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第四章抗微生物药物和敏感性试验1

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抗菌药物敏感试验+细菌耐药性检测

抗菌药物敏感试验+细菌耐药性检测

9
稀释法的特点
? 定量的药敏试验，测定MIC 、MBC 。 ? 方法比较繁琐，手工操作一般不作为常规试验，常
用于调查罕见耐药。 ? 自动微生物鉴定药敏分析系统采用微量稀释法检测
MIC 。
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二、纸片扩散法（ disc diffusion test)
原理：
（Kirby-Bauer 法）
? 将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有测试菌的琼脂平板上。 抗菌药物向琼脂四周扩散形成递减的梯度浓度。
5
6
CLSI 标准 治疗浓度的上限 即表中的 R
治疗浓度
治疗浓度的下限 即表中的 S
耐药
中介耐药 敏感
MIC
7
第一节、抗菌药物敏感性试验方法
需氧和兼性厌氧菌
8
需氧和兼性厌氧菌药敏试验的方法
? 稀释法 ? 肉汤稀释法（试管稀释法） ? 琼脂稀释法（平板稀释法）
? 纸片扩散法（纸片法） ? E-试验 ? 联合药物敏感试验
的效果之和； 20％～25％
? 相加作用：它们联用时的效果 等于单用两种抗生素效果
之和； 60％～70％
? 无关作用： 两种抗生素联用的效果， 仅相当于其中一种 具有较强作用的抗生素的效果；
3
血药浓度与 MIC之间的关系
耐药
上限
中介耐药
下限
敏感
4
敏感和耐药的概念
抗菌药物的治疗浓度与MIC 的关系：
? 若MIC 小于治疗浓度， 则为“敏感”（Sensitive , S ），推荐使用。
? 若MIC 大于治疗浓度， 则为“耐药”（ Resistant , R ）；
? 若MIC 介于治疗浓度的上下限之间 ， 则为“中度耐药”（ Intermediate , I ）或中度敏感
抗微生物药物敏感性试验执行标准

抗微生物药物敏感性试验执行标准

达成共识的过程 CLSI 自愿达成共识的过程是确定以下内容的标准草案的过程： ·标准草案的认可 ·文件的形成与公开评议 ·针对实验室使用者的评论意见对文件进行修订 ·文件被接受为临床实验室标准 CLSI 的绝大多数文件要经历两个水平的一致评议----“建议性的”与“批准的”，根据需要，文件 也可以在中间水平接受一致评议。 建议性的：作为建议的标准和指南，CLSI 的文件要接受临床试验的第一阶段评议。文件要接受广泛 的、彻底的技术评估，包括对范围、方法、实用性的整体评估和对技术内容、评论内容的详细评估。 批准的：已批准的标准或指南在医疗保健界已获得共识。进行评议的目的是确定最终文件的实用性， 保证已达成的共识（即充分考虑对早期版本的评论意见），并且确定是否需要其他达成共识的文件。 CLSI 的标准和指南代表了优秀实验室实践的一致意见，也反映了在使用既定的 CLSI 步骤时，那些 深受其影响的、有法定资格且对此感兴趣的参与者之间取得了广泛一致。CLSI 的标准和指南的规定 可能比实用规则更严格或更宽松。因此，遵循这些自愿标准或指南的使用者仍然有义务遵循实用规 则。
评论 实验室使用者的评论对于达成共识时必不可少的，任何人都可以提交一份评论意见，而编写文件的 委员会按照达成共识的原则，对所有评论意见加以考虑。有些评论使得文件在下一次一致评论水平 出版时有所变动，其他评论并没有导致文件发生变化，但对所有这些评论，委员会都会在文件后以 附录形式作出回应。我们肯切希望读者在任何时间以任何形式对 CLSI 的任何文件提出评论意见。评 论可发往 CLSI 行政办公室，940 West Valley Road, Suite 1400. Wayne, Pennsylvania 19087,USA。
2006 年 1 月
M100-S16 Vol. 26 No. 3 代替 M100-S15 Vol. 25 No. 1
临床微生物学与检验

临床微生物学与检验


4.用镊子将E-TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表 4.用镊子将E TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表 面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置 面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置 6条，9mm平板只能放置1～2试条 。 条，9mm平板只能放置1 5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。 5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。
第四章 抗菌药物的敏感性试验
徐元宏
常用方法：
纸片扩散法 微量液体稀释法 E-TEST法 TEST法
原理：
纸片扩散法（Kirby纸片扩散法（KirbyBauer法 Bauer法）
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼 脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减 的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试 菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈 即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏 感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。 感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 浓度10 CFU/ml。 浓度105 CFU/ml。
6.用微量加样器接种100μl 6.用微量加样器接种100μl 到96孔中，盖上盖板。 96孔中，盖上盖板。 同时作阳性、阴性对照。
6.根据选择的菌株挑选相应的抗菌纸片。 6.根据选择的菌株挑选相应的抗菌纸片。
肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/ 肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/ 他唑巴坦、头孢噻肟、环丙沙星、亚胺培 南、氨曲南、庆大霉素； 铜绿假单胞菌：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、 阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南； 阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南； 葡萄球菌属：头孢西丁、青霉素、红霉素、万古霉 素、环丙沙星、庆大霉素、利福平 ；
001-药物敏感试验

001-药物敏感试验

抗菌药物实验方法――药敏试验由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药，细菌的耐药性问题正变得越来越突出，不少耐药菌株可耐受多种抗生素。

