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H.E染色二甲苯：AR（国药）/500ml乙醇：AR（国药）/500ml苏木素： Leagene伊红： Leagene中性树胶：国药石蜡切片1. 二甲苯（Ⅰ）15 min2.二甲苯（Ⅱ）15 min需准备二甲苯两份，单独标记使用. 后面步骤中100%乙醇（Ⅰ）与100%乙醇（Ⅱ）同理。
3.梯度乙醇3.1.100%乙醇（Ⅰ）2 min3.2.100%乙醇（Ⅱ） 2 min3.3. 95%乙醇（Ⅰ） 2 min3.4.95%乙醇（Ⅱ） 2 min3.5. 80%乙醇 2 min3.6. 70%乙醇 2 min此步骤使用的梯度乙醇需单独配置，不宜与下一步乙醇混用4. 自来水冲洗 5 min5.苏木素10 min6. 自来水冲洗10 min7.1%盐酸乙醇30 s盐酸-乙醇配制: 浓盐酸1ml，70%乙醇99ml。
8. 自来水冲洗10min9. 1%伊红10min10. 自来水冲洗1min11. 梯度乙醇11.1 70%乙醇 2 min11.2 80%乙醇 2 min11.3 95%乙醇（Ⅰ） 2 min11.4 95%乙醇（Ⅱ） 2 min11.5 100%乙醇（Ⅰ） 2 min11.6 100%乙醇（Ⅱ） 2 min12. 二甲苯（Ⅰ）10 min13. 二甲苯（Ⅱ）10 min14. 中性树胶封固树胶使用量根据组织面积大小决定，一般为三滴左右染色步骤依次进行，每次换到新染色液前需用吸水纸擦干玻片，注意不要触碰组织冰冻切片1. 苏木素染色10 min2. 自来水冲洗10 min冰冻切片易脱，自来水洗时水流不宜过大3. 1%盐酸乙醇30 s4. 自来水冲洗10min5. 1%伊红10min6. 自来水冲洗1min7. 梯度乙醇7.1 70%乙醇 2 min 7.2 80%乙醇2 min7.3 95%乙醇（Ⅰ） 2 min7.4 95%乙醇（Ⅱ） 2 min7.5 100%乙醇（Ⅰ）2 min7.6 100%乙醇（Ⅱ） 2 min8. 二甲苯（Ⅰ） 5 min9. 二甲苯（Ⅱ） 5 min10. 中性树胶封固。
HE 染色的步骤
待干燥后的切片进行HE 染色，具体操作如下：1、脱蜡：室温条件下，将切片
夹于弹簧夹上，然后置于二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ（各10 min）→无水乙醇：二甲苯（1：1、3 min）；2、下行梯度酒精复水：无水乙醇Ⅰ→无水乙醇Ⅱ→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇（各3
~
5 min）；3、苏木素染色：将脱水后的切片置于苏木素内染
色（15 min），然后蒸馏水洗涤 2 次；4、盐酸分化：用0.25%盐酸快速分化；5、蓝化：将切片置于30℃左右的自来水中蓝化（20 min）；6、上行梯度酒精脱水：50% 乙醇→70%乙醇→85%乙醇→95%乙醇（各3
~
5 min）；7、伊红染色：将切片置于伊红染
液中染色（15S）；8、脱水：95%乙醇（5 min）→无水乙醇Ⅰ（10 min）→无水乙醇Ⅱ（10 min）→无水乙醇：二甲苯（1：1、3 min）9、透明：二甲苯Ⅰ（10 min）→
二甲苯Ⅱ（10 min）；10 、封片：用中性树脂胶将切片封好即可。
he染色的操作流程原理下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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将组织样本迅速放入固定液中，以防止组织自溶和腐败。
![HE染色步骤[推荐]](https://img.taocdn.com/s1/m/645e26c84793daef5ef7ba0d4a7302768f996f61.png)
HE染色步骤[推荐]
染色是加入染料将细胞或组织着色的过程。
HE染色是指使用
血红蛋白染成红色，细胞核染成蓝色的染色方法。
HE染色步骤如下：
1. 取制好的玻片（细胞或组织已固定在玻片上），用甲醇或乙醇进行脱水，使细胞或组织变得透明。
2. 将玻片放入染料盒中，加入苏丹三液（血红蛋白染料）浸泡。
时间通常为5-10分钟。
