人乳头瘤病毒全基因组基因分型国家参考品的建立_孙彬裕

1. 2. 3 参考品盘的制备 将 20 个不同型别的质粒 用 1 mg·mL － 1 的正常人基因组溶液稀释至 106 copies·mL － 1 的浓度，然后将稀释后的质粒溶液分装在 1. 5 mL 的冻存管中。将 5 个阴性参考品溶液分装 在 1. 5 mL 的冻存管中。将阳性参考品和阴性参考 品组成参 考 品 盘，每 套 参 考 品 盘 包 含 阳 性 参 考 品： HPV 6、11、16、18、26、31、35、45、56、58、59、61、66、 67、69、71、73、81、82，阴性参考品： N1、N2、N3、N4、 N5。并将组合完毕的参考品盘放置 － 80 ℃ 保存。 1. 2. 4 参考品盘的分装后验证 采用中山大学达 安基因股份有限公司提供的 HPV 基因检测试剂盒 （ 荧光 PCＲ 法） 对分装的参考品进行验证。此试剂 盒为核酸检测试剂盒，不能进行基因的分型，检测结 果的显示方式为： 15 种高危型 （ 16、18、31、33、35、 39、45、51、52、56、58、59、68、73、82 ） 和 3 种中危型 （ 26、53、66） 显示为阳性，其余型别显示阴性。 1. 2. 5 不同公司对参考品盘的验证 选择 6 家人 乳头瘤病毒检测试剂盒生产或代理机构，用其自行 生产或代理的人乳头瘤病毒检测试剂盒对本参考品 进行验证。此 6 家公司生产的试剂的检测方法包 括： 基因芯片法、PCＲ － 荧光法、PCＲ － 反向杂交法、 杂交捕获 － 化学发光法等。验证的项目包括以下几 个方面： （ 1） 准确性（ 阳性符合率） ： 检测试剂盒检测 范围内 人 乳 头 瘤 病 毒 不 同 型 别 国 家 分 型 参 考 品； （ 2） 型特异性： 检测试剂盒检测范围以外的人乳头 瘤病毒型别； （ 3） 特异性： 检测 5 份阴性参考品。 1. 2. 6 参考品盘稳定性验证 将参考品反复冻融 5 次后，采用亚能生物技术有限公司提供人乳头瘤 病毒分型检测试剂盒（ PCＲ － 反向点杂交法） 进行稳 定性验证。 2 结果 2. 1 参考品原料的验证结果
* 通讯作者 黄杰 Tel： （ 010） 67095283； E － mail： huangjie5522@ yahoo. cn 高尚先 Tel： （ 010） 67095647； E － mail： gaoshangxian@ 126. com
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司 PCＲ － 反向点杂交法、金菩嘉公司 PCＲ － 表面等 离子谐振法、中山大学达安基因股份有限公司验证 结果的 PCＲ 荧光法等试剂盒，而目前国内尚没有分 型参考品对各种方法进行评价。本研究建立了包含 20 种不同型别的 HPV 质粒，为进行 HPV 分型检测 试剂盒评价和临床实验室质量评价提供了质控物 质。 1 材料方法 1. 1 材料 质粒（ 中量） 抽提试剂盒为 Axygen Scientific 公司产品，核酸提取试剂盒为天根生化科技 （ 北京） 有限公司产品，高浓度人基因组溶液 购 自 Sigma 公司。HPV 参考品研制所需的质粒为中国食 品药品检定研究院体外诊断试剂一室保存的质粒， 阴性参考品研制所需原料为收集其他病原体感染和 正常宫颈细胞，参考品验证所需试剂盒购自广州达 安基因股份有限公司和亚能生物技术有限公司，其 他化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。 1. 2 方法 1. 2. 1 参考品原料的制备 HPV 参考品研制所需 的质粒为中国食品药品检定研究院体外诊断试剂一 室保存的质粒。包含的基因型别有： HPV 6、11、16、 18、26、31、35、45、56、58、59、61、66、67、69、71、73、 81、82。将携带不同质粒的菌种在 LB 平板培养基 上划线，培养过夜，挑取单个菌落，接种至液体培养 基，在 37 ℃ 、200 r·min － 1 的条件下用摇床摇菌过 夜。用质粒（ 中量） 抽提试剂盒对各型别的质粒进 行提取，提 取 的 质 粒 溶 液 作 为 阳 性 参 考 品 的 原 料。 阴性参考品原料的来源为收集其他病原体感染和正 常宫颈细胞，提取核酸，组成阴性参考品。分别为沙 眼衣原体感染宫颈细胞提取核酸 N1、单纯疱疹病毒 感染宫颈细胞提取核酸 N2、解脲脲原体感染宫颈细 胞提取核酸 N3、巨细胞病毒感染宫颈细胞提取核酸 N4、正常宫颈细胞提取核酸 N5。 1. 2. 2 参考品原料的验证 由中国食品药品检定 研究院体 外 诊 断 试 剂 一 室 对 参 考 品 的 20 个 型 的 HPV 全基因组质粒进行浓度的测定。并且，将各型 别质 粒 送 北 京 华 大 基 因 公 司 进 行 测 序，用 NCBI Blast 比对测序结果。分别采用沙眼衣原体核酸检 测试剂盒（ 荧光 PCＲ 法） 、单纯疱疹病毒核酸检测试 剂盒（ 荧光 PCＲ 法） 、解脲脲原体核酸检测试剂盒 （ 荧光 PCＲ 法） 、巨细胞病毒核酸检测试剂盒（ 荧光 PCＲ 法） 以及人乳头瘤病毒核酸基因分型检测试剂 盒（ PCＲ － 反向点杂交法） 对组成参考品盘的所有参 考品原料进行验证。
感染及准确分型，可以及时进行早期干预治疗，是提 高防治效果的有效途径［4］。目前，HPV 分型检测的 主要技术是应用分子生物学的方法进行 HPV 的检 测。目前，市场上有许多种检测试剂盒，除了检测靶 序列 L1 序列外，还有检测 E6、E7 以及 E1 等基因， 部分试剂盒其检测靶序列为整个 HPV 基因组，主要 有美国 Digene 公司的杂交捕获法（ HC － II） 、上海透 景生命科技有限公司开发的流式荧光杂交法（ Luminex） 、凯普公司的反向杂交法、亚能生物技术有限公