由此而造成的危害十分严重，它不仅使抗菌药的疗效降低，疗程延长，死亡率升高和治疗费用增加。

这不仅给养殖业带来巨大的经济损失，而且耐药菌株可能会将耐药性基因由动物转移给人类，对人类健康也造成潜在威胁。

专家强调指出，临床上应合理应用抗菌药，以避免或减少耐药性的产生，而合理应用抗菌药控制畜禽疾病的一项重要内容就是通过药敏试验指导临床用药，以充分发挥抗菌药疗效，并尽可能减少其不良影响。

目前由各种细菌所引起的疾病给畜禽养殖业带来严重经济损失，阻碍了养殖业的快速发展和经济效益，所以使用抗菌药预防和治疗细菌性疾病成了畜禽养殖过程中的一项重要工作。

但由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药，细菌的耐药性问题正变得越来越突出，不少耐药菌株可耐受多种抗生素。

由此而造成的危害十分严重，它不仅使抗菌药的疗效降低，疗程延长，死亡率升高和治疗费用增加。

这不仅给养殖业带来巨大的经济损失，而且耐药菌株可能会将耐药性基因由动物转移给人类，对人类健康也造成潜在威胁。

因此，临床上应合理应用抗菌药，以避免或减少耐药性的产生，而合理应用抗菌药控制畜禽疾病的一项重要内容就是通过药敏试验指导临床用药，以充分发挥抗菌药疗效，并尽可能减少其不良影响。

一、什么是药敏试验？抗菌药物敏感性试验（Antimicrobial susceptibility test，AST），简称药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药。

药敏试验是兽医临床工作中的一项基本技能，也是使用抗菌药物治疗前必不可少的一道环节。

二、药敏试验的意义1、可以相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药的敏感性，指导临床合理用药。

因为实验是在体外对已经分离的细菌进行药敏，不需要生物载体，不需要实验动物，操作相对简单，成本相对降低。

抗微生物药物和敏感性试验-精品医学课件

抗微生物药物和敏感性试验-精品医学课件

物体表面，用浸湿无菌生理盐水的棉拭子在规格板内来回 涂抹10次，然后在平板上进行涂布接种。 计算公式为：
菌落数（CFU）/ cm2 = 菌落数/ 采样面积
2.压印法
用直径5cm的特制平皿（Rodac平皿），倾注于16.5ml琼 脂后可使培养基高出平皿口1~2mm，凝固后将平皿上的琼 脂直接压贴于物体表面10~20s，接触面积为19.63平方厘米。
2.对居住环境、特殊病房、实验室、无菌车间等场所空气质量 的细菌学评价。
实验目的
掌握医院感染的微生物监测方法
目的与要求
器材与试剂
器材与试剂
普通琼脂平板（直径90mm及60mm)、无菌生理盐水、无菌 棉拭子等。
步骤与方法
一、空气中细菌含量的检测
1.检测对象：医院各个科室的空气，手术室、新生儿室、产房、 烧伤病房、重症监护室等空气污染的检测，应成为医院感染 管理中特别关注的重点。
2. 用无菌棉拭子蘸取菌液,在管内壁将多余菌液旋转 挤去后在琼脂表面均匀涂布接种3次,每次旋转平板 60度,最后沿平板内缘涂抹1周。
3. 平板置室温下3-5分种后，用纸片分离器或无菌镊 将含药纸片贴于琼脂表面,各纸片中心相距应大于 24mm,纸片距平板内缘应大于15mm。（纸片选 择参照实验书p39）
药敏实验与医院感染的检测
一、抗菌药物敏感试验
抗菌药物敏感性试验
纸片琼脂扩散法
经世界卫生组织推荐,目前各国临床微生物学实验 室广泛采用的标准纸片扩散法是由Kirby和Bauer 所建立的纸片琼脂法,即Kirby-Bauer法(K-B法纸 片琼脂扩散法)
实验原理
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板 上,纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片 周围扩散形成递减的梯度浓度,在纸片周围抑菌浓度范围内 测试菌的生长被抑制,从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌 圈.抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。
抗菌药物敏感试验

抗菌药物敏感试验


操作方法：1.抗菌药物的稀释和融解
2.抗菌药物母液的稀释
3.在微量聚乙烯微板孔中加各种不同浓度的抗生素 100μl，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管。
4.挑选18~24小时的菌落置M-H肉汤增菌4~6小时。
5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 浓度105 CFU/ml。
除肺炎链球菌外的其他链球菌：红霉素、青霉素、克 林霉素、万古霉素、头孢曲松、左氧氟沙星。
7.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂 的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中 心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。
8.经过35℃16～24h孵育。
9.取抑菌环直径，根据 CLSI（clinical and laboratory standards institute ）标准，报 告细菌对该抗生素 敏感(susceptible,S)、 耐药(resistant,R)、 中介(intermediate,I)。
纸片扩散法（KirbyBauer法）
原理：
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼 脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减 的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试 菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈 即为抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏 感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
第四章 抗菌药物的敏感性试验
药敏试验的意义
1、可预测抗菌治疗的效果 2、指导临床抗菌药物的使用 3、发现或提示细菌耐药机制，帮助临床医生合理使 用抗菌药物 4、监测细菌的耐用性，分析耐药菌的变化，预防和 控制耐药菌感染的发生和流行
抗菌药物的敏感性试验
常用方法：
第三十四篇抗微生物药物与敏感性试验ppt课件

