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DNA测序与线性反向探针杂交法检测HBV P基因耐药突变的比较【摘要】目的基于多重pcr和反向线性杂交原理，建立hbv基因分型及耐药突变检测的新方法。
方法对深圳地区的hbv进行基因分型，并对其常见耐药突变位点进行快速检测，了解其流行现状和流行规律。
结果在45份标本中dna序列测定法检测到碱基突变73个，其中与 lam相关突变24份（53.33%），与 adv 相关突变3份（6.66%），与ldt相关突变1份（2.22%），与etv相关突变1份（2.22%）；选取21份血清，其中与线性反向探针杂交检测结果一致的突变为85.71%（18/21），氨基酸位点一致为97.39%（224/230）。
结论检测hbv不同基因型与致病性及药物应答的关系，能够为研究hbv的流行病学规律提供新的方法，为hbv感染的治疗提供用药指导，从而也为hbv的感染控制提供新的诊断工具。
【关键词】慢性乙型肝炎；乙肝病毒；核苷/酸类药物；耐药性突变；dna测序；线性反向探针杂交法【中图分类号】r450【文献标识码】a【文章编号】1004-5511（2012）06-0346-02全世界大约有3.5亿乙型肝为病毒（hbv）携带者，每年约有80万人死于hbv 慢性感染所引发的重型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等相关疾病。
乙型肝炎病毒（hbv）可在慢性持续性感染、机体免疫、压力或抗病毒治疗药物作用过程中发生变异［1］。
近年来，临床上开始广泛采用采用核苷/酸类药物治疗乙型肝炎，核苷/酸类药物方拉米夫定(lam)、阿德福韦酯(adv)、替比夫定(ldt)、恩替卡韦(etv)等简便、副作用少、能迅速抑制hbv复制。
但其耐药性问题也日益突出。
本研究采用基于巢式 pcr 的 hbv p 基因序列测定法检测慢性乙型肝炎患者血清 hbv 基因变异情况，并与线性反向探针杂交法检测结果比较，同时对新发现的若干 hbv dna 耐药突变位点进行分析。
现将实验结果报告如下。
乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程（PCR-反向斑点杂交法）1.目的:乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程，保证检测结果的准确性。
2.应用范围: PCR实验室。
3.职责:3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献:4.1《中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒说明书》4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书5. 内容:5.1 检测方法：PCR-反向斑点杂交法。
5.2 实验原理：选取人乙型肝炎病毒基因组中编码表面抗原的S基因的编码区为扩增区域，设计特异性引物及B，C，D型特异性探针，预先将特异性探针包被在尼龙膜上，再利用生物素标记的引物对靶片段进行PCR扩增，PCR产物和膜条上的特异性探针杂交，靶标中的型特异性片段会和特异性探针结合，未结合的PCR 产物通过洗膜去除，最后进行显色和结果分析，可检测HBV B、C、D三种基因型DNA.5.3 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。
5.3.1 标本类型：血清。
5.3.2 标本采集：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25℃）放置30～60 min，全血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1,500 rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。
5.3.3 标本保存：标本采集后保存于2～8℃。
5.3.4 运送条件：标本运送采用冰壶。
5.3.5 标本拒收标准：污染、严重溶血、脂血类或肝素抗凝剂标本。
5.4 设备和试剂:5.4.1 设备： DA7600 PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。
5.4.2 试剂：5.4.2.1 试剂品牌：中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎基因分型检测试剂盒5.5.2.2 试剂组成：DNA 浓缩液（2,000μL/管）1 管；DNA 提取液（500μL/管）1 管；HBV 基因分型突变反应管（未贴标签管）10 人份；HBV 基因分型阳性质控品（50μL/管）1管，HBV 基因分型突变阴性质控品（50μL/管）1管，杂交液Ⅰ浓缩液（50ml/瓶）1瓶，杂交液Ⅱ浓缩液（30ml/瓶）1瓶，溶液Ⅰ（100μL/管）1管，溶液Ⅱ浓缩液（25ml/瓶）1瓶，溶液Ⅲ（1ml/管）2管，溶液Ⅳ（100μL/管）1管，杂交膜条（10人份/袋）1袋。
乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测一．检验项目：乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测二．检验目的：在进行抗病毒治疗前和抗病毒治疗中进行乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测，能够：1). 区分中国和其他亚洲国家常见的HBV-B、C、D基因型；2). 检测HBV抗病毒药物5个热点突变位点的6种突变类型；3). 对HBV实行动态监控，辅助确定个性化的临床诊疗方案，进行HBV流行病学研究。
三．临床意义：HBV基因型分为9种（A-I），其分布具有地域性，中国乃至亚洲流行的乙型肝炎病毒几乎都是B、C型，此外还有少量D型，不同的基因型易发生的突变类型不同，与病情转归也密切相关，如基因型C较B更容易引起严重的肝炎或肝癌，对干扰素的应答率A型高于D型，B型高于C型，C型高于D型。
与C型患者相比，B型患者较早出现HBeAg血清学转换，较少进展为慢性肝炎，肝硬化和原发性肝细胞癌。
核苷（酸）类似物，如拉米夫定（Lamivudine，LMV），替比夫定（Telbivudine,LdT），阿德福韦酯（Adefovir,ADV）和恩替卡韦（Enticavir,ETV）等是抗HBV常见药物。
但这些药物都无法彻底清除大多数乙肝病人体内的HBV，患者需要长期维持治疗。
HBV在宿主体内感染以及抗病毒治疗的过程中会发生基因变异，并在宿主体内免疫系统的压力下和在治疗干预过程中进行变异的优势选择，以达到逃逸免疫、对抗药物、实现物种生存的目的，进而发生耐药。
乙肝病人一旦出现耐药突变，其肝功能恶化的比例将显著增高，甚至快速进展至肝衰竭。
四．标本送检要求：4ml黄色帽血清管，空腹采集后立即送检，室温放置不宜超过2小时，如不能立即送检可于4℃保存一周，如需长期保存请放入－20℃冻存，运输过程中请注意保持低温。
五．开单名称：乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测进入本科室“医生工作站”→选择开单病人“姓名”→选择“项目类别”→选择“检验”→选择“乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测”→确定或进入本科室“医生工作站”→选择开单病人“姓名”→选择“项目类别”→选择“检验”→选择“实验室”→选择“乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测”→确定六．收费：570元/例七．送检时间：周一至周日8：00am－12：00am八．送检地点：检验科三楼服务台九．报告时间：抽血后，7个工作日后进入我院计算机检查报告系统，查看检测结果。
乙型肝炎现状如何？乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。
乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性分布,全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病.我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。
乙型肝炎病毒（HBV)基因分型的临床意义HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主,感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。
通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况.研究表明，与HBV—B型相比,C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV—B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一.同时,HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量.乙肝的治疗方式有哪些?HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。
由于干扰素需要反复注射，且副作用较多,近年来,核苷(酸）类似物（NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者,是长期治疗的合理选择.但随着治疗时间的延长,往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。
