血清及若干配方

有关血清的常见问题血清是细胞培养中最重要的元素之一。

因此，我们特别整理了一些实验室里常会遇到的问题，供大家参考：1、保存血清最好的方法是什么？我们建议血清应保存在-5℃至-2O℃。

但是，若存放于4℃时，请勿超过一个月。

若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

反复冻融会对血清的品质造成不良影响。

2、如何解冻血清才不会使产品质量受损?我们建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之溶解，然后在室温下使之全溶。

但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。

3、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?由于GIBCO血清在过滤之前，没有经过预老化(pre-aged)处理，所以在解冻过程（包括没有完全解冻）或储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如凝集素、纤维蛋白原和玻连蛋白等）可能会聚集成团，形成絮状沉淀或外观混浊；在运输过程中，由于时间较长，所以往往有少许解冻，因此也可能稍有沉淀，但这些都不影响血清性能。

若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。

我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。

4.何谓热灭活?一般是以56℃，30分钟来处理已解冻的血清，因为此加热步骤，可以使补体去活化，而补体所参与的反应有:溶细胞，平滑肌的收缩，肥大细胞和血小板组胺的释放，增强吞噬作用，淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。

5、有必要做热灭活吗?实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。

经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。

而经过热灭活的血清，沉淀物的形成会显著增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

因此我们建议您，若非必须，您可以不做热灭活处理血清。

这样，不仅节省您宝贵的时间，更确保血清的质量。

只在做免疫学研究或培养干细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，才推荐做热灭活。

我公司也有已经热灭活的血清可供选择。

6、如何减少沉淀物的产生?我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作:·解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。

·解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生·请勿将血清置于37℃太久。

若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。

·血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，则毋须做此步骤。

·若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。

温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

提醒你注意一下，细胞复苏是速度一定要快，尤其是在-5℃～０℃这阶段，因为在这个温度阶段细胞最容易受损，如果复苏的步骤正确，细胞仍然仍然可以生长，细胞活性损失也不是太大。

细胞复苏的步骤是：一、准备一个1,000ml的烧杯,放入大概三分之二的37℃的温水。

二、从液氮中取出冻存管，迅速放入温水中震荡，尽可能在短时间内使其中的物质融化。

三、将冻存管中的细胞悬液转移到离心管中，然后在1,000转/分钟离心10分钟，弃去上清液。

四、在细胞培养瓶中加入培养液，然后把细胞放入培养瓶中，放入37℃温箱中培养。

经过以上步骤,如果没有什么特殊情况细胞是可以生长的。

可以参考有关细胞培养技术方面的书籍，里面有很多的经典方法．我个人的经验是冻存时细胞密度大概要求５x１０６／ml以上,如果细胞冻存时间只要求半年到一年而已，我建议你用-８０度的冰箱即可，以免时不时需补充氮气．另细胞复苏时一般书籍推荐用37℃的水浴箱，我用的大概是４０℃，因为打开盖子时温度即降，此时能使冻存细胞更好的在半分钟至一分中内解冻。

将含冻存液的细胞移至离心管，加入４倍的培养基，５００转/分钟离心10分钟，弃上清。

用培养基调细胞密度，接种至培养瓶或所需的培养板中培养．关于细胞冻存(1)最好选择对数生长期的细胞用于冻存,在冻存前一天换一次培养液.(2)用胰蛋白酶消化贴壁生长的细胞,离心并计数,去除胰蛋白酶及培养液,加入配制好的冻存液(10%DMSO或甘油),冻存液中细胞的终密度为5x106／ml-5x107／ml,封好冻存管.(3)标准的冻存程序是降温速率-1__-2℃/分钟;当温度降到-25℃以下时,可增至-5__-10℃/分钟;到-100℃时,可迅速浸入液氮中.要适当掌握降温的速度,总之,在开始降温时速度应小于-10℃/分钟.细胞在液氮中储存时间理论上是无限的,,但很多未被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次,观察细胞堆冻存的适应性.这是我的复苏和冻存方法，效果不错，试一试吧。

一、复苏1、从-196℃液氮罐中取出冻存管；2、置37℃水浴快速复温，复温过程中轻轻摇动冻存管；3、将细胞悬液分别移至两个10ml离心管中，添加培养基（含血清），至总体积10ml；4、800转/min，离心10min，弃上清；5、每管加入培养液5ml，用吸管吹打均匀，分装至4个25ml培养瓶中，37℃5%CO2条件下培养。