第三十四篇抗微生物药物与敏感性试验ppt课件

2019 17
(二)培养基和抗菌药物纸片
1．抗菌药物纸片 选择直径为6．35mm， 吸水量为20μl的专用药敏纸片用逐 片加样或浸泡方法使每片含药量达规 定所示。含药纸片密封贮存2℃－8℃ 且不超过1周。 2．培养基 水解酪蛋白（MH）培养基是 兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培 养基，4℃保存。
2019 18
2019
-
5
五、喹诺酮类抗生素 第一代为窄谱抗生素，有新恶酸、奈啶 酸和恶喹酸。 第二代为广谱类抗生素，抗菌强度依次 为环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙 星、氟咯沙星、培氟沙星、诺氟 沙星。 第三代为超广谱类抗生素，有司帕沙星、 妥舒沙星、左氟沙星等。
2019 6
六、大环内酯类抗生素，常用的有红霉素、 柱晶白霉素、麦迪霉素、乙酰螺旋霉素。 七、四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素 （一）四环素为广谱抗生素，抗菌活性 的顺序为米诺环素＞多西环素＞美他 环素＞地美环素。
五、E 试 验
（一）原理
E试条是一条 5mm×50mm的无孔试剂载体，一 面固定有预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释 抗生素，另一面有读数和判别的刻度。将E试条放 在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕 试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交 点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度， 又称抑制浓度（IC），它与MIC呈高度相关。
2019 12
C组药物用于对A组药物耐药的流行菌株或 对A组药物过敏的病人和某些不常见的细菌 （如肠外分离的沙门菌属或耐万古霉素肠 球菌）。 U组仅用于尿道中分离的细菌，不作为尿道 外分离菌的常规药敏试验。
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(一）非苛养菌药敏试验抗生素的选用
A组一级试验并常规报告的抗微生物药 , 如葡萄球菌属用苯唑西林和青霉素。 B组一级试验有选择报告的抗微生物药 , 如肠球菌属用万古霉素 。 C组补充试验有选择报告的抗微生物药， 如葡萄球菌属用氯霉素 。 U组仅用于泌尿道的补充实验的抗微生物 药，如葡萄球菌属用洛美沙星和诺氟沙星。
抗微生物药物和敏感性试验

抗微生物药物和敏感性试验

确度为10mm的游标卡尺量取抑菌环直径 参 的游标卡尺量取抑菌环直径,参 用精确度为 的游标卡尺量取抑菌环直径 照标准解释结果.根椐常规剂量给药后测定药物能 照标准解释结果 根椐常规剂量给药后测定药物能 在体内达到的血药浓度将抗菌药物敏感性标准分 为以下三级 敏感(susceptible):表示测试菌能被测定药物常规剂量 敏感
临床常用抗生素
青霉素类 头孢菌素类 其他β-内酰胺类抗生素 其他 内酰胺类抗生素 氨基糖苷类 喹诺酮类 大环内酯类 四环素、 四环素、氯霉素和林可霉素类 糖肽类 磺胺类 其他合成抗菌药物
临床常用抗生素
注： 抗微生物新药不断涌现,给感染性疾病的治疗带来福 音。 抗菌药物的使用不当可促进耐药菌在病人体内和医 院环境中定殖繁衍导致交叉感染和内源性感染。 合理使用抗菌药物的前提是重视感染病原学的实验 室检查和监控抗感染治疗的药物选择.
（二）分类：1.液体稀释法 分类： 液体稀释法
2.琼脂稀释法 琼脂稀释法
抗菌药物敏感性试验
其他
1.结核杆菌的药敏试验 结核杆菌的药敏试验 2.厌氧菌的药物敏感试验 厌氧菌的药物敏感试验 3.真菌的药物敏感试验 真菌的药物敏感试验
抗菌药物敏感性试验
特殊耐药菌检测 （一）耐甲氧西林葡萄球菌检测
金葡菌： 苯唑西林抑菌圈 苯唑西林抑菌圈≦ 金葡菌：1ug苯唑西林抑菌圈≦10mm或MIC≧0.4ug/ml 或 ≧ 凝固酶阴性葡萄球菌： 苯唑西林抑菌圈≦ 凝固酶阴性葡萄球菌： 1ug苯唑西林抑菌圈≦17mm 苯唑西林抑菌圈
抗菌药物敏感性试验
(七) 质量控制 七
采用标准菌株金葡菌ATCC25923,大肠埃希菌 大肠埃希菌ATCC25922 采用标准菌株金葡菌 大肠埃希菌 和铜绿假单胞菌ATCC27853等与测试菌在同一条件下做药 和铜绿假单胞菌 等与测试菌在同一条件下做药 敏试验 标准菌株的抑菌圈应落在预期范围内.如果超出范围 如果超出范围,则不应 标准菌株的抑菌圈应落在预期范围内 如果超出范围 则不应 发出报告,及时检查原因 予以纠正 发出报告 及时检查原因,予以纠正 及时检查原因 每日标准菌株的测定结果应以抑菌圈直径为纵坐标,天数为 每日标准菌株的测定结果应以抑菌圈直径为纵坐标 天数为 横坐标绘制室内质控图,要求每天抑菌圈变化数不得超过 横坐标绘制室内质控图 要求每天抑菌圈变化数不得超过 2mm 标准菌株应每周在MH琼脂上传代一次 ℃保存 琼脂上传代一次,4℃ 标准菌株应每周在 琼脂上传代一次
抗微生物药物和敏感性试验

