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狂犬病病毒核酸诊断技术研究进展路静(综述);伊正君;付玉荣(审校)【摘要】狂犬病是由狂犬病病毒引起的人兽共患烈性传染病，发病后死亡率几乎为100％。
近年来，我国狂犬病的发病率呈上升趋势，急需一种快速、简便、经济、准确、易于推广的实验室诊断方法。
文中从基于PCR方法的核酸诊断技术、依赖核酸序列扩增技术、环介等温扩增技术、基因芯片技术等方面对目前国内外狂犬病病毒核酸诊断技术作一综述，并分析各种方法的优点和缺点，为狂犬病的临床快速诊断提供参考依据，以更好地预防和控制狂犬病。
%Rabies is a deadly zoonos caused by rabies virus, the case fatality almost is 100%following suffering from this dis-ease.Recently, the incidence of rabies tends to increase in China.A rapid, accurate, economical, simple and convenient, easy to be widely used method for rabies virus detection in laboratory is urgently needed.This paper reviews the nucleic acids diagnosis techniques of rabies virus from the nucleic acids detection methods based on PCR, NASBA, LAMP, Genechips and analyzes the advantages and disadvantagesof the above-mentioned methods, which provides a reference for rapid laboratory diagnosis of rabies virus to efficently prevent and control rabies.【期刊名称】《医学研究生学报》【年(卷),期】2015(000)012【总页数】6页(P1310-1315)【关键词】狂犬病病毒;核酸诊断;依赖核酸序列扩增技术;环介等温扩增技术;基因芯片技术【作者】路静(综述);伊正君;付玉荣(审校)【作者单位】261053 潍坊，潍坊医学院医学检验学系;261053 潍坊，潍坊医学院医学检验学系;261053 潍坊，潍坊医学院病原生物学教研室【正文语种】中文【中图分类】R373.90 引言狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus，RABV)引起的人兽共患烈性传染病，发病后死亡率几乎为100%。
狂犬病毒研究进展摘要：狂犬病病毒（RV）是一种能引起人和动物高度致死性疾病的嗜神经病毒，在分类学上属于单分子负链RNA病毒目、弹状病毒科、狂犬病毒属。
本文主要对狂犬病毒的结构、传染途径、繁殖过程、狂犬病的发病机制、影响因素、疫苗研究进展进行简要阐述。
关键词：狂犬病、狂犬病毒正文：狂犬病是由狂犬病毒(Rabiesvirus,RV)引起的,以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁等临床表现为特征的致死性中枢神经系统感染疾病,一旦发病,病死率几乎达100%,是迄今为止人类病死率最高的急性传染病。
随着分子生物学等相关学科的快速发展,RV的分子结构、基因分型、临床诊断、新型RV的发现、演变进化,以及病毒的毒力及其致病性等研究取得了很大成就。
本文就近年来RV的研究进展作一综述。