乙肝病毒产生耐药的机理是什么?HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。
通常分为以下几种：(1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异,导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降；（2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降,在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异,这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降；（3）基因型耐药:指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4)表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。
武汉地区157例乙型肝炎病毒基因分型和耐药性分析宋仕玲;桂文甲;周洪清;黄艺芬;尹淑芬;李靖;吴淑坤【摘要】目的了解武汉市乙型肝炎病毒基因型分布特点和乙型肝炎病毒耐药情况.方法采用基因测序法检测武汉市区157例患者HBV基因型,目标检测基因型为A～H等8个基因型,检测HBV 11个耐药位点:rtL80、rtL169、rtV173、rtL180、rtA181、rtT184、rtA194、rtS202、rtM204、rtN236和rtM250,判断对HBV耐药的核苷类似物.结果武汉市区157例HBV感染者中,检出3种HBV基因型,其中B型占72.61％,C型占26.75％,D型占0.64％.共有68例(43.31％)耐药,其中B 型70.59％,C型29.41％,基因B型和C型的HBV相比,耐药发生差异无统计学意义(x2 =0.379,P＞0.05).对拉米夫定耐药41例,占全部耐药病例的60.29％,其中B型占73.17％,C型占26.83％;204I位点耐药17例,180M+204I位点耐药6例,180M+ 204V位点耐药12例,180M+ 204V/I位点耐药6例.对阿德福韦酯耐药20例,占全部耐药病例的29.41％,基因B型占75.0％,基因C型占25.0％,耐药位点为236T为9例,耐药位点为181T/V为7例,236T和181T/V联合耐药4例.对恩替卡韦耐药5例,占全部耐药病例的7.35％,基因B型3例,基因C型2例.拉米夫定和阿德福韦酯联合耐药2例,占全部耐药病例的2.94％,均为基因C型.替比夫定耐药与其他核苷类似物耐药分析结果重复,共32例,占47.06％,基因B型75.0％,基因C型25.0％.结论武汉市区157例乙型肝炎病毒感染者中男性较多,感染HBV 主要基因型为B型,其次为C型,患者主要表现为拉米夫定、替比夫定和阿德福韦酯耐药.临床应根据患者HBV基因型和耐药情况个体化制定治疗方案.【期刊名称】《胃肠病学和肝病学杂志》【年(卷),期】2015(024)008【总页数】4页(P969-972)【关键词】肝炎病毒;乙型;HBV DNA;基因型;耐药【作者】宋仕玲;桂文甲;周洪清;黄艺芬;尹淑芬;李靖;吴淑坤【作者单位】武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061;武警湖北总队医院感染科,湖北武汉430061【正文语种】中文【中图分类】R512.6+2乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)基因型测定对评估慢性乙型肝炎感染者的疾病进展和制定最佳抗病毒治疗方案很重要，相比而言，肝硬化和原发性肝癌患者感染的乙型肝炎病毒基因分型更多为基因C型和D 型［1-3］。
乙型肝炎病毒的DNA检测技术进展乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝炎疾病，全球范围内仍然是一种重要的公共卫生问题。
据世界卫生组织数据显示，全球有超过2亿人感染了乙型肝炎病毒，其中大约3500万人患有慢性乙型肝炎。
乙型肝炎病毒的DNA检测技术是诊断和监测乙型肝炎的关键工具之一。
DNA检测技术是通过检测乙型肝炎病毒的DNA片段来确定感染者是否存在病毒感染以及感染的程度。
传统的乙型肝炎病毒DNA检测方法主要是聚合酶链反应（PCR）技术。
PCR技术通过扩增病毒DNA片段，使其在实验室中能够被检测到。
然而，PCR技术存在一定的局限性，如需要复杂的实验室设备和专业技术人员，以及较长的检测时间。
近年来，随着生物技术的发展，乙型肝炎病毒DNA检测技术也得到了长足的进展。
其中，核酸序列基因芯片技术是一种新兴的DNA检测方法。
该技术利用芯片上固定的乙型肝炎病毒DNA探针，通过与待测样本中的病毒DNA特异性杂交反应，实现对病毒DNA的检测和定量。