抗微生物药物和敏感性试验

（2）自动仪器 Vitek，Microscan， Phoenix
（3）分子试验 PCR直接检测mecA基因 （4）酶试验 Nitrocefin、ESBL检测
精选ppt
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（五）结果的解释和报告
▪ R、I、S、MIC ▪ 时间依赖性：β-内酰胺类，缩短投药间隔 ▪ 浓度依赖性：氨基糖苷类，日剂量1次应用
精选ppt
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（一）实验原理
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的 琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分 溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度， 在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制， 从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程 度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
未经解释、就事论事的报告经过解释、全面的报告
表型的检测耐药机制的检测、耐药流行病学分析
临床用药
Medical choice Bacteriological choice精选ppt17
二、AST的意义***
▪ 可预测抗菌药物治疗的效果，即AST实验“敏感”时，
治疗可能有效；实验结果为耐药时，使用该药物治疗 肯定失败；
精选ppt
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三要素 药物、机体、病原菌
相关性 体外和体内，抑菌和杀菌，单独和联合
预测性 耐药表型(个体)→耐药机制→耐药表型(同类)
(预测药物)
(同类药物)
重点监测的耐药菌株：MRS, PRP, VRE, ESBL
发出有选择、有解释的报告，与医师直接对话
精选ppt
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小结
药敏试验
ASTART，用体外试验预测体内结果
精选ppt
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(二）苛养菌药敏试验抗生素的选用
微生物抗药性耐药性

微生物抗药性耐药性

微生物对抗微生物药的敏感性和耐药性微生物对抗微生物药的敏感性和耐药性【抗微生物敏感性】细菌为常见的重要病原微生物，各种病原菌对不同的抗菌药物有不同的敏感性。

测定敏感性的方法称为药物敏感试验，即在体外通过被检测药液的稀释（试管法、微量法、平板法）或扩散（纸片法），测定抗菌药物对病原微生物有无抑制或杀灭作用。

在试管法中以抑制细菌生长为评定标准时可用最低抑菌浓度( Minimal Inhibitorv Concentra-tion，MIC)表示，在一批实验中能抑制50%或90%受试菌所需MIC，分别称为MICso 和MIC90。

以杀灭细菌，使活菌总数减少99%或99 .9%以上为评定标准时，称为最低杀菌浓度(MinimalBactericidal Concentration，MBC)。

其单位均为/ig/mL或mg/L。

通常根据抗菌药物对某一细菌的MIC．结合该药的常用剂量所能达到的血药浓度划定细菌对各种抗菌药物敏感或耐药的界限。

其标准是当一种细菌引起的感染用某种药物的常用量治疗有效，即常规用药时达到的平均血药浓度超过MIC5倍以上者为高度敏感；当细菌引起的感染仅在应用高剂量药物时才有效，即常规用药时达到的平均血浓度相当于或略高于MIC为中度敏感；低于MIC或细菌能产生灭活抗菌药物的酶时均判定该菌对该药为耐药。

纸片法操作较简单，适用于生长较快的需氧菌和兼性厌氧菌的药敏测定。

细菌对抗菌药物的敏感度以纸片周围抑菌圈直径大小为标准，其直径与药物对细菌的MIC成反比，抑菌圈越大，说明细菌对该抗菌药物愈敏感，一般的判定标准为：抑菌圈直径> 20mm 为极度敏感，15.1 - 20mm为高度敏感。

10 - 15mm为中度敏感，<lOmm为耐药。

抗菌药物一般按常用量在血液和组织中的药物浓度所具备的杀菌或抑菌性能，分为杀菌剂和抑菌剂两类。

前者MBC约等于其MIC，包括青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、多黏菌素类等；后者的MBC远大于其MIC，包括四环素类、大环内酯类、磺胺类等。

（整理）各种微生物生化试验方法原理.

（整理）各种微生物生化试验方法原理.

（整理）各种微⽣物⽣化试验⽅法原理.各种微⽣物⽣化试验⽅法原理通常利⽤⽣化试验的⽅法，检测细菌对各种物质的代谢作⽤及其代谢产物，称为细菌的⽣化反应，常⽤于细菌的鉴别。

1、糖类分解产物（1）糖发酵试验（carbohydrate fermentation test）不同种类的细菌对糖的分解利⽤能⼒不同，⼀般以能否分解某种糖，是否产酸产⽓等现象来鉴别。

例如⼤肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖，产酸且产⽓；⽽伤寒杆菌只分解葡萄糖产酸不产⽓，且不分解乳糖。

这是因为⼤肠杆菌分解葡萄糖等产⽣甲酸，经甲酸解氢酶的作⽤⽣成H2和CO2。

⽽伤寒杆菌⽆此酶，故分解葡萄糖只产酸不产⽓。

（2）VP试验（V oges-Proskauer test）产⽓杆菌将分解葡萄糖产⽣的两分⼦丙酮酸脱羧，⽣成⼀分⼦⼄酰甲基甲醇。

⼄酰甲基甲醇在碱性溶液中被空⽓中氧⽓氧化，⽣成⼆⼄酰，⼆⼄酰可与培养液中含胍基的化合物（如蛋⽩胨中的精氨酸）反应，⽣成红⾊的化合物，此为VP试验阳性。

⼤肠杆菌分解葡萄糖不⽣成⼄酰甲基甲醇，故VP试验阴性。

（3）甲基红试验（methyl red test）⼤肠杆菌和产⽓杆菌均属G-短杆菌，且都能分解葡萄糖、乳糖产酸产⽓，⼆者不易区别。

但两者所产⽣的酸类和总酸量不⼀：⼤肠杆菌可产⽣甲酸、⼄酸、乳酸、琥珀酸等，⽽产⽓杆菌只产⽣甲酸、⼄醇及⼄酰甲基甲醇。

故⼤肠杆菌培养液PH在4.5以下，加⼊甲基红指⽰剂呈红⾊，为甲基红试验阳性；产⽓杆菌培养液PH在5.4以上，加⼊甲基红后呈桔黄⾊，为甲基红试验阴性。

（4）枸橼酸盐利⽤试验(citrate utilization test）产⽓杆菌在以枸橼酸盐为唯⼀碳源的培养基上⽣长，分解枸橼酸盐产⽣CO2，并转变为碳酸盐，使培养基由中性变为碱性，含溴麝⾹草酚蓝（BTB）指⽰剂的培养基由淡绿⾊变为深兰⾊，此为枸橼酸盐利⽤试验阳性。

