中山大学-植物生理学学实验-植物组织培养综述

植物组织培养XXX（中山大学生命科学学院生物技术与应用基地班广州 510275）摘要植物组织培养是细胞生物学研究中的常用技术。

主要内容是在人工模拟的植物体内生理环境中，对外植体进行培养，使其生存、生长、繁殖或传代，并加以观察和研究。

植物组织培养以细胞全能性为理论基础，实际操作包含培养基的配制、外植体的处理与消毒灭菌、接种、培养等主要步骤。

植物组织培养的成功与否受培养基成分、外植体的选择、实际操作等因素的影响。

关键词植物；外植体；组织培养；1 引言植物组织培养技术，是一种将植物体的部分细胞或组织与母体分离，在适当的条件下加以培养，使它们能够生长、发育、分化与增殖的技术。

原理是来自植物细胞的全能性分化能力，即植物体内的某一类细胞，能够独立发育并且分化成为完整的植物成体的能力。

植物组织培养能够以少量的母体培养出大量的植物，这使植物组织培养具有广泛用途。

植物组织培养技术的诞生发与展可溯已久。

1902年，德国植物学家G. Haberlanclt基于细胞全能性理论，提出了植物体细胞在适当的条件下, 可不断分裂分化, 最终发育成完整植株的潜力的观点。

1943 年, 美国学者White 在使用烟草愈伤组织作为实验材料的实验中,偶然培养得到了芽组织，首次证明了G. Haberlanclt观点具有正确性。

1958年，美国植物学家Stiefvater等人，利用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，最终得到完整且可以开花结果的植株，确切证实了G. Haberlanclt的观点。

进入20世纪60年代以后，组织培养技术在基础理论、实际操作方面不断取得进展，相继在植物体细胞杂交、单倍体育种、种质资源保存、快速育苗、人工种子制造、次生代谢物生产等方面有了可喜的成果，已经成为基础坚实、易于掌握、应用面广的一种技术手段，广泛应用于研究、生产的众多领域，创造了巨大价值。

[1][2]2 植物组织培养基本原理植物细胞的全能性是植物组织培养的理论基础。

外植体是离体的植物组织或细胞。

在适宜条件下在培养了一段时间后，外植体中高度分化的植物细胞会发生去分化作用变为薄壁细胞，薄壁细胞继续分裂会形成愈伤组织。

愈伤组织经过继续的培养，重新分裂分化形成根与芽（胚状体），而根和芽接下来可发育为含有叶、茎等器官的完全植物体。

植物组织培养的一个关键步骤就是诱导愈伤组织的形成，培养基在这里扮演了重要角色。

组织培养的基础培养基有MT、MS、SH、White、N等，目前普遍使用的是MS培养基。

MS培养基含有各种植物所需的大量元素、微量元素、有机物和植物激素。

其中植物激素作用关键,可以诱导产生愈伤组织、胚状体、不定芽、根等器官,其含量与种类还决定了植物组织的分化与发育方向。

[1][3]3 植物组织培养过程植物组培的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，用纤维素酶与果胶酶处理用以去掉细胞壁，使之露出原生质体，然后放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。

不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。

在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。

下面以我们的课程内容——菊花花瓣分化培养的基本操作为例介绍一下具体的步骤：培养基的配制实验所用MS培养基分为分化培养基和生根培养基：分化培养基成分为MS+3mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+糖3%+琼脂0.7%，pH 5.8。

生根培养基成分为MS+0.5mg/L NAA+糖3%+琼脂0.7%，pH 5.8。

②外植体的处理与消毒灭菌取新鲜的菊花花瓣，用清洁剂或洗衣粉洗净，之后自来水冲洗30min，干燥水分。

移入超净工作台，用70%的乙醇溶液消毒0.5min，后用0.1% HgCl2溶液消毒10min。

最后用无菌水洗5~7次，干燥水分。

③接种在超净台中把菊花花瓣头尾剪去，余下部分剪成0.8-1cm的小段，接种在承有培养基的150ml 锥形瓶中，每瓶1-2段。

④培养接种后，在26~28℃，光照度1000~2000lx，每天照光12h的实验室条件下培养14d左右，就可诱导出愈伤组织。

愈伤组织在原条件下培养10~15d便可分化出不定芽。

当芽长到1~2cm时，分割芽转入生根培养基中，继续培养10d上下，就可长出白根，形成完整的植株。

[2][4]4. 影响植物组织培养成功的因素植物组织培养成功与否，除了规范的操作作为保障，还与其它一些因素密切相关。

4.1 培养基成分4.1.1 基本培养基与pH 值不同植物、不同外植体进行植物组织培养培养要求的基本培养基均有差异。

不同基本培养基的成分（盐浓度、有机物含量等）会有不同。

例如，某一植物的外植体在培养过程中要求较高的盐浓度，而这样的浓度用于另一外植体则会造成褐化现象。

因此，二者要选择不同的基本培养基。

培养基的pH 值因培养材料不同而异, 大多数植物种类要求pH 值在5. 0~ 6. 0。

培养基的pH值可以通过影响培养物的营养元素的吸收过程来影响呼吸代谢、多胺代谢与脱氧核糖核酸合成、植物激素进出细胞等作用, 进而直接或间接地影响愈伤组织形成及形态建成；适当降低PH值还可有助于抑制褐化现象。

