基因工程综合实验一 康康 生化实验PPT技术文档

接下来实际操作：
2、学习从LB平板挑单克隆, 进行液体培养; 每人练习接种2个克隆；
氨苄青霉素 Amp: 100mg/ml; 1000倍稀释使用 （不加IPTG）；
接下来实际操作：
3.用灭菌的毛笔蘸取pMBP-RFP重组菌液在 IPTG/Amp LB平板上画出任意图案
接下来实际操作：
4、提取pMBP-RFP质粒：每组提取2管；
抗生素不耐热，可以采用过滤灭菌（0.22微米）； 添加方法：固体培养基灭菌冷却到60℃以后添加。
。
接下来实际操作：
1、学习倒LB固体平板; 氨苄青霉素 Amp: 100mg/ml; 1000倍稀释使用;
IPTG：100mg/ml ; 1000倍稀释使用; 每人倒LB固体平板1块；
IPTG:异丙基硫代半乳糖苷，半乳糖结构类似物，作为具有lac或tac等启 动子的表达载体的表达诱导物使用，不被细菌代谢而十分稳定，因此 被实验室广泛应用。
3. 质粒DNA纯化：
方法一
（1）酚/氯仿抽提：使蛋白 质变性并停留于有机相和水 相之间的界面，而DNA存在 于水相之中
（2）盐/乙醇或丙酮沉淀 DNA，高速离心回收DNA
方法二
柱层析：通过硅胶基质过 滤特异吸附DNA和RNA， 与蛋白质分离。
实验操作
质粒DNA的微量快速提取（碱裂解法） (1) 收集细菌：
➢ 酵母粉（Yeast extract）：5克 (0.5%)
➢ 氯化钠：
10克 (1%)
LB固体培养基：
LB培养基中加入1.5%的琼脂粉Agar（质量体积比，即每升培 养基中加入15克），再灭菌。
每小组配制：50ml LB培养基、50ml LBHale Waihona Puke 体培养基LB培养基添加抗生素
• 氨苄青霉素 Amp配制成储备液： 100 mg/ml， 工作浓度：100ug/ml
IPTG/Amp LB平板上画出任意图案 • 第四部分提取质粒
实验原理一
基因工程——重组质粒转化筛选；重组质粒酶切鉴定；质 粒蛋白质表达
质粒提取的基本原理（三个阶段）
1. 细菌的培养： 挑单克隆
LA培养液37℃培养
至OD600nm=0.6-2.0
LB培养基
• 配方：一升水中加入：
➢ 胰蛋白胨（Tryptone）：10克 (1%)
过滤、层析等技术分离 纯化工程蛋白质样品
配料、灌装、冻干
固液灌装：完成介质充填、真空干燥、粉质药 物有效成分的灌装、以及在规定的真空条件下封 口，而且还能清洗、消毒、定量控制等等
重组DNA医药产品
产品 组织胞浆素原激活剂 血液因子VIII 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 促红细胞生成素 生长因子(bFGF, EGF) 生长素 胰岛素 干扰素( 1b, 2a, 2b, ) 白细胞介素 超氧化物歧化酶
取1.4mL过夜培养的菌液（OD600nm≈1）加入 eppendorf离心管中
单克隆抗体
乙肝疫苗(CHO, 酵母) 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗
功能 抗凝 促进凝血 剌激白细胞生成 剌激白细胞生成 刺激细胞生长与分化 治疗侏儒症 治疗糖尿病 抗病毒感染及某些肿瘤 激活、剌激各类白细胞 抗组织损伤 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤 导向治疗 预防乙肝 预防霍乱
2008年度诺贝尔化学奖（1）
• 日裔美国科学家下村修，从维多利亚多管 水母（Aequorea victoria）中分离绿色荧光 蛋白（GFP）（1962－1974年）。
2008年度诺贝尔化学奖（2）
• 美国科学家马丁•查尔非 Martin Chalfie • 用PCR的方法扩增了GFP的编码区，将它克
隆到表达载体中，通过UV或蓝光激发，在 大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的 绿色荧光。这才是GFP作为荧光指示剂的真 正突破 。
2008年度诺贝尔化学奖（3）
• 中国导弹之父钱学森的堂侄； • 美国华裔化学家钱永健；
• 在1995年完成的单点突变（S65T），突变后的GFP激发峰 转移至488 nm，而发射峰仍保持在509 nm，这和常用的 FITC滤光片匹配，提高了GFP的应用潜力。而F64L点突变 则改善了GFP在37℃的折叠能力，综上就产生了增强型 GFP，也就是我们常见的EGFP。
基因工程制药流程：
（1）获得目的基因；（2）构建重组质粒；（3）转化基因 工程菌；（4）培养工程菌；（5）产物分离纯化；（6）除 菌过滤；（7）半成品检定；（8）包装。
分 切
接
转 筛
接种和摇菌
发酵罐（生物反应器）
大规模 扩增工 程菌
工程菌破壁和分离纯化
细胞破壁技术，就是利用 酶解法，化学方法、物理 方法或几种方法配合使用 使细菌细胞壁破裂的方法
荧光蛋白的应用
学习目的
1. 掌握基因工程技术的基本原理； 2. 掌握培养基配制、接种、提取质粒、酶切、电泳、重
组蛋白纯化与鉴定等基本实验技术； 3. 培养良好的科研思维、实验习惯。
本次实验内容
• 第一部分 LB固体平板制作 • 第二部分 从LB平板挑单克隆接种 • 第三部分 用灭菌的毛笔蘸取pMBP-RFP重组菌液在
红色荧光蛋白基因的克隆表达 及蛋白纯化
临床医学专业生物化学实验课 生物化学教研室 康康 kangkang@
什么是基因工程？
主要指在体外将感兴趣的核酸分子组合到载体系统 （分子）中，形成遗传物质的新组合（重组子），并使之 进入原来没有这类分子的宿主体内，而能持续稳定地繁殖， 从而得到大量复制子或感兴趣基因的表达蛋白产物。
基因工程技术路线：
分离目的基因DNA
克隆载体的选择和切割
目的基因与载体的连接
重组DNA导入受体菌
含重组体受体菌的筛选
克隆基因的表达
什么是基因工程制药？
指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质， 然后将控制该蛋白合成过程的基因分离、纯化或进行人工 合成，利用基因工程技术方法生产的新型药物称为基因工 程药物。
实验原理二
质粒提取的基本原理（三个阶段） 2. 细菌的收集和裂解：
离心分离细菌
漂洗
裂解
碱裂解法：
去污剂法 热裂解法 碱裂解法 溶菌酶法
（1）碱环境下，细菌线性染色体DNA、闭合环状质粒 均变性，SDS使蛋白质变性；
（2）调节pH至中性时，质粒DNA恢复原有构型，细菌 染色体DNA、RNA和蛋白质结合形成沉淀，通过离心去 除。