⼤肠杆菌不能利⽤枸橼酸盐，故在此培养基上不能⽣长，培养基仍为绿⾊。

2、蛋⽩质及氨基酸的分解产物（1）硫化氢试验（hydrogen sulfide test）有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、甲硫氨酸等）产⽣H2S，如遇醋酸铅或硫酸亚铁，能⽣成⿊⾊的硫化物，为硫化氢试验阳性。

临床医学检验：抗微生物药物和敏感性试药真题及答案一

临床医学检验：抗微生物药物和敏感性试药真题及答案一1、判断题A群链球菌对杆菌肽的敏感率几乎100%，所以一旦试验结果敏感即可确认该链球菌为A群，敏感判定标准为抑菌环直径＞10mm。

()正确答案：对2、单选（江南博哥）目前最强的抗绿脓杆菌抗生素是（）A.普鲁卡因青霉素B.羧苄青霉素C.先锋霉素ⅣD.头孢他啶E.头孢呋辛正确答案：D3、多选关于抗菌药物敏感试验，说法正确的是()A．监测耐药性B．提供所选择药物的依据C．其结果总与体内用药结果相一致D．可预测抗菌治疗的效果E．指导医师选择使用抗生素正确答案：A, B, D, E4、单选下列药物中哪种抗铜绿假单胞菌作用最强（）A.羧苄西林B.替卡西林C.阿莫西林D.呋苄西林E.双氯西林正确答案：D5、单选液体稀释法不适合做药敏试验的是()A．头孢噻肟B．磺胺C．氧氟沙星D．万古霉素E．红霉素正确答案：B6、单选对革兰阳性菌作用弱，对革兰阴性菌包括绿脓杆菌作用强的药物是（）A.第一代头孢菌素B.第二代头孢菌素C.第三代头孢菌素D.第四代头孢菌素E.碳青霉烯类抗生素正确答案：C7、问答?患者刘某，女，40岁，尿频、尿急、尿痛1周，体检：体温38.5℃，明显肾区叩痛，双下肢无水肿。

实验室检查：尿WBC3(+)/HP，偶见白细胞管型。

中段尿培养为大肠埃希菌＞10万CFU/L，纸片扩散法药敏试验结果为头孢噻肟6mm，头孢噻肟/棒酸26mm，头孢他啶21mm，头孢他啶/棒酸27mm，呋喃妥因25mm(中介判定值为15～16mm)。

根据题目中所给出的药敏实验结果，可判断此株菌存在哪种耐药机制，由于这种耐药机制的存在，临床抗生素应用方面应注意哪些问题?正确答案：根据头孢噻肟和头孢他啶加棒酸后比不加棒酸的抑菌环直径均＞5mm，确定此株菌产生超广谱β-内酰胺酶(ESBL)。

临床抗生素应用方应避免使用青霉素类、头孢菌素类和氨曲南，即使这些药物的体外实验显示敏感，临床上也可能治疗无效。

微生物实验 药物敏感实验

微生物药物敏感实验
⏹一、实验目的
⏹1、熟悉和掌握圆纸片扩散法检测细菌对抗菌药物敏感性的操作程序和结果判断方
法。

⏹2、了解药敏试验在实际生产中的重要意义
二、实验原理
⏹将含有定量抗菌药物的纸片（药敏纸片）贴在已接种待检菌的琼脂平板表面特定部
位。

药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散，形成了随着离纸片距离加大，琼脂中的药物浓度逐渐减少的梯度浓度。

其纸片周围一定区域琼脂内的药物浓度高于抑制待检菌所需浓度时，则该区域内细胞不能生长，形成透明抑制圈。

抑菌圈的大小可以反映待检对测定药物的敏感程度，抑菌圈愈大，说明该菌对此药物越敏感三、实验器材
⏹1．菌种大肠埃希菌。

⏹2．培养基牛肉膏蛋白胨培养基。

⏹3．试剂无菌生理盐水，抗菌药物纸片：
包括青霉素、氨苄西林、土霉素、链霉素等。

⏹4．其他无菌棉拭子、镊子、毫米尺、接种环。

四、实验方法和步骤
⏹1．菌液制备
菌浓合适，一般为106
⏹2．接种
细菌悬液制备后15min内接种至倒好的牛肉膏蛋白胨培养基平板中，接种量0.1-0.2mL。

涂布均匀。

⏹3．贴药敏纸片
⏹涂布后的平板在室温下干燥3~5min，用纸片分配器或无菌镊子将纸片贴于琼脂表面
并轻压，使纸片与琼脂表面完成接触。

各纸片中心相距应大于24mm，纸片贴上后就不能再移动位置。

⏹4．培养
⏹将平板倒置放入37℃培养箱培养，16~18h读取结果。

五、实验结果
六、思考题
⏹ 1.圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项？
⏹ 2. 试述药敏试验的意义。