与传统PCR技术相比，核酸序列基因芯片技术具有快速、高通量、高灵敏度和高特异性的优点。
此外，该技术还可以同时检测多种病毒亚型和基因突变，对于乙型肝炎病毒的分型和耐药性监测具有重要意义。
除了核酸序列基因芯片技术，还有其他一些新兴的乙型肝炎病毒DNA检测技术也值得关注。
例如，数字PCR技术（dPCR）是一种通过将PCR反应分割成数千个微小反应来实现对病毒DNA的精确计数的方法。
与传统PCR技术相比，dPCR技术具有更高的准确性和可重复性。
此外，下一代测序技术（NGS）也被广泛应用于乙型肝炎病毒的基因组学研究和病毒变异的监测。
NGS技术可以在较短的时间内高通量地测序乙型肝炎病毒的全基因组，为研究乙型肝炎病毒的种群遗传学和病毒演化提供了有力工具。
乙型肝炎病毒DNA检测技术的进展为乙型肝炎的诊断和治疗提供了更精确和准确的手段。
通过及时检测和监测乙型肝炎病毒的DNA水平，可以更好地评估感染者的病情和治疗效果，并制定个体化的治疗方案。
乙型肝炎病毒耐药及监测张欣欣 于德敏作者单位5 上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科 目前国内外批准上市的慢性乙型肝炎治疗药物有6种:普通干扰素、聚乙二醇干扰素、拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定。
治疗应答包括血清H BV D NA 的阴转、A LT 的正常化、H BeAg 的血清学转换和肝组织学的改善。
然而随着核苷(酸)类药物治疗时间的延长,乙肝病毒的耐药株有可能被筛选出来,并因此导致H BV D NA 水平的再次升高(病毒突破)、A LT 的反弹和H BeAg 血清学转换的逆转,已成为影响抗病毒疗效的主要因素而受到广泛关注。
一、抗病毒治疗失败的定义抗病毒治疗失败可分为原发性治疗失败和继发性治疗失败[1]。
原发性治疗失败指抗病毒治疗6个月后病毒载量的下降<1log10I U Πm L 。
继发性治疗失败是指在开始治疗有效(H BV D NA 下降≥1log10I U Πm L)后,病毒复制的反弹≥1log10I U Πm L 。
病毒反弹应当至少重复1次,每次间隔至少1个月的H BV D NA 定量检测来确定,但如果同时伴随着A LT 的升高则例外。
H BV D NA 检查方法的敏感性决定了确诊的时间,因此要早期诊断治疗失败必须要有高灵敏度和高特异性的检查方法。
对用干扰素治疗的病人,考虑到药物作用的机制,抗病毒治疗失败需要进一步的定义。
α干扰素治疗失败是指在6个月时H BV DN A 下降<1log10I U ΠmL 或病毒载量>109I U Πm L 。
目前各种临床试验对治疗失败的定义不尽相同。
可有检测H BV D NA 方法不同,耐药基因型检测和表型检测方法多样性,检测H BV D N A 所采用时间点差异等。
因此,为避免这些不一致性,治疗病人应当使用同一种实验室检查方法进行监测,并且病毒载量应当使用国际单位来计算。
二、H BV 准种动力学变化和耐药的产生乙肝病毒的复制是通过逆转录方式进行的,在这个阶段病毒逆转录酶的自发出错率可导致点突变的累加。
乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规程（PCR和DNA反向点杂交）1. 目的：乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规章，保证检测结果的准确性。
2. 应用范围：对HBV的基因型和耐药突变基因检测。
3. 职责3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献4.1 亚能生物技术（深圳）有限公司乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测试剂盒剂说明书。
4.2 中山大学达安基因股份有限公司DA7600核酸序列检测系统用户手册。
5. 内容5.1 检测方法：PCR和DNA反向点杂交5.2 实验原理：设计特异的PCR引物扩增获得HBV目的基因片段，该片段包含了所要检测的基因型和耐药基因突变位点。
通过PCR产物与设计的探针进行特异性杂交，根据膜条特定位置显色（蓝色）与否来判断HBV的基因型和耐药突变类型。
5.3 性能参数3 copies /ml 。
5.3.1 灵敏度：检测下限为 1.0 ×105.3.2 稳定性：产品有效期为6个月，在有效期内产品性能稳定5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。
5.4.1 标本类型：血清或血浆。
5.4.2 标本保存：制备好的血清或血浆室温放置不超过2小时，2～8℃保存不超过48h，-18 ℃以下保存不超过半年，应避免反复冻融。
5.4.3 运送条件：冰壶或泡沫箱加冰袋密封，在途时不宜超过48h。
