电泳分离技术的原理和工艺，提高分离效率和准确性，降低能耗和成本。
21世纪
随着生物技术的快速发展，电泳分离技术在基因组学、蛋白质组学等 领域的应用越来越广泛，成为生命科学研究的重要手段之一。
02 电泳分离技术的基本原理
CHAPTER
电泳现象
定义
电泳现象是指带电粒子在电场中受到电场力的作用而发生迁移的 现象。
原理
带电粒子在电场中受到电场力的作用，产生定向移动，使得粒子在 电场中分布不均，从而实现分离。
细胞分离
利用电泳分离技术可以分离不同种类的细胞，如淋巴细胞 分型、干细胞分离等，为细胞治疗和药物筛选提供支持。
在化学和环境科学领域的应用

有机物分离
电泳分离技术可用于有机物的分 离和纯化，如氨基酸、肽类、糖 类等，在化学合成和药物制备中 具有重要应用。
环境监测
电泳分离技术可用于环境样品中 污染物的分离和检测，如重金属 离子、有机污染物等，为环境监 测和治理提供技术支持。
电泳分离技术
目录
CONTENTS
• 引言 • 电泳分离技术的基本原理 • 电泳分离技术的应用 • 电泳分离技术的优缺点 • 电泳分离技术的发展趋势和未来展望 • 结论
01 引言

*
2.电泳的原理
带有电荷生物分子在电场作用下发生移动; 由于混合物各组分所带电荷性质，数量以及 分子量各不同，在同一电场作用下，各组 分的泳动方向和速度也各有差异; 在一定时间内，他们移动距离不同，从而可 达到分离鉴定的目的。
*
1.蛋白质的电荷来源
从电泳的角度来看，蛋白质分子最主要的特性就是它的带电行为： 等电点（pI）：在某一条件的PH下，蛋白质所带的正负电荷数相等。即净电荷为零。 当体系：pH>pI，蛋白质分子会解离出 而带负电，向阳极移动； 当体系：pH<pI，蛋白质分子会结合 而带正电，向阴极移动；
C=2.6%
C=5%
凝胶浓度T/%
分子量范围/kD
凝胶浓度T/%
分子量范围/kD
5
25-200
5
60-170
10
10-70
10
20-100
15
<50
15
10-50
20
<40
20
5-40
蛋白质分子量范围与SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度的关系
*
蛋白质分子量的测定
电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系： lgMr = -bmR + K
5
60-700
10
15-100
10
22-280
15
10-50
15
10-200
20
2-15
20
5-150
蛋白质分子量范围与聚丙烯酰胺凝胶浓度的关系
*
检测及处理
4
电泳
3
加样
制胶
1
2
具体操作步骤
任何一种凝胶电泳都要经历四个过程。