抗微生物药物敏感性试验执行标准

抗微生物药物敏感性试验执行标准抗微生物药物敏感性试验是评价抗菌药物对微生物的作用和微生物对抗菌药物的敏感性的重要手段。

正确执行抗微生物药物敏感性试验，对于指导临床用药、控制细菌耐药性具有重要意义。

本文将详细介绍抗微生物药物敏感性试验的执行标准。

1. 试验菌株的选取。

试验菌株的选取是抗微生物药物敏感性试验的第一步。

应根据临床感染的部位和病原菌的种类，选择相应的菌株进行试验。

同时，应注意菌株的来源、保存和传代方式，以保证试验结果的准确性和可重复性。

2. 试验方法的选择。

根据不同的抗菌药物和微生物，选择合适的试验方法进行抗微生物药物敏感性试验。

常用的试验方法包括纸片扩散法、微量稀释法等。

在选择试验方法时，应考虑到试验的灵敏度、特异性和操作的简便性，并严格按照相关标准进行操作。

3. 试验条件的控制。

试验过程中，应严格控制试验条件，包括温度、湿度、培养基的配制和质量等。

试验操作人员应具备良好的实验操作技能，严格按照操作规程进行操作，避免外界因素对试验结果的影响。

4. 试验结果的解读。

试验结束后，根据试验结果进行解读。

应根据相关标准和临床实际，判断微生物对抗菌药物的敏感性，确定抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）等参数。

同时，应注意对试验结果的统计学分析，确保结果的科学性和可靠性。

5. 结果报告和数据保存。

试验结果应及时进行报告，包括试验方法、试验菌株、试验条件、试验结果等内容。

同时，应将试验过程中的原始数据进行保存，以备查验。

在报告中应注明试验人员、试验时间、试验地点等信息，确保结果的可追溯性和可信度。

6. 质量控制和质量保证。

在抗微生物药物敏感性试验过程中，应严格执行相关质量控制和质量保证程序。

包括对试验菌株的鉴定、对试验方法的验证、对试验条件的控制等方面进行严格管理，确保试验结果的准确性和可靠性。

7. 相关标准和法规的遵守。

在执行抗微生物药物敏感性试验时，应严格遵守相关的标准和法规，包括药典规定、临床实验室质量管理规范等。

抗微生物药物和敏感性试验


小结
1.培养基 MH 肉汤 2.药物稀释 原液配制 稀释抗菌药物的制备 3.菌种接种 4.结果判断 MIC
（二） 琼脂稀释法
将不同浓度抗菌药物分别混匀于琼脂培 养基中，配制出含各种浓度药物的平板， 使用微量多头接种仪接种细菌，孵育后 观察细菌在含不同浓度药物的平板上的 生长情况，以抑制细菌生长的平板所含 的药物浓度测得最低抑菌浓度（MIC）。
四、E 试验（Epsilometer test）
是一种结合了稀释法和扩散法的原理和特 点测定细菌对抗菌药物的敏感度的定量技 术。
（一）原理
E试条是一条5mm×50mm无孔试剂载体， 一面固定有一系列预先制备的浓度呈连续 指数增长稀释抗菌药物，另一面有读数和 判别的刻度。
抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀 释浓度的宽度范围。
4.挑选18~24h的菌落置M-H肉汤增 菌4~6h。
5.制备0.5麦氏比浊管，然后 1:200稀释，使之最终浓度105 CFU/ml。
6.用微量加样器接种 100μ l菌液到96孔中，盖 上盖板。
同时作阳性、阴性对照。
7.手工看浊度或仪器自动 判读。 按照CLSI标准报告细菌 对某抗菌药物为敏感、 耐药和中介。
量 对某些耐药细菌引起的严重感染，联合用
药比单一用药时效果更好。
2.抗菌药物联合用药可出 现4种结果
无关作用 拮抗作用 累加作用 协同作用
(二)联合抑菌试验
棋盘稀释法
第四节 分枝杆菌的药物敏感性试验
第五节厌氧菌体外药物敏感性试验
从左到右依次为常见菌、苛养菌、厌氧菌、酵母菌和其他霉菌的 E 试验结果
五、联合药物敏感性试验
联合药物敏感试验意义 联合抑菌试验 最低杀菌浓度测定

抗微生物药物敏感试验

28
1. β ～内酰胺酶检测
1）碘淀粉法
原理 ：
β -内酰胺酶能裂解青霉素的β -内酰胺酶环形成青霉 素噻唑酸，它与淀粉竞争游离碘，破坏了碘和淀粉的蓝色 复合物，使蓝色变为无色。
结果判定：
当含青霉素培养基内的待测菌加入可溶性淀粉和碘液 后，10分钟内能使蓝色完全消退的待测检为产β -内酰胺 酶阳性株。
2）临床意义 MRS不论其体外药敏试检结果， 所有的β -内酰胺类药物和β -内酰胺抑制剂均无临 床疗效；绝大多数的MRS常示多重耐药，包括氨基 糖苷类、大环内脂类、四环素类。
31
3.耐青霉素肺炎链球菌检测 1)定义 当对1μg苯唑西林纸片的抑菌圈直径
＜20mm或MIC＞0.06应视为耐青霉素肺炎 链球菌（vancomycin resistant enteroccoccus, VRE）
2）微量稀释法（microdilution broth method） 采用微量稀释孔（0.1ml肉汤）
14
结果判定
以在试管内或小孔内完全抑制细菌生长 的最低药物浓度为MIC（μ g/ml）。微量稀 释法时，常借助于比浊计判别是否细菌生 长。
15
临床意义
临床上较为广泛使用的定量耐药性检测 方法。尤其是微量稀释法，已有商品化的 微量稀释板。
菌种的鉴定，并作为医院流行病学调查的 手段之一。
4
体外药敏试验的抗菌药物选择： 结合
本单位、本地区常用的抗菌药物 常见病原菌的耐药现状
确定体外药敏试验抗菌药物的品种。
5
抑菌试验
（一）.纸片扩散法 K-B纸片琼脂扩散法 :是目前各国临床微生物实验
室广泛采用的标准纸片扩散法。
1）原理 ：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接