二、冻存1、冷冻前一日前更换半量培养基，观察细胞生长情形。

2、配制冷冻保存溶液：将甘油加入新鲜培养基中，最后浓度为10％，混合均匀，置于室温下待用。

3、细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液计数细胞浓度为2×106 cells/ml；4、离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为2×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial。

5、冷冻保存方法：冷冻管置于4℃4hours→ -20℃2hours→ -80℃16～18 小时（或过夜）→液氮槽vapor phase 长期储存。

还要注意，复苏的细胞在第1－2周的生长可能不是特别好，最好每天换液，细胞有50－60％融合时就可以传代，以后生长就比较好了。

鼠尾胶原（collegen）：常用的包被培养皿的基质。

1。

75％酒精浸泡大鼠尾巴30min；2。

将尾巴剪开、去掉皮毛，并剪成小段，抽出银色的尾键；3。

把剪碎的尾键置于150ml，0.1％消过毒的醋酸中，4℃放置，并不时振荡；4。

48h后取上清，4000转离心30min后，取上清；分装上清（鼠尾胶）4度保存。

有时可继续向4。

中沉淀中加入10－20ml醋酸，重复以上步骤，以制备更多的鼠尾胶。

由于胶原液不能过滤也不能高压灭菌，所心制取胶原过程当中注意无菌操作。

在使用时待凝胶后，放在紫外线下照射过夜，第二天便可使用。

Percoll溶液的制备操作方法及注意事项1.不同浓度(密度: 先用9份Percoll与1份8.5％NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。

Percoll浓度(％)706050403020比重g／ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.0312.不连续密度梯度Percoll层的制备: 先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。

在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。

3.装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。

4.离心：一般采用离心力为400g，时间20～25min。

由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。

5.取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。

收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。

细胞培养板应该如何消毒我们实验室里细胞板也是重复利用的。

步骤如下：用过的板子用洗洁精泡洗，然后洗净后泡酸液过夜，流水冲洗10次以上，超纯水洗3次，晾干后泡75％酒精6小时以上，放在超净台里开紫外、风机吹干再使用。

结晶紫的配制首先,:含1%结晶紫的无水乙醇,过滤,除去杂质;染色方法:用PBS缓冲液洗细胞1-2次,吸尽残余的液体.加入甲醇固定20分钟,弃固定液,晾干,加入结晶紫染液,染色10-20分钟,弃染色液,用水冲洗干净即可分离单个核细胞实验操作步骤顺便给你分离单个核细胞实验操作步骤（摘自我的毕业论文）1.无菌静脉穿刺采血，肝素抗凝（20 u/ml全血），并加等量生理盐水稀释。

2.在15 ml离心管中加入4 ml淋巴细胞分离液（室温），吸取6 ml经稀释的抗凝血，小心滴加到分离液液面上。

（此步小心操作，勿将血液与分离液混合。

）3.室温下离心，2000 rpm，15 min，离心后液体分4层，从上至下分别为：血浆层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层、红细胞及多形核细胞层。

（附图）4.用吸管小心吸取中间混浊悬浮颗粒层（hPBMC层），转到新的离心管内，每管最多加5 ml细胞悬液，补加PBS至10 ml，吹匀。

5.离心，2000 rpm，10 min，弃上清，再次加10 ml PBS洗涤沉淀。

离心，1500 rpm，6 min，弃上清。

6.每支离心管加3 ml RPMI 1640培养液（含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 u/ml链霉素），吹匀制成细胞悬液。

7.取90 μl细胞悬浮液与10 μl 0.4%台盼蓝溶液加入1.5 ml EP管中，混匀。

8.立即取10 μl混合液从血球计数板计数池上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒置显微镜下观察计数，活细胞不染色，死细胞则为蓝色。

多聚赖氨酸的配制：1．配制硼酸缓冲液（PH8.4）A液：硼砂溶液－－1.907g溶于100ml三蒸水（0.05M）B液：硼酸溶液－－1.237g溶于100ml三蒸水（0.2M）4.5mlA液＋5.5mlB液＝硼酸缓冲液（PH8.4）2. 多聚赖氨酸5mg溶于50ml硼酸缓冲液中，配成100μg/ml的多聚赖氨酸溶液。

过滤除菌，－20度保存。

3. 使用时4倍稀释，可以重复使用3次！支原体污染直接培养法·原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。