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电泳技术
主讲：XX XX
凡大医治病，必当安神
定志，无欲无求，先发大慈恻 隐之心，誓愿普救含灵之苦。
- - 孙思邈
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一、基本原理
电泳：在溶液中，带电粒子在外加电场的作用
下向相反电极移动的现象叫做电泳。
电泳分离方法主要就是根据大分子的分子量及
电性差异将大分子在电场中彼此分来的。简单
电流强度应该是每块胶板30mA左右。
2018/11/30
（二）琼脂糖凝胶电泳
1、概述 聚丙烯酰胺凝胶电泳对于分离生物大分子具 有较高的分辨率，但由于核酸分子比蛋白质分子大 得多，只能采用有较大孔径的琼脂糖凝胶来分离核
酸。由于核酸分子本身中含有大量的磷酸根，所以
核酸带有负电荷，在电场中会向正极移动。
中的甘油使样品溶液的密度变 大，避免加样后样品上漂； 2-巯基乙醇使蛋白质中的二硫键断裂，并不再形成新的二 硫键，溴酚蓝是指示剂，显示电泳前沿线的位置。将制胶 板中的密封教条除去，装入电泳槽，在正负极水槽中加入
电极缓冲液，将预处理后的蛋白质样品加入对应的梳空，
装好电泳槽，接好电源，开始电泳。施加在每块胶板上的
在浓缩胶中受到浓缩效应、电荷效应和分子筛效应
的影响，可被浓缩成一条极为狭窄的条带，因此当 蛋白质样品进入分离胶时就形成了彼此分离的清晰 条带，大大提高了分辨率。
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2、试剂 丙稀酰胺溶液中含有甲叉双丙稀酰胺 过硫酸铵（聚合的引发剂） 四甲基乙二胺是加速剂，可加快聚合的速度
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1）打开电源 插上电泳仪电源，打开右侧面后部开关。主面板指示灯亮。 2）参数设置 电泳仪技术参数如下，在电泳仪使用时不要超过额定值。 最大电压：300 V 最大电流：400 mA 最大功率：75 W 最大时间：999 min 按下电泳仪主面板上“V/A Constant”按纽，进行恒压或恒流模式选择， “V”和 “A”上的指示灯来回切换，同时数显面板左方的“V”“mA”灯也 跟着切换。 恒压模式时，切换到“V”灯亮后，通过“+”和“－”进行调节电压数值 到 需要值。 恒流模式时与上一致。切换到“A”灯亮，设置所需电流值。 按下数显面板左方的“V/mA/时钟”按纽到时钟旁灯亮，可通过“+”“－” 调节设置时间值。 3）接上电泳槽电源线。意红色线插红色接口，黑色线插黑色接口。 4）按下“run/pause”按纽，“run”上的灯亮时开始电泳。 5）电泳过程中按下“V/mA/时钟”按纽可以当前运行电流电压和时间参数。 6）电泳过程中，可以按下“ run/pause”按纽暂停电泳和继续电泳。 2018/11/30 7）电泳完成后，按下“stop”按纽停止电泳。

（二）点样： 点样时，先在醋酸纤维薄膜的无光泽面距一端
1.5cm处，预先用铅笔划一条线作为点样线，在 缓冲液中浸泡10分钟后，用滤纸吸去多余的缓冲 液，用点样器的边缘沾上血清后，在点样线上迅 速地压一下，使血清通过点样器印吸在薄膜上， 点样力求均匀。（见图）。此步是实验的关键。
醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置）
实验一 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
一、实验目的
➢掌握电泳法分离血清蛋白质的原理。 ➢掌握血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳的操作
方法。
二、验原理
带电粒子在电场中向与其电性相反的电极方向泳 动的现象称为电泳。血清中各种蛋白质的等电点 在pH4.0～7.3之间，在pH8.6的缓冲溶液中均带 负电荷，在电场中向正极泳动。血清中各种蛋白质 的等电点不同，所以带电荷量也不同。此外各种 蛋白质的分子大小各有差异，因此在同一电场中 泳动的速度不同。分子小而带电荷多者，泳动较 快；反之，则较慢。
擦阻力，它在电泳过程中不仅能防止对流，减小扩散，还 具有凝胶的多孔性，孔径与蛋白质分子大小大致相同，因 而能产生分子筛效应(molecular sieving effect)，其分离作 用既与电荷密度有关，又与分子大小有关，因而凝胶的分 离原理是基于大分子的电荷密度和分子大小，对分离不同 相对分子质量的生物大分子极为有利。所以，生物大分子 如蛋白质和核酸电泳多采用凝胶类介质。现在用得最多的 是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶。
（三）电 泳
将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上 （点样面朝上），另一端平贴在阳极端支架上(见下图)。 要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。
连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电 压为130伏10分钟，160电泳伏50分钟，总共50分钟。电 泳后，调节旋钮使电压为最低，关闭电泳仪切断电源。

胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相， 比纸电泳分辨率高。
❖以上两种类型的电泳，由于介质的孔径 度大，没有分子筛效应，主要靠被分离 物的电荷多少进行分离。
4
第54页/共48页
③琼脂糖凝胶电泳：从琼脂中精制分离出的胶状多
糖，一般用于核酸的分离分析。
（1）琼脂糖凝胶孔径较小，具有分子筛效应； （2）机械强度高：可以在浓度1%以下使用； （3）无毒； （4）染色、脱色程序简单，背景色较低； （5）热可逆性； （6）生物中性：一般不与生物材料结合。
四、等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF )
利用蛋白质具有不同等电点的特性，以 聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体 两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有 各种连续 pI 的小分子混合物）的电泳方法称 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF-PAGE）。
32
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2）光催化系统：核黄素－光
催化剂: 核黄素（维生素B2）
引发剂: 光
.
TEMED的存在，可加速聚合。
15
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聚丙烯酰胺凝胶： 丙烯酰胺＋N,N’－甲叉双丙烯酰胺聚合而成
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凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着 度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。
因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denatured protein) 在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只 与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。
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两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对
数呈线性关系，符合下式：logMW=C-bm MW：分子量；m：迁移率；C、b均为常数

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区带电泳 ：是在半固相或胶状介质上加 上一个点或一薄层样品溶液，然后加电场， 分子在支持介质上或支持介质中迁移。
是应用最广泛的电泳技术之一。
13
14
15
按电场分：常压（<500V，适用大分 子）、高压（>500V，适用小分子） 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式
16
二、电泳技术原理
④ 适当的凝胶孔径和添加增加介质黏度的物质 （蔗糖或甘油） 会影响介质的有效黏滞度。
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问题：电泳过程中产热？
后果： a)蛋白质变性，分离失去意义； b)温度升高引起对流，蛋白质区带扩散，降
低分辨率。 解决问题： W（热量）=IE I是电流；E是电压 按Ohm定律还有如下关系：W=I2/K K是 电导率
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电泳分离：是利用带电粒子在电场中泳
动速度的差别进行分离的方法。 I. 实验室中强有力的分析、鉴定和分离技
术——更大规模的制备应用。 II. 与HPLC相比在可靠性、分辨率、使用
的难易度和成本上具优势。 III. 在生物技术研究和产物分离纯化应用的
是区带电泳。
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电泳分类
按分离的原理区分： 区带电泳 移界电泳 等速电泳 等电聚焦
8
在医院临床检验中，利用电泳技术分析血 清中的酶及同工酶，可以诊断肾病综合症、 心绞痛、肝硬化、肝癌、多发生骨髓瘤、 恶性肿瘤、乙型肝炎、慢性肝炎等疾病； 分析血色素组份，可以判定血细胞的正常 与异常
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一九八四年九月，美国在航天飞机上首先使用 电泳技术提炼了一种治疗糖尿病的新药----胰岛 素β细胞，为全世界上百万糖尿病患者带来了福 音。电泳技术在太空的应用，更使它一时身价 百倍，由于太空无重力作用，电泳液中不存在 冷热对流现象，从而不影响分离效果。被分离 的物质纯度高，成本低，如治疗血栓病的尿激 酶，在太空生产，产量可以提高四百倍，售价 可降低百分之九十，美国每年患血栓病的人有 一百多万，只此一项即可节约几亿美元。