第4章细菌药敏试验及其耐药表型检测-文档资料


-测试抑菌圈周围的细菌；
-如果β-内酰胺酶阳性,报告青霉素R。
Pos
Neg
超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）
ESBLs是指由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌 素类和单环内酰胺类氨曲南的一类酶；
ESBLs不能水解头霉素类和碳青霉烯类药物，能被 克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等内酰胺酶抑制剂 所抑制；
ESBLs主要见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，此外 也见于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、沙 雷菌属等其他肠杆菌科细菌、不动杆菌、铜绿假单 胞菌。
体积 (mL)
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
CAMHB 最终浓度 (mL) （mg/mL）
9
512
1
256
3
128
7
64
1
32
3
16
7
8
1
4
3
2
7
1
1
0.5
3
0.25
7
0.125
抗菌药物的稀释和融解
肉汤稀释法
4
8
混
16 32 64 128 256 ug/ml 混清
抗生素倍比稀释，种菌105CFU/ml ， 孵育35℃， 16～20h，判读。
E test 法
优点
连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好 影响因素少，稳定性高 操作简单，省时
缺点：昂贵 用途：快生长菌，苛养菌，厌氧菌，酵母菌，
分枝杆菌
2024/7/17
35
评价药物体外抗菌活性的指标
MIC50, MIC90, MIC 均值， MIC 范围，R，I，S MIC50/ MIC90：MIC从小到大排列，位于第50 / 90
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20
③多种微生物感染； ④多部位感染； ⑤感染流行的控制； ⑤对A组抗生素过敏、耐受或无反应。
C组药物用于对A组药物耐药的流行菌株或对A组药
物过敏的病人和某些不常见的细菌（如肠外分
离的沙门菌属或耐万古霉素肠球菌）。 U组仅用于尿道中分离的细菌，不作为尿道外分离 菌的常规药敏试验。
21
(一）非苛养菌药敏试验抗生素的选用
第四章 抗微生物药物敏感实验
1
第一节 临床常用抗菌药物
一、抗细菌药物 二、抗厌氧菌药物
2
抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性的抗生 素和化学合成药物。前者是真菌、放线菌、
细菌等的代谢产物，后者是经化学改造的
半合成抗生素和化学合成药物。
3
（一）β -内酰胺类
1. 青霉素类 2. 头孢菌素类 3. 单环类 4.头霉素类 5. 碳青霉烯类 6.β -内酰胺类/β -内酰胺酶抑制剂
• 提供所选用药物的依据； • 监测耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染病 18 流行病学，控制和预防耐药菌感染的 发生和流行。
第三节 抗菌药物的敏感性试验
19
一、抗菌药物的选择
在标准中分成A、B、C 、 U四组, A组所列的抗生素为常规首选药敏试验药物, B组为临床使用主要抗生素,尤其在医院感染时 使用的抗生素，可在下列情况下使用： ①对A组同类抗生素耐药； ②标本来源不同时，如三代头孢菌素使用于脑脊液中的 肠杆菌，磺胺甲恶唑使用于尿道分离的细菌；
34
5.根据选择的菌株挑选 相应的抗菌纸片。
肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/ 他唑巴 坦、头孢噻肟、环丙沙星、亚胺培 南、氨曲南、庆大霉素； 铜绿假单胞菌：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、 阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺 培南； 葡萄球菌属：头孢西丁、青霉素、红霉素、万古霉 素、环丙沙星、庆大霉素、利福平 ；
35
肠球菌属：青霉素 、万古霉素 、甲氧苄啶/磺胺异 噁唑 、庆大霉素、环丙沙星、红霉素、氨 苄西林 不动杆菌属：头孢他啶 、亚胺培南、阿米卡星、哌拉
西林/他唑巴坦、头孢吡肟 、头孢曲松 、
环丙沙星、米诺环素； 洋葱伯克霍德菌：头孢他啶 、米诺环素、甲氧苄啶/ 磺胺异噁唑 、美罗培南 ；
36
嗜麦芽窄食单胞菌：甲氧苄啶/磺胺异噁唑、左氧氟沙 星、米诺环素 ； 嗜血杆菌属：氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、头孢 他啶、美罗培南、阿奇霉素、环丙沙星、头孢克洛； 淋病奈瑟菌：头孢曲松、环丙沙星、青霉素、大观霉素、
13
（四）方法
（1）手工试验 1.纸片扩散法（S，I，R） 2.稀释法（MIC） 3.E test（MIC） Vitek，Microscan， Phoenix PCR直接检测mecA基因 Nitrocefin、ESBL检测
14
（2）自动仪器
（3）分子试验 （4）酶试验
（五）结果的解释和报告
• R、I、S、MIC
四环素 ；
肺炎链球菌：红霉素 、苯唑西林 、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、 克林霉素、左氧氟沙星、四环素、万古霉素 ； 除肺炎链球菌外的其他链球菌：红霉素、青霉素、克林霉素、 万古霉素、头孢曲松、左氧氟沙星。
