蜂蜜中氯霉素的检测

蜂蜜中的氯霉素的测定方法：SPE基质：蜂制品应用编号：101238化合物：氯霉素固定相：ProElut PLS色谱柱/前处理小柱：ProElut PLS 60mg / 3ml 50/pkg商品编号：68003样品前处理：1、提取称取10 g 蜂蜜于50 mL 离心管中，加入10 mL 水，于涡旋混合器上混合3 min，待样品完全溶解后加入20 mL 乙酸乙酯，高速涡旋混合5 min，3000rpm 下离心5 min，上层溶液转入100 mL 烧瓶中。

下层溶液再加入20 mL 乙酸乙酯，高速涡旋混合5 min，3000 rpm 下离心5 min，合并两次上层液于同一烧瓶中，减压浓缩至干，用3×1 mL 20% 的甲醇水溶液溶解残渣，待净化。

2、净化a 活化：依次用3 mL 甲醇和3 mL 水活化ProElut PLS 60 mg/3 mL (Cat.#68003)，流出液弃去；b 上样：将待净化的样品液加入柱中，流出液弃去；c 淋洗：用3 mL 20% 甲醇水溶液淋洗，淋洗液弃去，并将PLS 柱抽干；d 洗脱：用3 mL 甲醇洗脱，收集洗脱液；e 重新溶解：在40 ºC 下用氮气将洗脱液吹至近干，然后用1 mL 40% 甲醇水溶液定容，供HPLC 分析色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18(2) 250 x 4.6 mm ID, 5 μm (Cat. #99603) HPLC应用101320作者：迪马科技文章出处：P109关键字：蜂蜜，氯霉素，SPE，ProElut PLS 摘要：适用于蜂蜜中氯霉素的测定。

图例： 1. 氯霉素。

农产品与食品质量检测技术教学资源库
蜂蜜中氯霉素残留快速检测背景知识
1蜂蜜定义按世界卫生组织（WHO)和联合国粮农组织（FAO)所属的食品法典委员会（CAC)所下的定义：
蜂蜜是蜜蜂从活的植物蜜腺或其他部位采来的花蜜，经蜜蜂充分酿制、储存于巢房的甜蜜物质。

这个定义从蜂蜜的来源、蜂蜜的成熟过程和蜂蜜成品的性质来规定蜂蜜的含义：一是蜂蜜的来源系植物蜜腺的花蜜，也包括甘露蜜，但不包括味糖而产生的“糖蜜”；二是蜂蜜的成熟过程系蜜蜂经过酿制储存在蜂巢内，蜜蜂刚采集的花蜜不是蜂蜜，未成熟的也不是蜂蜜；三是蜂蜜成品系一种具有甜味的物质。

从这个定义可以看出，蜂蜜离不开蜜蜂、植物和蜜蜂的酿造，离开这几个条件就不能算是蜂蜜，所以蜂蜜是无法人造的。

2为什么蜂蜜中会含有氯霉素？
蜜蜂容易感染一种细菌从而产生“幼虫腐烂病”，这种病对蜂产业危害极大，可能导致整个蜂群死亡，而且这种细菌很难完全清除，需要不断处理。

氯霉素是一种强力抗生素，只允许作为药物用于人，而且只在其他手段都无效的情况下使用。

有的蜂场用它来处理蜂房控制幼虫腐烂病，就可能导致蜂蜜中检出氯霉素。

3氯霉素对人体有哪些影响？
氯霉素作为抗生素很高效，但是它可能带来严重的副作用。

有的人对它很敏感，只需要摄入很少的量，就能对骨髓造成伤害，不能产生足够的红细胞、白血细胞或血小板，也就是再生障碍性贫血。

广州市场润至园蜂蜜产品中检出含有氯霉素记者17日从广州市工商局获悉，该局近日对广州市场销售的主要品牌蜂蜜产品进行了抽检，其中，润至园等3个品牌的3批次样品被检出抗生素氯霉素，长期食用将导致人体再生障碍性贫血症，并可能引起人体体内菌群失调及产生耐药性。