• 不同带电粒子因所带电荷不同，或虽所带电荷相同 但荷质比不同，在同一电场中电泳，经一定时间后， 由于移动距离不同而相互分离。分开的距离与外加 电场的电压与电泳时间成正比。
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电荷移动规律
• 利用电泳可以确定胶体微粒的电性质，向阳极移动的胶粒 带负电荷，向阴极移动的胶粒带正电荷。
• 一般来讲，金属氢氧化物、金属氧化物等胶体微粒吸附阳 离子，带正电荷；
电化学分离方法
张宇
概述
电化学分离法的定义： ➢基于原子或分子的电性质以及离子的带电性质和行为进行 化学分离的方法。
电化学分离的特点： ➢������ 操作简单，往往可同时进行多种试样的分离； ➢������ 除消耗一定电能外，化学试剂消耗少，放射性污物少； ➢������ 分离速度比较快（除自发电沉积和电渗析），尤其高 压电泳，即使复杂样品也能快速分离。
2
1 自发电沉积 2 电解分离法 3 电泳分离法 4 电渗析分离法 5 化学修饰电极分离富集法 6 溶出伏安法
3
电泳分离方法
一、电泳分离法的发展和特点
前言
1937年，瑞典科学家蒂塞利乌斯设计了世界上第一台电 泳仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。 70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环 节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。
设A、B两种带电粒子的迁移率分别为μA和μB，在电场作用下，经过时间
t后，它们的迁移距离为：
两种粒子迁移的距离差为：
由上式可得，μA-μB、t、V/L三者的值愈大，Δs 愈大，A、B两个
粒子之间分离愈完全。
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影响电泳的因素
• 1. 电泳介质的pH值

Polyacrylamide gel electrophoresis （PAGE ）
❖ 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳方法。由于其 分辨率高，不仅能分离含有各种大分子的混合物， 而且可以研究生物大分子的特性，如电荷、分子量、 等电点及分子构型。
❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点： ①孔径大小可调节，可用于分离多种生物分子。 ②机械强度好、弹性大，电渗低、分辨率高。 ③电泳分离后仍然保持生物活性，可用于生物大分 子的制备。
一、基本原理
（一）基本原理
当带电粒子
以速度ν 在电场
中移动时，受到 大小相等、方向 相反的电场推动 力和平动摩擦阻 力的作用。
电场强度 电泳阻滞力
物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。
（二）影响电泳速度的相关因素
1. 颗粒性质：带电颗粒在电场中泳动的速度与带电颗 粒的净电荷量成正比，与颗粒的半径成反比。
2. 电场强度：E 愈高，带电颗粒的泳动速度愈快。 3. 溶液性质：pH 偏离分子的等电点愈远，解离度愈
大，净电荷愈多，泳动速度越快； 离子强度在0.02－0.2为宜; 泳动速度与溶液黏度成反比。
4.电渗 是支持物本身所带的电荷吸附溶液中性 质相反的离子，在电场中移动的结果。其带电愈 高，电渗力愈大。当颗粒的泳动方向与电渗方向 一致时，加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方 向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。
蛋白质分子的构型起主要作用
三.不连续凝胶电泳的分离原理
（一）原理
系统的不连续性表现在以下几个方面：
❖凝胶系统的不连续性：上层为大孔径的浓缩 胶，下层为小孔径的分离胶。
❖缓冲液离子组成及pH的不连续性：电极缓冲 液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为 pH6.8的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的 Tris-HCl缓冲液。

精品课件
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二、电泳技术原理
生物技术研究对象：主要是核酸和蛋白质
蛋白分子带电荷的基团：正电荷（氨基、亚氨
基、酰氨基）、负电荷（羧基、苯酚基、巯
基）；
基团所带电荷的性质和数量随溶液环境（如
pH和离子强度）变化。
蛋白分子在电场内迁移所受到的力（F）与
电场强度（E）及蛋白分子的净电荷成正比
关系。
精品课件
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区带电泳 ：是在半固相或胶状介质上 加上一个点或一薄层样品溶液，然后加电 场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。
是应用最广泛的电泳技术之一。
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精品课件
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按电场分：常压（<500V，适用大分 子）、高压（>500V，适用小分子） 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式
③ 表面活性剂的存在会影响蛋白分子间的相互 作用，同时消除了不同蛋白质分子的固有电 荷差异。
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从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum 用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后， 开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、 醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等） 作为支持介质的区带电泳方法。
精品课件
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1959年Raymond和Weintraub利用人工合 成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰 胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分 辨率，开创了近代电泳的新时代。30多年 来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和 分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生 物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析 鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度： 即"电泳纯"（一维电泳一条带或二维电泳 一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被 人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的 最后、最准确的手段，即"Last Check"