药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33（ 型检测试剂盒（ PCＲ － 反向点杂交法） 验证结果 Fig 1 The verification result of assay kit for DNA genotyping of human papillomavirus（ PCＲ － reverse dot blot）
分型检测、对试剂盒进行质控和分型检测试剂盒评价提供质控物。方法： 通过对本科室保存的人乳头瘤病毒全基因组质粒进
行提取、测序，用测序正确的质粒连同收集的阴性参考品组成人乳头瘤病毒全基因组基因分型参考品盘，并用不同的方法对
本套参考品进行验证。结果： 采用不同的验证方法对本参考品进行验证，结果表明，参考品中 20 个型别的阳性参考品其型别
与验证结果一致，5 个阴性参考品验证结果均为阴性。结论： 成功建立了包含 20 种不同型别和 5 个阴性参考品的人乳头瘤病
毒全基因组基因分型国家参考品。
关键词： 人乳头瘤病毒； 基因分型； 参考品； 性能评价； 质量控制
中图分类号： Ｒ917
文献标识码： A
文章编号： 0254 － 1793（ 2013） 09 － 1597 － 06
DOI:10.16155/j.0254-1793.2013.09.001
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人乳头瘤病毒全基因组基因分型国家参考品的建立
孙彬裕，曲守方，徐超，黄杰* ，高尚先*
（ 中国食品药品检定研究院，北京 100050）
摘要 目的： 建立包含 20 种不同型别和 5 个阴性参考品的人乳头瘤病毒全基因组基因分型国家参考品，为人乳头瘤病毒基因
Establishment of national reference for genotyping of human papillomavirus genome
SUN Bin － yu，QU Shou － fang，XU Chao，HUANG Jie* ，GAO Shang － xian*
（ National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）
人乳头瘤病毒 （ human papillomavirus，HPV） 是 一种非均质、双股环形 DNA 病毒，现在报道的 HPV 型别已经超过了 120 种［1］。流行病学研究证实，高 危型 HPV 的持续感染是发生高度宫颈上皮内瘤变 （ cervical intraepithelial neoplasia，CIN） 和 宫 颈 癌 的 主要因素［2 － 3］。多项研究指出，各种 HPV 的同时感 染或 先 后 感 染 是 普 遍 现 象，有 研 究 证 实，已 感 染 HPV 的患者，再次感染新 HPV 的风险要高于从未 感染过 HPV 的女性。因此，早期发现高危型 HPV
Abstract Objective： To establish the national reference for genotyping of human papillomavirus （ HPV） genome including 20 different subtypes and 5 negative references and to provide quality control materials for the quality control of genotyping detection and evaluation of genotyping detection kits. Methods： The stored genome plasmid of human papillomavirus in our laboratory was extracted and sequenced，the reference panel was produced using the collected negative reference materials and the correct plasmid，then the reference panels were verified by various methods. Ｒesults： The verification of the reference by various verification methods demonstrated that the 20 types of positive references were consistent with the result and all the 5 negative references were conformed to be negative. Conclusion： The national references for genotyping of human papillomavirus genome including 20 genotypes and 5 negative references were established successfully. Key words： human papillomavirus； genotyping； reference substance； property evaluation； quality control
对参考品的 20 个型的 HPV 全基因组质粒送北 京华大基因公司进行测序。用 NCBI Blast 比对测序 结果。比对结果显示此 20 个型别的质粒的碱基序 列与 Genbank 中的人乳头瘤病毒的各个型别的基因 组的相似度在 99% 以上。
用乳 头 瘤 病 毒 核 酸 基 因 分 型 检 测 试 剂 盒 （ PCＲ － 反向点杂交法） 对组成参考品盘的所有参考 品原料进行验证。结果显示： 在试剂盒检测范围内 的阳性参考品显示为阳性，并且，检测型别与参考品 型别相符，在试剂盒检测范围外的参考品和阴性参 考品检测结果均为阴性，验证结果符合预期，检测结 果见图 1、表 1。