记者在不合格产品名单中看到，3批次问题样品分别为：“润至园”老巢蜜膏、“千红”杂花蜜、“蜜蜂生活”高原雪苕蜜。

工商部门表示，是一种由委内瑞拉链丝菌产生的广谱抗生素，属抑菌剂，对很多不同种类的微生物均有作用。

按照《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》(农业部公告第193号)规定，氯霉素被禁止使用在食品、动物方面。

温总理前段时间说了一句话叫：“民以食为天，食以安为先！”温总理这句话，说得很透彻、很深邃。

“安”是什么，“安”代表的是一份安全、一份安定、一种和谐与祥和，对整个国家来说，吃的是这样，住的也是这样。

而如何“安”，怎么“安”，却任重而道远——“安”靠的是“足食”，“安”靠的是“足兵”，“安”更靠的是“民信”。

孔子说：“士不可以不弘毅，任重而道远。

仁以为已任，不亦重乎？死而后己，不亦远乎？”整个国家、整个社会的和谐，靠的是一份“仁”。

“仁”是什么，“仁”就是对别人，对外界的事物有着一份恻隐之心。

这些商贩对上千只生禽没有恻隐之心，只能说明，他们是对自己身边的人没有恻隐之心，他们由于利欲熏心，已丧失了最起码的是非观、道德观，不管是潜规则还是明规则，这种意识都是社会危险信号的一个缩影。

氯霉素是一种抑菌类抗生素，由大卫·戈特利布（David Gottlieb）于1947年从南美洲委内瑞拉的土壤内的委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）成功分离，再于1949年合成并引入临床试验。

是世界上首种完全由合成方法大量制造的广谱抗生素，对很多不同种类的微生物均起著作用。

它因价钱低廉的关系，现时仍然盛行于一些低收入国家；但在其他西方国家经已甚少使用，这是由于它的副作用的关系：会引致致命的再生不良性贫血。

蜂蜜中氯霉素含量标准1. 范围本标准规定了蜂蜜中氯霉素含量的测定方法、限量规定、检验方法、检验规则、标识、标签和说明书的要求，以及包装、运输和贮存的要求。

2. 规范性引用文件本标准引用了下列文件：《食品安全国家标准食品中氯霉素残留量的测定方法》《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》3. 术语和定义本标准采用下列术语和定义：氯霉素：是一种广谱抗菌药物，常用于治疗各种感染性疾病。

蜂蜜（Honey）：是一种天然甜味物质，主要由蜜蜂采集花蜜、花粉等原材料经过发酵、酿造而成。

氯霉素残留量：指在食品中检测到的氯霉素的含量。

4. 氯霉素含量的测定方法本标准采用《食品安全国家标准食品中氯霉素残留量的测定方法》中规定的方法，对蜂蜜中氯霉素含量进行测定。

该方法包括以下步骤：a. 样品处理：称取适量蜂蜜样品，加入适量的乙酸乙酯进行萃取，萃取液经旋转蒸发浓缩至干，用流动相溶解定容。

b. 色谱条件：采用高效液相色谱法，色谱柱为C18柱，流动相为甲醇-水（60:40），流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm，进样体积为20 μL。

c. 标准曲线的制作：分别配制不同浓度的氯霉素标准溶液，进样分析，以峰面积与浓度绘制标准曲线。

d. 样品测定：将处理后的样品进样分析，根据保留时间确定氯霉素的峰，通过峰面积计算样品中氯霉素的含量。

5. 氯霉素含量的限量规定根据《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》的规定，蜂蜜中氯霉素残留量应不得超过0.1μg/kg。