37
6.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌 纸片粘贴于M-H琼脂的表面，一 旦纸片贴上，不能移动；各抗菌 纸片中 心距离应大于24mm，纸 片距平板内缘应大于15mm。
4
（二）糖肽类 （三）氯霉素 （四）氨基糖苷类 （五）大环内酯类 （六）四环素类 （七）氟喹诺酮类 （八）磺胺类
5
（九）利福霉素类 （十）林可酰胺类 （十一）恶唑烷酮类 （十二）链阳菌素类 （十三）抗分枝杆菌药物
6
二、抗厌氧菌药物
• • • • 硝基咪唑类 甲硝唑 （Metronidazole） 替硝唑 （Tinidazole） 奥硝唑 （ornidazole）
A组一级试验并常规报告的抗微生物药 ,如葡萄球 菌属用苯唑西林和青霉素。 B组一级试验有选择报告的抗微生物药,如肠球菌 属用万古霉素 。 C组补充试验有选择报告的抗微生物药，如葡萄球 菌属用氯霉素 。 U组仅用于泌尿道的补充实验的抗微生物药，如葡 萄球菌属用洛美沙星和诺氟沙星。
22
(二）苛养菌药敏试验抗生素的选用
25
26
27
(二)培养基和抗菌药物纸片
【抗菌药物纸片】
直径为6.35mm，吸水量为20μ l的专用药 敏纸片. 含药纸片密封贮存2℃～8℃且不超过1周。
【培养基】
水解酪蛋白（MH）培养基，pH为 7.2~7.4，琼脂厚度为4mm,4℃保存。
28
（三）实验方法
29
1.将在约56℃恒温的无菌M-H琼脂倾 注直径为90mm的平板，其厚度 4mm。
16
小结
药敏试验
ASTART，用体外试验预测体内结果 未经解释、就事论事的报告经过解释、全面的报告 表型的检测耐药机制的检测、耐药流行病学分析 临床用药
Medical choice Bacteriological choice
17
二、AST的意义***
• 可预测抗菌药物治疗的效果，即AST实验“敏感”时， 治疗可能有效；实验结果为耐药时，使用该药物治疗 肯定失败； • 指导临床医生选择使用抗生素，AST的结果往往在给 予病人经验性治疗24～48h之后，若AST结果为“敏 感”，该治疗有效，若结果为“耐药”，即应更换药 物；
A组一级试验并常规报告的抗微生物药,如肺 炎链球菌用红霉素和青霉素。
B组一级试验有选择报告的抗微生物药,如肺 炎链球菌用头孢噻肟或头孢曲松。
C组补充试验有选择报告的抗微生物药，如 肺炎链球菌用头孢呋辛 。
23
二、纸片扩散法***
（Kirby-Bauer法） ***
24
（一）实验原理
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌 的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中 水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯 度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的 生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为 抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏 感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
• 时间依赖性：β-内酰胺类，缩短投药间隔
• 浓度依赖性：氨基糖苷类，日剂量1次应用
15
三要素 相关性 预测性
药物、机体、病原菌 体外和体内，抑菌和杀菌，单独和联合 耐药表型(个体)→耐药机制→耐药表型(同类) (预测药物) (同类药物)
重点监测的耐药菌株：MRS, PRP, VRE, ESBL 发出有选择、有解释的报告，与医师直接对话
7
第二节 体外抗菌药物敏感试验
8
一、抗菌药物敏感性试验 （antimicrobial susceptibility test,AST）
（一）定义：AST 是一个检测细菌耐药性的 体外抑菌试验（ART）
AST
（二）
目的 检出细菌对抗生素的耐药性， 预测临床治疗结果 预测 不是指体外测得的数据， 强调对数据的解释 临床 不是指体外AST的结果， 强调病人用药后的疗效 治疗结果 用成功或失败衡量， 强调实验室与临床的统一
10
AST
实验室
S R
临床
成功 失败
评价
正确的预测 正确的预测 错误的预测
11
S（FS？） 失败
AST
体外R≈体内R，对R的结果可以相信
体外S≠体内S，对S的结果应持怀疑态度
12
（三）重要性
如果没有细菌耐药性检测
• • • • • • 治疗过度：用药不当，过度使用高档抗生素 治疗错误：用药错误，危重患者丧失抢救时机 增加不必要的副作用 增加不必要的费用 增加细菌的耐药性 降低医疗服务的质量
中介(intermediate,I)。
40
41
42
38
7.经过35℃16～24h孵育。
39
（四）结果判断和报告
用精确度为1mm的游标卡尺 量取抑菌圈直径。 根据NCCLS （clinical and laboratory standards institute ）标准，报告细菌 对该抗生素 敏感(susceptible,S)、
耐药(resistant,R)、
30
2.无菌挑取孵育16～24h的血 平板上4~5个菌落。
31
3.置于无菌生理盐水中，校正其 浊度于0.5 McFarland氏比浊管浓 度，细菌数量约为1.5×108 cfu/ml
32
4.用无菌棉签浸入 细菌悬液中，将拭 子在试管上壁轻轻 挤压以挤去过多的 菌液。
33
பைடு நூலகம்
4.棉签在三个方向均匀抹 琼脂表面（每次转60℃） 使菌液均匀分布，最后沿 平板内缘涂抹一周。