一、狂犬病毒的结构（1）、病毒的基因组结构：RV为单股不分节段的负链RNA病毒,病毒基因组由11928--11932个核昔酸组成,由3’端至5’端依次排列着N、P、M、G和L 5个RV的结构基因,其长度分别为1424、991、805、1675、6475个核昔酸,分别编码核蛋白(N)、磷蛋白(Por NS)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和转录酶大蛋白(L)。
（2）、病毒的蛋白质结构：完整的RV粒子由病毒核衣壳及包膜两部分构成,核衣壳由RNA与核蛋白（N）、磷蛋白(Por NS)和转录酶大蛋白（L）3种蛋白构成,而包膜由糖蛋白（G）和基质蛋白（M）构成。
①核蛋白（N）全长450个氨基酸,是构成成熟病毒粒子核衣壳螺旋对称结构的主要成分。
②磷蛋白(Por NS)含有292个氨基酸,它与转录酶大蛋白结合,构成完整的病毒RNA聚合酶复合体。
磷蛋白还与核蛋白相互作用,实现对病毒的转录、复制的多功能调节。
③转录酶大蛋白（L）是RV中最大的结构蛋白,全长2142个氨基酸,在RV的转录与复制中起催化作用。
④糖蛋白（G）是一种跨膜蛋白,构成病毒表面的突起,是Rv与细胞受体结合的配体。
狂犬病毒生物学特征研究进展
狂犬病毒是一种单链RNA病毒，属于锥形病毒科。
其基因组长度为11kb，编码5个结构蛋白和1个非结构蛋白。
狂犬病毒的结构蛋白包括核衣壳蛋白N、磷酸酯酶P、重复蛋白M、膜蛋白G和核酸酶蛋白L，这些蛋白在病毒的复制和传播过程中起到关键作用。
狂犬病毒主要通过唾液传播，感染后进入全身，通过神经元迁移到中枢神经系统，导致狂犬病。
在感染动物或人的过程中，病毒在口腔的唾液中复制，然后通过咬人或动物等方式传播。
病毒在感染后病情恶化迅速，一旦症状出现就很难治疗，死亡率高达100%。
最近的研究表明，狂犬病毒具有高度的遗传多样性，其基因型的变异能够导致病毒的致病性和传染力的不同。
这提示了狂犬病毒的流行和传播可能与其基因型有关，因此一个长期的狂犬病毒基因型监测和分析系统非常必要。
除此之外，研究人员还在探索狂犬病毒的抗原性、免疫机制和疫苗开发等方面。
尽管已经存在有效的疫苗对抗狂犬病毒，但在一些发展中国家和地区，由于病毒基因型的差异和疫苗针对性的不同，人类狂犬病的流行仍然存在挑战。
因此，今后的狂犬病毒生物学研究需要促进更多有效的疫苗开发和更高效的预防措施。
狂犬病是由狂犬病毒引起的一种急性传染病，又称恐水病、疯狗病等。
1709年首次报道该病，Loues Pasteur于1885年第1次分离出狂犬病毒( rabies virus,RV)。
狂犬病主要在动物间传播，患狂犬病的动物俗称疯狗、疯猫、疯狼等。
人可能因被其咬伤、抓伤而感染狂犬病毒，并因此患病。
人患病后，会出现一系列精神症状，并逐渐出现咽喉肌肉痉挛、流口水、瘫痪、呼吸和循环麻痹等症状。
我国是狂犬病的高发国，了解并有效的防治狂犬病已经成为重中之重的课题。
作者现将狂犬病的分子生物学以及预防治疗方面的研究进展做以下几个方面的综述。
1、病原学狂犬病毒(Rabies virus)是一种嗜神经病毒，属于弹状病毒科、狂犬病毒属。
病毒颗粒长160nm～240nm，直径70nm，呈子弹状，有双层脂质外膜，其表面有糖蛋白突起。
外膜内部为间质蛋白，病毒中央为不分节段的单股负链RNA和五种结构蛋白组成的核衣壳。
1.1核蛋白（NP）N基因全长1421bp，开放阅读框(ORF)全长1353bp，编码450个氨基酸。
N蛋白是病毒中最稳定的蛋白，且能高效表达。
在RV复制过程中，NP 与基因组RNA紧密结合成核糖核蛋白(RNP)，保护核酸免遭核酸酶的破坏[1]。
此外，NP还在病毒RNA 从转录向复制切换方面起重要作用，并对病毒的转录与复制进行调解[2]。
另外，NP还是狂犬病病毒主要保护性抗原之一，能刺激机体产生细胞免疫[3]。
1.2磷酸化蛋白（PP）P基因全长991bp，ORF全长894bp，位于全基因1514～2407位核苷酸，编码297个氨基酸。
PP 为亲水性多肽，约占病毒总蛋白的6%。
PP含有大量可结合磷酸基团的丝氨酸和苏氨酸磷酸化残基，因此，磷酸化是其结构的一个重要特点。
PP与LP相互作用构成完整的转录酶活性，在病毒转录和复制中起主要作用。