6. 检验方法本标准采用《食品安全国家标准食品中氯霉素残留量的测定方法》所规定的检验方法对蜂蜜中氯霉素含量进行检验。

该方法包括以下步骤：a. 按照4.1.3的规定制备样品溶液。

b. 将样品溶液注入高效液相色谱仪中，按照4.1.4的规定进行色谱分析。

c. 根据保留时间确定氯霉素的峰，通过峰面积计算样品中氯霉素的含量。

d. 根据计算结果与限量规定进行比较，判断样品是否符合要求。

《农产品/食品快速检测技术》课程-微教材知识讲解1、背景知识（1）蜂蜜定义：蜂蜜是蜜蜂从活的植物蜜腺或其他部位采来的花蜜，经蜜蜂充分酿制、储存于巢房的甜蜜物质。

这个定义从蜂蜜的来源、蜂蜜的成熟过程和蜂蜜成品的性质来规定蜂蜜的含义：一是蜂蜜的来源系植物蜜腺的花蜜，也包括甘露蜜，但不包括味糖而产生的“糖蜜”；二是蜂蜜的成熟过程系蜜蜂经过酿制储存在蜂巢内，蜜蜂刚采集的花蜜不是蜂蜜，未成熟的也不是蜂蜜；三是蜂蜜成品系一种具有甜味的物质。

从这个定义可以看出，蜂蜜离不开蜜蜂、植物和蜜蜂的酿造，离开这几个条件就不能算是蜂蜜，所以蜂蜜是无法人造的。

（2）为什么蜂蜜中会含有氯霉素？蜜蜂容易感染一种细菌从而产生“幼虫腐烂病”，这种病对蜂产业危害极大，可能导致整个蜂群死亡，而且这种细菌很难完全清除，需要不断处理。

氯霉素是一种强力抗生素，只允许作为药物用于人，而且只在其他手段都无效的情况下使用。

有的蜂场用它来处理蜂房控制幼虫腐烂病，就可能导致蜂蜜中检出氯霉素。

（3）氯霉素对人体有哪些影响？氯霉素作为抗生素很高效，但是它可能带来严重的副作用。

有的人对它很敏感，只需要摄入很少的量，就能对骨髓造成伤害，不能产生足够的红细胞、白血细胞或血小板，也就是再生障碍性贫血。

2、胶体金速测卡快速检测蜂蜜中氯霉素的原理蜂蜜样品复溶后滴入检测卡的样品孔中，与事先固定于硝酸纤维素膜测试区（T区）的抗原和控制区（C区）的Ⅱ抗反应，根据T区，C区的颜色深浅对比判读结果。

边学边练任务：速测卡快速检测蜂蜜中的氯霉素样品：蜂蜜参考资料：北京普析通用仪器有限公司氯霉素快速检测条（蜂蜜）产品编号：3C20205-001、列出你完成此任务的思路要点：物品准备，样品前处理，检测操作，结果判读2、列出物品准备清单设备：天平、蜗旋仪、离心机、氮吹仪、移液器等。

试剂：氯霉素快速检测试纸条、氯霉素微孔试剂、样品稀释液、乙酸乙酯等试剂。

3、完成样品前处理要点：离心管上做好标记，无结晶的蜂蜜样品，直接将其搅拌均匀，称取4g待检蜂蜜，加入2mL纯净水，完全振荡溶解。

酶联免疫法测定蜂蜜中氯霉素残留量（二）7.1 提取称取2g试样，精确到0.01g，置于25 mL具塞离心管中，加入4 mL水和4 mL(4.2)，在液体混匀器上充分混匀2 min，使试样彻低溶解。