5.5 设备和试剂5.5.1 设备：DA 7600 荧光定量PCR仪、低速离心机、生物安全柜、高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/ 干式恒温器、冰箱（4℃、-20 ℃）、移动/ 固定紫外灯、三孔电热恒温水浴箱、振荡恒温水浴箱。
5.5.2 试剂：5.5.2.1 试剂品牌亚能生物技术（深圳）有限公司乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测试剂盒。
5.5.2.2 试剂批准文号：国食药监械（准）字2011第3401179号。
乙型肝炎病毒耐药突变基因的检测与分析姜清明【摘要】目的检测该院2013年-2015年乙型肝炎患者基因分布及病毒耐药基因突变情况及相关性和临床意义.方法采用荧光定量和基因芯片技术检测240例乙型肝炎患者乙肝病毒(HBV)基因型和对拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定药物突变基因型.结果 240例乙型肝炎患者中,HBV基因型包括:B型61.3％(147/240)、C型25.0％(60/240)、B和C混合型5.4％ (13/240)、其他型8.3％(20/240),未检出D型.182例未出现耐药,拉米夫定耐药突变44例,阿德福韦出现耐药突变者7例,恩替卡韦出现耐药突变者6例,替比夫定出现耐药突变者为1例.M204V以及M204I是两种常见的拉米夫定耐药突变情况,在阿德福韦耐药突变中以N236T±A181位碱基替换相对常见;T184位碱基替换是恩替卡韦耐药突变的典型代表;M204I是替比夫定耐药突变的主要表现.部分从来没有采用核苷酸等药物治疗者也有可能被检测出耐药突变情况.44例出现拉米夫定耐药的基因型中,180M 及其混合突变型占86.4％(38/44),C型HBV基因突变占61.4％(27/44),且主要为180M耐药突变型(24/27).结论检测乙型肝炎病毒耐药突变基因,可以帮助医学工作者确定患者是否存在耐药性,从而选择恰当的抗病毒方法对其进行治疗.【期刊名称】《中国医学工程》【年(卷),期】2017(025)002【总页数】3页(P84-86)【关键词】肝炎病毒;乙型;耐药;突变基因【作者】姜清明【作者单位】广东省粤北第二人民医院检验科,广东韶关512231【正文语种】中文【中图分类】R512.62乙型肝炎简称乙肝，作为全球性关注的公共卫生问题，严重威胁到人类健康，据报道，慢性乙型肝炎病毒携带者全球多达3.6亿人，在中国，乙肝病毒携带者占三分之一。
乙型肝炎可成为肝硬化、肝癌和肝衰竭的诱因，严重者甚至可引发死亡。
龙源期刊网 利用一代测序进行HBV基因分型和耐药检测
作者：鲁旖
来源：《健康必读（上旬刊）》2019年第10期
【摘 ;要】目的：建立利用一代测序进行乙型肝炎病毒基因分型和耐药分析的方法。
方法：查阅文献及利用NCBI设计引物，摸索和优化PCR扩增条件，PCR产物用一代测序进行测序分析。
结果：本方法所用引物及PCR产物能用于一代測序进行HBV基因分型和耐药检测。
结论 ;建立了利用一代测序进行乙型肝炎病毒基因分型和耐药分析的方法，为临床诊治提供个性化诊疗依据。
【关键词】乙型肝炎病毒;基因测序;基因分型
【中图分类号】R54 ;;;;;【文献标识码】A; ;;;;【文章编号】1672-3783（2019）10-0286-02
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）基因组DNA是不完全双链的环状DNA，由一条不完整的正链和一条不闭合的负链组成。
;;HBV基因型包括A～I，我国以B型和C为主。
乙型肝炎现状如何？乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。
乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病。
我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。
乙型肝炎病毒（HBV）基因分型的临床意义HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主，感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。
通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况。
研究表明，与HBV-B型相比，C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV-B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一。
同时，HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量。