另外，PP与NP和LP一起组成核衣壳，具有病毒RNA转录和复制的全部活性[4]。
PP能够结合可溶性的NP形成N-P蛋白复合物以抑制其自身发生聚合，使其保持一种适合衣壳化的存在形式，并在NP 与PP复合体中指导NP特异性的结合病毒RNA。
文章编号:1002-2694(2006)03-0271-03狂犬病病毒的基因分型及其分子流行病学研究进展张建明1,2,严延生2中图分类号:R37319 文献标识码:A 狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus,RV)引起的人和所有哺乳动物的急性致死性中枢神经系统的自然疫源性疾病。
人狂犬病的临床特征是恐水、怕风、咽肌痉挛和进行性麻痹等,尤以恐水症状为突出,一旦发病,死亡率几乎达100%〔1〕。
狂犬病是全球性的严重公共卫生问题,近些年来,随着宠物增多又缺乏相对有效的管理控制措施,狂犬病的发病又呈现上升趋势,在分子水平上进行狂犬病病毒流行病学研究对于阐明病毒的毒力变异和抗原飘移、了解病毒的宿主特异性和病毒系统发育的时空进程,以便更好地控制狂犬病都具有重要意义,本文就狂犬病病毒的基因分型及其分子流行病学研究进展作一综述。
1 狂犬病病毒的基因组结构和分型111 基因结构 狂犬病病毒的基因组为单股负链不分节段的RNA,全长约12kb(11215kb)。
由基因组的3’端至5’端依次排列着N、NS、M、G、L5个结构基因,各基因的序列长度分别为1424、991、805、1675和6475个核苷酸,它们分别编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白(P或RNA依赖的RNA转录酶蛋白)。
每个基因均由3’端非编码区、编码区和5’端非编码区三部分组成。
在N 基因前有1个50个核苷酸的先导序列,在L基因后有约70个核苷酸的非翻译区。
在N2NS、NS2M、M2G和G2L基因间分别有2、5、5和423个核苷酸的间隔序列,G2L基因间的423核苷酸间隔序列是一个伪基因。
112 基因分型 狂犬病病毒的N蛋白基因相对恒定,点突变较少,而且与病毒的型别有关,可以作为群变异的指标〔2〕。
1993年Bourhy等〔3〕通过测定狂犬病病毒属中具有代表性的病毒分离物N基因的序列,将狂犬病原区分为6个基因型:基因型1(狂犬病病毒,RABV)、基因型2(拉各斯蝙蝠病毒,LBV)、基因型3(莫科拉病毒,MO KV)、基因型4(杜文海洛病毒,DUVV)、基因型5(欧洲蝙蝠狂犬病病毒1,EBLV2 2)、基因型6(欧洲蝙蝠狂犬病病毒2,EBLV22)。
1998年Skerratt等〔4〕从澳大利亚的蝙蝠中分离出狂犬病病毒的基因型7(澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒,ABLV)。
2001年de Mattos 等〔5〕对狂犬病病毒基因分型进行比较研究,根据N基因核苷酸序列的同源性绘制了狂犬病病毒属成员间的种系发生关系图,属内成员N蛋白序列的同源性由78%(MO KV和EBLV22)至93%(DUVV和EBLV21),基因型和早先根据抗原性划分的血清型基本一致。
7个基因型又可分为2个进化组:第一组包括基因型1、4、5、6和7;第二组含基因型2和3。
同组内1种病毒的抗体与其他病毒可产生交叉反应,不同组的病毒之间不能产生交叉免疫保护。
非洲的DUVV和EBLV21亲缘关系较近,而LBV和MO KV在系统发育上则和RABV亲缘关系较远。
ABLV与古典的RABV亲缘关系最密切。
在基因型内还可分辨出各个不同的病毒聚簇,这些聚簇反映了病毒间历史的地理的或宿主种别的关系。
2 狂犬病的分子流行病学研究211 流行现状 狂犬病呈全球性分布,只有南极洲和少数岛国(日本、挪威、冰岛、芬兰、瑞典、英国、马来西亚、新加坡、新西兰等)无狂犬病发生。
亚洲是狂犬病高发地区,估计每年有近40000人死于狂犬病,约占全球因犬伤死亡的90%〔6〕。