在振荡器上振荡10 min，以4000r/min离心10 min,精确吸取上层1 mL于10 mL具塞试管(5.7)中，用氮气吹干仪在50℃吹干。

加入0.5mL缓冲溶液(4.1.8)溶解残渣，供酶标仪测定。

此溶液含试样量0.5g，稀释系数为1。

7.2 测定条件以下全部操作应在20℃～24℃室温下举行。

7.2.1 酶标仪测定条件：酶标仪测定波长为450 nm。

7.2.2 洗板条件如下： 7.2.2.1 洗板机洗板条件：采纳条式抽干和注满，洗涤次数八次，每次注水量为250uL～350uL。

7.2.2.2 入工洗板条件：洗涤次数五次以上，每次注水量为250 uL。

7.2.3 氯霉素试剂盒中全部试剂的温度均应回升至室温(20℃～24℃)后方可用法。

标准溶液(4.1.2),氯霉素酶标志物溶液(4.1.3)和氯霉素抗体溶液(4.1.4)等均按1份试剂＋10份缓冲溶液举行稀释与制备。

每次测定所用的稀释液均应现配现用。

7.2.4 将测定需用的微孔板备齐并插入微孔架上，记录标准及样品等在微孔架上的位置(模板图)。

7.3 测定测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。

7.3.l 分离吸取50uL稀释的酶标志物、氯霉素标准溶液、样品溶液和氯霉素抗体等按模板图位置，依次加入各自的微孔底部，然后，用封口膜密封孔条以防溶液挥发。

持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20℃～24℃避光孵育2h。

7.3.2 将微孔架置于洗板机上，按设定的洗板程序洗板后，将微孔架反扣在吸水纸上并反复拍打。

此步骤既要去除微孔中过多的残液，又不能使微孔干燥。

7.3.3 快速加入50uL酶基质和50uL发色剂于微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20℃～24℃避光孵育30min。

液相色谱-串联质谱测定蜂蜜中的氯霉素残留刘谦;颜红;王雪涛;淑英;王锋;刘丽丽【摘要】建立肠衣中氯霉素残留的高效液相色谱-串联质谱联用测定方法.该方法经乙酸乙酯和氨水提取样品,以XTerra MS C18柱(100 mm× 2.1mm,3μm)分离,流动相为乙腈-水(33∶67,V/V),电喷雾负离子模式,多反应监测采集模式(MRM)下检测.该法的检出限为0.1 μg/kg,添加水平为0.1～1.0μg/kg时,加标回收率在99.4～115％之间,相对标准偏差为3.34％.【期刊名称】《中国蜂业中旬刊（学术）》【年(卷),期】2012(063)002【总页数】3页(P73-75)【关键词】高效液相色谱—串联质谱法;氯霉素;残留;蜂蜜【作者】刘谦;颜红;王雪涛;淑英;王锋;刘丽丽【作者单位】保定出入境检验检疫局,保定071051;保定出入境检验检疫局,保定071051;保定出入境检验检疫局,保定071051;保定出入境检验检疫局,保定071051;保定出入境检验检疫局,保定071051;保定出入境检验检疫局,保定071051【正文语种】中文【中图分类】S896.8蜂蜜是由蜜蜂采集植物蜜腺分泌的汁液酿成。

中国大部分地区均有生产。

以稠如凝脂、味甜纯正、清洁无杂质、不发酵者为佳。

蜂蜜的主要成分为糖类，其中60～80%是人体容易吸收的葡萄糖和果糖，主要作为营养滋补品、药用和加工蜜饯食品及酿造蜜酒之用，也可以替食糖作调味品。

氯霉素(Chloramphenicol)作为一种广谱的抗生素药，对需氧菌、厌氧菌、衣原体、支原体、立克次氏体等有效，且价格较低，因此早期曾被广泛用于人、畜多种传染性疾病的治疗。

经临床研究发现，氯霉素对人体有严重的副作用，它能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症和血小板减少症等疾病，它在人体、动物肌体中蓄积的时间较长，若长期使用还会出现视神经炎或末梢神经炎等，因此对人类的健康构成了潜在的危害。