4.1.2 外源激素的种类和浓度植物组织培养中，只有使用适当的外源激素才能绣导细胞分裂的启动、愈伤组织生长以及根、芽的分化等合乎理想的变化。

不同的植物、不同的外植体对于不同种类、浓度的外源激素反应不同。

①生长素类生长素类的主要作用是使已停止分裂的植物细胞恢复分裂能力。

常用生长素有2, 4- D( 2, 4- 二氯苯氧乙酸) 、NAA( 萘乙酸) 、IAA( 吲哚乙酸)、IBA( 吲哚丙酸) 等。

不同植物种类对生长素的浓度反应不同, 一般而言, 2, 4- D 是生长素中诱导愈伤组织和实现细胞悬浮培养最有效的物质，常用浓度为0. 2~ 2. 0 mg / L。

实际效果视具体情况而定，例如较高浓度的2, 4- D 对 Chinese Leymus 组织培养再生芽的诱导和再生非常有效。

②细胞分裂素细胞分裂素通过促进细胞的分裂和扩大, 使茎增粗, 抑制茎伸长, 诱导芽的分化, 进而促进侧芽萌发生长。

常用的细胞分裂素有激动素( KT) 、6 - 苄基腺嘌呤( 6- BA) 等。

细胞分裂素在诱导愈伤组织的时候, 一般要和生长素配合使用, 增强生长素的诱导作用和效果。

在愈伤组织的诱导、器官发生和增殖过程中, 细胞分裂素和生长素的比例是非常重要的，当细胞分裂素含量高时产生不定芽, 反之, 产生不定根或维持愈伤组织。

而两者的具体比例因内、外源激素的含量不同而不同, 并且内、外源激素对植物离体培养形态发生起着相互的连续性作用。

细胞分裂素对某些植物胚性细胞的诱导有抑制作用。

因此, 要根据需要选用适当的细胞分裂素种类。

4.1.3 碳源碳源不仅给外植体提供能量, 而且也能维持一定的渗透压，是植物组织培养不可缺少的成分。

常用的碳源有果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗糖等。

植物对于不同糖的反应不同，而糖类的浓度大小不仅影响出愈率, 而且还影响愈伤组织的质地和结构。

例如，当糖类( 蔗糖或葡萄糖) 浓度由4% 降到1%时, 西黄松子叶愈伤组织由原来致密、干燥状变为松软包围着一层粘液膜的软湿状。

因此，碳源的选择要适当。

4.1.4 琼脂琼脂在植物组织培养中作为凝固剂。

琼脂含量低容易导致玻璃化现象发生。

4.2 外植体的选择同一植物不同的器官和组织, 变为外植体后，所需的培养条件是不同的；即使是相同种类的组织或器官，但存在生理学或发育年龄的差异，成功进行组织培养也需要不同的培养环境。

外植体的选择是影响组织培养效果的主要因素之一。

外植体脱分化难易程度与其生理状态有关。

外植体的年龄与分化程度对组织的再生能力有很大的影响。

通常植株的幼嫩组织, 如胚、子叶、实生苗的嫩茎和嫩芽、幼龄植株上的组织作为外植体要比老龄化植株上的组织容易诱导成功，分化程度低的外植体比高度分化的外植体容易诱导成功。

取材时间对培养的成功也会造成影响。

一般春季是植物生长的旺季, 植物再生能力最强, 是进行植物组织培养的最佳时节。

4.3 操作过程操作中有一些需注意的事项，关乎实验的成败：（1）接种需要严格执行无菌操作：用的工具、器具、培养基必须结果高压灭菌。

接种前，要用紫外消毒接种室20min，接种者要用肥皂洗干净双手，然后用70%酒精棉球消毒。

（2）外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件。

（3）要轻压外植体，保证与培养基的充分接触，但又要注意不可完全浸没，因为需要与空气接触。

（4）接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，培养期间应定期消毒，控制好温度和光照。

4.4 其它因素除了上述因素外，诸如实验经验、试剂品质等因素均会影响实验的成功率。

[5][6]参考文献[1]班振国,汤国庆等. 植物组织培养技术初探[J]. 内蒙古林业调查设计, 2009,32（3）:103-106.[2]梁一池,杨华. 植物组织培养技术的研究进展[J]. 福建农林大学林学院, 2002,22（1）:93-96.[3]肖哲丽,柳金凤. 植物组织培养的研究进展及新技术应用[J]. 宁夏农林科技, 2011, 52（1）:13-14.[4]王金发、何炎明.《细胞生物学实验教程》.2004年9月第一版.北京：科学出版社，2004.9:83-85，91-93.[5]李万德,杜桂等. 植物组织培养实验中存在的问题及其解决办法[J]. 湖北生态工程技术学院学报, 2006,4（2）:11-12.[6]张彦妮.影响植物组织培养成功的因素[J].北方园艺.2006(3):132-133Review on plant tissue culture technologyXXX( biotechnology and application,School of Life Science Sun Yat-sun University, Guangzhou, 510275) Abstract: Tissue culture is a kind of common methods of cell biology research..Its main point is to observeand research the explants growing,reproduing or passaging in a vitro environment simulating to the inner conditions of plants. Tissue culture is base on the theory of cell totipotency and it has several main steps that are the preparation of Culture medium ,the preparation of explants,disinfection,inoculation and training.Tissue culture will turn out to be successful or not depends on some important Tissue factor,such as Medium composition,choice of explants,practical operation and so on.Key words: plant; explant; tissue culture。