乙肝的治疗方式有哪些？HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。
由于干扰素需要反复注射，且副作用较多，近年来，核苷(酸)类似物(NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者，是长期治疗的合理选择。
但随着治疗时间的延长，往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。
乙肝病毒产生耐药的机理是什么？HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。
通常分为以下几种：（1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异，导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降；（2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降，在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异，这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降；（3）基因型耐药：指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4）表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。
HBV属于嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb，是部分双链环状DNA结构。
HBV基因组含有4个部分重叠的开放读框(open reading frame，ORF)，分别为S基因区、C基因区、P基因区和x基因区。
产物为含末端蛋白、间隔区、逆转录酶区和RNA酶H区4部分的HBV聚合酶。
HBV虽然属于DNA病毒，但其复制过程并非DNA—DNA的直接复制过程，而是经过前基因组RNA的中间过程，即DNA—RNA—DNA的复制过程。
在前基因组RNA逆转录为负链DNA的过程中，HBV逆转录酶由于缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高，发生变异的频率为每年(1.4～3.2)X105核苷酸替换／位点。
HBV复制的这种过程和特点，决定了同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差别。
核苷（酸）类药物主要通过抑制HBV聚合酶的逆转录酶区活性，阻止HBV复制过程中以HBV的前基因组RNA为模板逆转录生成新的病毒DNA，从而发挥抑制病毒复制的作用，HBV前基因组RNA是以HBV 的cccDNA为模板合成的，即NA的药效靶点在cccDNA的下游，所以NA不能直接清除已经存在的cccDNA。
为了持续抑制HBV的复制，NA抗HBV治疗的疗程往往需要数年。
但在长期应用某一抗病毒药物的情况下，产生选择压力，野生株被抑制。
生存下来的突变株占主导，此种药物便失去了疗效，从而导致耐药的发生。
HBV对NA的耐药分析1.拉米夫定(LAM)LAM属于L-构型核苷，是目前用于临床最广、时间最长的药物，其产生的耐药也是最多的。
在LAM 初次治疗时，1、2、3、4和5年YMDD突变的发生率约为23％、46％、55％、65％和7l％。
LAM主要的耐药突变位点是rt M204V／I(YMDD变异)，rtM204V变异通常与其补偿突变rt L180M联合出现，rtM204V ／I株较野生株复制能力低，而rtL180M的出现使突变株HBV的复制接近野生株的水平圈。
目前报道发现的与LAM相关的主要耐药突变有rt M204V、rt M204I和rt L180M，其他的突变位点有rt L80V／I、rtI169T、rt V173L、rtTI84S和rtQ215S这些突变通常以下面不同的组合方式出：(1)trM204I／V+rtIJ80M；(2)rtM204I：(3)rtM204V+rtL1810M+rtV173L；(4)rtM204I+rtI80I：(5)rtM204I／V4+rtQ215S±rtL180M：(6)rtM204V+rtL180M+rtV173L+rtl169T；(7)rtA181T：(8)rtM204I／V+rtT184S±rtL180M：(9)rtM204S+rtLl80M。
这些HBV耐药突变株常以准种的形式存在，当使用LAM治疗后，突变株便可成为主要病毒侏。
LAM耐药的分子机制目前推断可能是rtM204位点参与形成了LAM与聚合酶的结合部位，rtM204位点发生突变后主要产生了两方面影响：(1)使dNTP结合位点甲基化，从而产生空间位阻降低了LAM与dNTP 底物的亲和力；(2)降低使LAM三磷酸根结合到正在复制的病毒DNA的催化活性，这些原导因致rtM204位点突变株的复制力减低，且与LAM的结合力低于野生侏，从而降低了LAM的抗病毒作用。