蜂蜜中氯霉素残留的快速检测操作说明1样品前处理无结晶的蜂蜜样品，直接将其搅拌均匀，有结晶的样品，在密闭状态下，于50～80℃水浴，待结晶全部融化后搅匀。

称取4g待检蜂蜜，加入2mL纯净水，完全振荡溶解后加入8mL乙酸乙酯，振荡5min，静置分层。

转移5mL上层乙酸乙酯于干净离心管中，若上层乙酸乙酯不足5mL，则可先3000r/min 离心5min后取上层乙酸乙酯，然后50℃下氮气吹干乙酸乙酯。

加入600μL样品稀释液于离心管中，涡旋振荡，直至完全溶解管壁残留，待检。

2检测步骤使用前将试纸条、微孔试剂和待检样本恢复至室温（20℃～25℃）。

将所需微孔试剂置于空微孔板架中。

用移液器移取200μL待检样本于微孔试剂中，缓慢抽吸至检测样品与微孔试剂充分混匀，大约5～6次，使用计时器，开始计时。

室温（20℃～25℃）孵育2min，从试剂桶中取出所需数量的试纸条并插入微孔试剂中，使印有LOGO手柄端向上，另一端向下并充分浸入溶液中，开始计时。

再次室温（20℃～25℃）反应5min，取出试纸条并在2min内进行结果判读，其他时间判读结果无效。

3 结果判读阴性：T线比C线显色深或一样深，表示样品中待检测物质浓度低于检测限，或不含待检测物质。

阳性：T线比C线浅或T线无显色，则表示样品中待检测物质浓度高于检测限。

无效：C线不显色，无论T线是否显色，该检测均判为无效。

4注意事项打开微孔试剂时，请轻轻揭开密封膜，切勿用力迅速揭开，以免有粉末飞出；微孔试剂打开后请在一个小时内使用完，否则失效，影响检测效果；在产品未使用完之前，切勿将桶中干燥剂丢弃；检测时避免阳光直射和风扇直吹；所检测牛奶样品必须为均匀液体，不能有结块、发酸和沉淀等现象；本检测方式为筛选方法，如遇阳性样本，请按照规定的标准进行取样，用确证法进行确证。

蜂蜜中喹诺酮类、四环素类、氯霉素类抗生素的液相色谱-串联质谱测定法杜洪淼(北京市产品质量监督检验院，北京101300)[摘要]建立同时测定蜂蜜中喹诺酮类、四环素类、氯霉素的液相色谱-串联质谱法。

样品以乙腈-水(0.2 %甲酸)(体积比80∶20)溶液超声提取，离心，取上清液过Oasis PRIME HLB固相萃取柱，流出液2 mL氮吹近干，用1 mL 0.1%甲酸水∶乙腈(95∶5)定容至1 mL，过PTFE滤膜，LC-MS/MS正负离子同时扫描测定喹诺酮类、四环素类、氯霉素类抗生素的含量。

该方法的线性范围0.5~50 ng/mL，相关系数＞0.995，加标0.5~20.0 μg/kg，回收率为71.5 %~104.5 %，RSD为1.9 %~9.6 %，喹诺酮类检出限为1.0 μg/kg，四环素类检出限为2.0 μg/kg，氯霉素类检出限为0.5 μg/kg。