亚洲狂犬病发病率以印度为最高,中国、菲律宾、孟加拉、巴斯基坦、越南、泰国等也相当高〔7〕。
非洲普遍存在狂犬病且大面积流行,病原型别复杂,感染来源更复杂,最早发现的狂犬病病毒的4个血清型中有3个存在于非洲,除家犬、猫外,非洲南部至少有30种属于5个科的肉食动物被确诊患狂犬病。
欧洲由于实行针对狐狸的口服免疫策略〔8〕,近10年来,动物狂犬病已明显下降,其流行病学也发生了改变,西欧国家采取了对犬进行免疫,同时对犬进行严格管理,已基本上控制或消灭了人、畜狂犬病。
狂犬病在中、南美洲长期以来一直是严重的公共卫生和经济问题,其中阿根廷、玻利维亚、巴西、哥伦比亚、厄瓜多尔、危地马拉、洪都拉斯等国疫情较重。
北美洲狂犬病呈地区性流行,以野生动物为主,自1996年以来,狂犬病发病率一直保持下降趋势,但蝙蝠作为传染源引起的人狂犬病无下降趋势〔9〕。
澳大利亚原本是一个无狂犬病的国家,1998年Skerratt等〔4〕从果蝠中分离出澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒,引起了公众的注意。
212 分子流行病研究方法 Rupprecht C等〔10〕通过单克隆抗体检测狂犬病病毒的抗原变异,证明了来自世界各地不同病毒分离物间存在许多差异。
但是,单纯血清型或抗原型并不能鉴定狂犬病病毒的来源和迁移,在分子流行病学的研究中受到一定的限制。
Ermine A等〔11〕把放射性标记的核酸探针杂交方法用于检测狂犬病病毒基因组,但此法只能用于检测受严重感染的组织中的狂犬病病毒基因组。
近年来狂犬病的分子流行病学研究方法不断完善,Bourhy HB等〔12〕证实利用RT2PCR及基因测序的分子流行病研究在病毒的分类及病毒株来源的鉴别上是一个很有用的工具。
许多学者是根据N基因的特点———高度保守和高效表达,先用RT2 PCR方法扩增N基因片段,然后再进行基因序列测定,对狂犬病病毒进行病毒检测、基因分型和系统发育分析,从而进通讯作者:严延生作者单位:1.福建医科大学,福州 350004;21福建省疾病预防控制中心,福州 350001行狂犬病的分子流行病学研究。
213 分子流行病学研究进展 狂犬病病毒的分子流行病研究主要是应用RT2PCR的方法测定狂犬病病毒的基因序列,对实验室毒株和街毒毒株从分子水平进行基因序列的分析和比较研究病毒抗原基因位点的变异,从而可以确定毒株的来源和亲缘关系以及病毒毒力的变化。
由于狂犬病病毒的宿主动物很多,野生带毒动物可以使病毒进行地域之间的迁移,所以进行不同地域和不同宿主的狂犬病病毒的分子流行病学研究,根据N基因突变绘制的病毒迁移图谱,可以找到病毒的传播路线和历史变迁的证据。
Smith等〔13〕对3名分别从老挝、菲律宾和墨西哥移民到美国后在美国发病而又无明显暴露史的患者进行广泛的调查研究,通过对从这3名患者和其它有明确暴露史的狂犬病患者以及从美国、泰国(邻近老挝)、菲律宾和墨西哥的动物身上分离到的狂犬病病毒进行了深入研究,用单克隆抗体借助间接荧光免疫和中和试验方法鉴定狂犬病病毒抗原特异性,用RT2PCR方法扩增N 基因片段,然后再进行基因序列测定,结果表明3名患者身上分离到的病毒株基因型均不同,且与美国本土患有狂犬病的动物身上分离到的病毒株基因型也各不相同,而这3个基因型分别与患者移民到美国之前所居住国家(或邻近国家)的患有狂犬病的动物身上分离到的病毒株基因型相一致,从而证实这3名患者出现狂犬病的临床症状是因在移入美国之前就可能有暴露史,只是经过较长的潜伏期(分别为4年、6年和11个月)后才在美国发病。
Smith等〔14〕分析了来自世界各地的87个狂犬病病毒分离物N基因的RT2PCR扩增产物的200bp区域的核苷酸序列,并借助计算机分析绘制了反应不同病毒分离物亲缘关系远近的系统进化树,依据亲缘关系远近将87个病毒分离物分为7个类别。
发现实验室的毒株大部分有很高的同源性,如CVS(国际标准攻击毒株)、3a G(中国人用疫苗株)、ERA (兽用口服活疫苗株)等,而街毒株差异较大,存在明显的地域性。