2.恩曲他滨（FTC）FTC属低耐药基因屏障药物，在临床应用中应密切关注其耐药情况。
体内与体外研究均表明FTC耐药位点与LAM相同，即rtM204V/I ± rtL180 M变异，FTC治疗1年的基因型耐药发生率为13%～16%，但缺乏长期的耐药数据。
在开始FTC治疗前应充分评估患者的治疗指征，详细了解患者既往治疗史。
免疫耐受期的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者除非需接受免疫抑制剂治疗等特殊情况，一般不建议进行抗病毒治疗。
首次出现ALT升高的CHB患者，应分析其可能的诱因，慎重开始抗病毒治疗。
FTC治疗期间应督促患者规范服药、定期随访，尽可能提高患者依从性。
如随访发现患者病毒学应答不佳或出现病毒学突破，应及时明确患者是否存在依从性问题。
排除依从性问题后，应及时进行HBV基因型耐药检测以明确FTC 耐药情况，相应调整治疗方案。
目前对于FTC耐药挽救治疗证据尚不充分。
参照LAM耐药挽救治疗情况，可考虑加用ADV或TDF 抗病毒治疗，亦可考虑换用TDF抗病毒治疗。
3.阿德福韦酯(ADV)ADV属于无环嘌呤类核苷酸类似物。
与LAM相比，在使用ADV初次治疗时，1～5年基因耐药变异的概率分别为0％、3％、6％、18％、29％，耐药发生的时间和机率都远低于LAM。
然而，在已产生了LAM耐药的患者中，单独改用ADV治疗1年和2年，基因耐药变异率分别升高为6.4％和25.4％，ADV 联合LAM治疗可降低耐药突变发生率，对于产生LAM耐药的患者，加用ADV为首选。
与LAM单点突变不同，ADV相关的耐药突变多为多点突变，目前得到学界公认的主要耐药位点有rt A181T、rt A181V和rt N236T，组合方式主要有四种：(1)rtA181V；(2)rtN236T；(3)rtAl81V+rtN236T；(4)rtA181T+rtN236T。
另外rtA181T突变也在长期使用LAM患者的HBV基因中检测到，但是，该突变并未合并rtM204I／V的突变。
有认为这是因为rtAl81V／T突变能改变rtM204密码子的位置，导致一个间接的催化位点空间位阻，从而使LAM的敏感性下降。
有进一步研究表明A181V／T突变株对LAM、LdT和ETV的敏感性都下降，但对TDF仍然敏感。
4.恩替卡韦(ETV)ETV是一种脱氧嘌呤核苷酸类似物，ETV对初治患者很少发生耐药，1-5年的累积耐药发生率分别为0.2％、0.5％、1.2％、1.2％与1.2％。
但对原有LAM耐药的患者，改用ETV，治疗1-5年后的临床耐药率分别为6％～7％、15％～16％、36％、46％和51％。
因此，ETV在LAM失效患者中的耐药发生率明显增加，产生LAM耐药的患者不推荐首选ETV。
这是因为ETV的耐药变异需要在rtM204+rtL180位突变的基础上，再联合rtT184、rtS202、rtM250和rtI169位点上一个或多个的氨基酸突变。
其耐药变异主要有两种模式：(1)rtM250v+rtIl69T+M204v+L18OM；(2) rtT184G+rtS202I+rtM204V+rtL180M。
有体外试验证实，rtM250位点突变可引起ETV的敏感性下降，单独rtI169位点的突变对ETV只低度耐药，但rtI169联合rtM250位点突变则可阻止DNA链延伸，从而降低ETV敏感性；rtT184和rtS202位点的突变可以改变YMDD附近的核苷酸聚合酶结合袋的几何构像，影响C区的两个催化性天门冬氨酸残基的编码，从而导致对药物的敏感性下降。
ETV需多个位点的突变才能出现耐药，表明它的高基因屏障。
由于ETV抗病毒治疗的有效性及低耐药性，被推荐为乙肝肝硬化失代偿期的一线用药。
5.替比夫定(LdT)LdT与LAM同属于L-构型核苷，与LAM耐药基序相似，都发生在YMDD区，但其耐药发生率低于LAM，对初治患者的第l与第2年累积耐药发生率分别为4％与22％。
而且LdT出现的耐药突变位点仅有rtM204I，尚未发现rtM204V变异。
原因尚不清楚，有研究认为可能与其抗病毒复制的高效能有关。
也有文献报道LdT相关的耐药突变还可发生在rtL80、rtL180、rtL181、rtL229等位点，其意义还有待进一步明确。
6.替诺福韦(TDF)TDF是一种新型核苷酸类逆转录酶抑制剂，国外已批准该药用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)和成人的慢性乙型肝炎。
在Ⅲ期临床实验中，替诺福韦治疗2年以上还未被证实有基因型耐药发生，但是此临床实验在治疗72周时对血清仍能检测到病毒者都增加使用了恩曲他滨，所以不能确定72周后单一使用替诺福韦治疗的耐药发生率。
有报道称rtA194T变异与TDF耐药相关，能够改变DNA模板与dNTP底物的结合位点，从而影响DNA合成。