结论：该方法灵敏、快速、准确，适用于蜂蜜的喹诺酮、四环素、氯霉素检测。

[关键词]蜂蜜；喹诺酮类；四环素类；氯霉素类；正负离子[中图分类号]O65 [文献标识码]A [文章编号]1007-1865(2020)11-0202-04 Simultaneous Determination of Quinolones Tetracyclines and ChloramphenicolsinHoney by UPLC-MS/MSDu Hongmiao(Beijing Products Quality Supervisionand Inspection Institute, Beijing 101300, China) Abstract:A method for simultaneous determination ofQuinolones Tetracyclines and Chloramphenicols in honey was developed by means of a series mass spectrometry(MS)methods. After the sample was ultrasound extracted from acetonitrile-water(0.2% formate)(volume fraction 80∶20)aqueous solution, centrifugation, Purification of samples with Oasis Prime HLB, Take out 2mL of outflow liquid, blow it to dryness with nitrogen, use 1mL of water containing 0.1% formic acid∶acetonitrile (95∶5) to constant volume to 1mL, filter it with PTFE filter membrane, The UPLC-MS/MS method detection of positive and negative ions was used to qualitatively and quantitatively determine multiple antibiotic residues in honey simultaneously.The results showed that the linear relationship of the drugs to be tested was good in the range of 0.5ng/mL to 50ng/mL.and the correlation coefficient(r)was all above 0.995.Addition recovery experiments were conducted at 0.5~20.0μg/kg concentration levels,the average recovery rate was between 71.5%and 104.5%,and the relative standard deviation ranged from 1.9% to 9.6%.The detection limit of the developed method reached up to Quinolones1μg/kg.Tetracyclines2μg/kg.Chloramphenicols0.5μg/kg.The method has high sensitivity,short analysis time and strong corroboration ability,which is recommended to be used in simultaneous determination of Quinolones, tetracyclines and Chloramphenicols residues.Keywords:honey；Quinolones；Tetracyclines；Chloramphenicols；detection of positive and negative ions蜂蜜中含有丰富的果糖和葡萄糖，不仅能够改善人体的血液循环、补充营养和恢复人体疲劳，还能起到润肺止咳、消积通便等作用，因此，随着人民生活水平逐渐提高，蜂蜜的消费需求量逐年增大。

蜂蜜中氯霉素残留量的直接竞争ELISA检测一、试验目的把握蜂蜜中氯霉素残留的挺直竞争EL[SA检测的原理和办法。

二、试验原理挺直竞争ELISA是ELISA的一种。

样品中残留的氯霉素与氯霉素酶标志物共同竞争包被于酶标板微孔内的氯霉素抗体，形成的酶标志抗原抗体复合物被吸附于微孔内，加底物显色后，于450nm处测定吸光度，吸光度大小与样品中氯霉素的残留量成反比。

以标准品为对比，按照吸光度计算出样品中氯霉素的残留量。

三、仪器与试材 1．仪器与器材酶标仪、各种规格的移液器、离心机、氮气吹干仪、液体混匀器、振荡器等。

2．试剂除特殊注明外，试验中所用试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。

(1)ELISA试剂盒：包含包被有抗氯霉素抗体的96孔酶标板、氯霉素标准溶液、氯霉素酶标志物溶液、酶底物、发色剂、反应终止液、缓冲溶液等。

(2)试剂：乙酸乙酯(重蒸馏)。

3．试验材料 2～3种蜂蜜，各1()00g。

四、试验步骤 1．样品的预处理对无结晶的试验室样品，将其搅拌匀称。

对有结晶的试验室样品，在密闭的状况下，置于不超过60℃的水浴中加热、振荡，待样品所有溶化后搅匀，冷却至室温。

取500g作为试验样品。

制备好的试样置于样品瓶中，密封，并加以标识，于室温下保存。

2．样品提取取2．00g样品，置于25mL具塞离心管中，加4mL水和4mL乙酸乙酯，于液体混匀器上充分混匀2min，使试样彻低溶解。

在振荡器上振荡10min，以4000r ／min离心10min。

吸取上层乙酸乙酯1mL于10mL具塞试管中，用氮气吹干仪在50℃吹干。

加O．5mL缓冲溶液溶解残渣，得样品提取液。

3．测定 (1)标准曲线的绘制①分离吸取50μL系列稀释的氯霉素标准溶液与适当稀释的酶标志氯霉素，加入酶标板微孔内，重复数为3，混匀后，于37℃避光保温1h。

以稀释缓冲溶液洗酶标板5次，每次3min，扣干。

②加50μL酶底物与50μL发色剂于微孔内，混匀，于37℃避光保温30min。