经比较认为,现在流行于许多地区的狂犬病病毒街毒株与源于欧洲的经典毒株和疫苗株有较高的同源性,这可能与欧洲人早期探险开发以及殖民历史背景有关。
由于近年来,有关表面上看似健康的带毒犬咬伤人类致人死亡的报道越来越多,Warner等〔15〕对从埃塞俄比亚的这种带毒犬唾液中和扁桃体中分离到的7株狂犬病病毒进行分子生物学特征及分子流行病学的研究,这7株的病毒酶切片段相似性很高,但与PV(巴斯德株)和CVS(国际标准攻击毒株)毒株差别较大,表明这7株病毒分离物在遗传上较相近,而与PV和CVS株之间在系统发育上亲缘关系较远。
在苏丹狂犬病是一种以家犬为主要宿主的地方性人患共患病,Johnson N等〔16〕通过对苏丹一些狂犬病病毒毒株的部分N基因的序列分析建立系统进化树图,并把这些毒株与苏丹临界的一些东北非国家的毒株进行比较分析,发现苏丹的毒株属于在北非普遍存在的非洲狂犬病病毒1a亚型,并与来自埃塞俄比亚的毒株极为相似。
Kuzmin IV等〔17〕通过对来自前苏联不同地区的55株狂犬病病毒与来自欧亚大陆、非洲和北美洲的狂犬病病毒毒株的部分或全部N基因序列比较分析,把前苏联的毒株分为不同的5个组群:来自北极的A群与阿拉斯加和加拿大的毒株相似;来自西伯利亚东南和远东地区的B群主要由类似北极毒株组成;来自俄罗斯、图瓦和哈萨克斯坦的大草原、森林地区的C群与欧洲株差异显著;来自俄罗斯西部的D群介于C群与欧洲株之间;来自俄罗斯西北部的E群主要包含早期从波罗的海地区分离获得的东北欧毒株。
Hyun BH等〔18〕通过1998-2004年在韩国收集了13株狂犬病病毒毒株(其中7株从家养的狗和牛及6株从野生狸的脑组织中分离到的),对韩国的狂犬病分子流行病学进行了较详尽的研究,通过对N基因和G基因的全长及G2L非编码区的序列分析,表明所有13株毒株的同源性至少在9718%～9815%,并依此研究把韩国毒株分成A、B两个亚型;并把这13株与其它地区(其它基因型)毒株进行系统比较分析,其中部分N基因片段与拉各斯蝙蝠病毒、莫科拉病毒、杜文海洛病毒、欧洲蝙蝠狂犬病病毒1、欧洲蝙蝠狂犬病病毒2和澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒的同源性分别为6911%～7010%、6519%～6712%、6419%～6514%、7214%～7217%、6612%～6714%和7611%～7617%,全长G基因与北极株、中国街毒株、莫科拉病毒和澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒的同源性分别超过8913%、8312%、5614%、7011%,结果显示韩国毒株与北极株联系较紧密,而与中国等分离的亚洲株相距较远,并证实野生狸是韩国狂犬病病毒的主要宿主,在韩国狂犬病的流行过程中扮演重要角色。
这些均证实了狂犬病流行具有一定的地域特征。
哥伦比亚卫生部监测数据表明上世纪90年代期间,狂犬病的传播主要限于哥伦比亚北部约40000km2的范围, 1992年1月到2003年12月,哥伦比亚北部地区总共报道725例城市狂犬病(其中700例狗狂犬病,25例人狂犬病),在2000-2003年期间,在哥伦比亚北部有20只野生狐狸被确诊感染狂犬病病毒,Paezs A等〔19〕为弄清这一地区狐狸、狗和人身上携带的狂犬病病毒的系统发育关系,进行了分子流行病学研究,收集了1994年8月至2003年4月的85株狂犬病病毒,其中59株分离自狗,20株分离自狐狸,6株分离自人,用单克隆抗体通过间接免疫荧光法测定抗原的特异性,系统进化分析显示这一地区狐狸、狗和人携带的狂犬病病毒属于同一基因型,结合哥伦比亚北部的自然条件(狐狸和狗及农民有较频繁的接触)及2000年以前没有狐狸患狂犬病的报道,得出狗向狐狸传播狂犬病病毒的结论,这一结论也再一次证实了先前关于狂犬病病毒能成功地向野生宿主迁移的研究报道(Bourhy H等〔20〕研究认为在欧洲狂犬病可能从家养的狗向野生的狐狸和狸传播,Guerra MA等〔20〕研究证实在美国东北部地区狗狂犬病可向野生的臭鼬传播)。