洗净玻片以去除多余的染料。
3. 将玻片放入氧化性酸液中（酸性洗涤液或稍微含有酒精的酸性水溶液），将苏丹三液中的铁离子还原成溶于水的亚铁离子。
时间通常为1-2分钟。
4. 接下来，将玻片放入碱性染色液中（含有甲苯重组溶液和酸性洗涤液的甲苯重组溶液），染色液中的亚铁离子被氧化成沉淀（血红蛋白）。
5. 最后，将玻片漂洗并脱水，然后用透明介质将玻片封闭，使其防止氧化。
通过HE染色，可以使细胞核染成蓝色，血红蛋白染成红色，
从而在显微镜下清晰地观察细胞或组织的结构和特征。
这是一种常用的组织学染色方法。
HE染色方法与步骤吐血整理染色是一种常见的实验技术，用于观察和分析生物样品中的细胞或组织结构。
HE染色是一种常用的组织和细胞染色方法，它能够同时染色细胞核和细胞质，因此得名HE（hematoxylin and eosin）染色。
下面是HE染色的步骤：1.染色前的准备工作：-选择合适的组织样品，通常是已固定和包埋的组织切片。
-准备好需要使用的试剂和设备，包括显微镜玻片、切片刀、染色盘、醇和蜡解剂、染色液和显微镜。
-将切片从包埋蜡中去蜡，并通过浸泡在蜡解剂中来溶解蜡质。
2.组织切片的处理：-将组织切片通过水洗涤，去除蜡解剂和剩余的蜡质。
-将切片通过不同浓度的醇溶液进行脱水处理，使得切片逐渐转移到无水状态。
-将脱水处理后的切片通过透明质量更好的试剂（如亚硫酸氢钠或甘油）进行透明处理，以利于细胞的观察。
3.组织切片的染色：-首先进行碱性染色，即将切片浸泡在染色盘中的伊洛酮溶液中，伊洛酮是一种天然的染色物质，能够与细胞核结构中的DNA结合，使细胞核染色为暗蓝色。
-然后进行酸性染色，即将切片浸泡在染色盘中的苏木精溶液中，苏木精是一种带正电荷的染色物质，能够与细胞质结构中的负电荷部分结合，使细胞质染色为粉红色。
4.组织切片的脱水和封片：-将染色后的切片通过不同浓度的醇溶液进行脱水处理，使得切片从水状态逐渐转移到无水状态。
-将切片在醇溶液中固定一段时间，然后转移到透明的试剂（如苏木精和二甲苯混合溶液）中进行浸泡。
- 最后将切片取出，放在显微镜玻片上，滴入固定剂（如Canada Balsam）并加盖玻片，使切片固定在玻片上。
5.显微镜观察和分析：-使用显微镜观察染色后的组织切片，并通过不同增大倍数的镜头进行详细观察。
-根据观察到的细胞和组织结构，进行分析和研究，并将观察结果记录下来。
需要注意的是，HE染色是一种简单、快速且广泛应用的染色方法，但在不同类型的组织和细胞中可能会有不同的染色效果。
因此，在进行HE染色时，需要根据具体实验要求和样品的特点，进行相应的优化和调整。
HE染色法HE染色法整个染色过程包括五个内容：脱蜡,染色,脱水,透明和封固。
(一)脱蜡:1.从温箱中取出烤干的切片,立即投入二甲苯中脱蜡5～10min(可在二瓶中进行),脱蜡时间长短取决于蜡是不彻底溶解。
气温低可延长时间,气温高可适当缩短时间或在温箱中加速脱蜡。
2.移入无水酒精(100%)(二瓶)中,约2min。
3.移入90%酒精中(二瓶),约2min。
4.移入80%酒精中(二瓶),约2min。
5.移入70%酒精中,约2min。
6.移入水中,洗去酒精,约2～3min。
7.移入蒸馏水中,约2min。
(二)染色:1.移入苏木素中,浸染8～15min,一般以稍深染为宜。
2.移入水中,洗去苏木素和浮色,约1～2min。
3.移入分化液(1%盐酸酒精)中,分化几秒至30秒钟, 使切片褪色至淡兰红色即可。
分化的作用,可使细胞浆兰色脱去,而细胞核更加清晰,鲜丽,分化不足时,胞浆带兰,胞核过染,分化过度时,胞核太淡,难以辩认,可再退回苏木素染液, 延长一定时间。
4.移入流水中,洗涤30～60min,使组织呈鲜兰色或天兰色(兰化)。
5.移入伊红液中,浸染2～5min,如着染缓慢 , 可在伊红液中加入冰醋酸 (100ml伊红液加1～2滴冰醋酸)以助染。
6.移入水中,洗去伊红浮液,并用纱布擦净玻片上的多余染料。
(三)脱水:1.吸去玻片上的水分后多入80%酒精中,(二瓶)脱水,约1～2min, 如在酒精中褪色很快时,可迅速移入90%酒精或返回伊红液中复染。
2.移入90%酒精中(二瓶)脱水,约2～4min。
3.移入无水酒精(100%酒精)(二瓶)彻底脱水,约4～8min。
(四)透明1.移入二甲苯Ⅰ中透明3～5min。
2.移入二甲苯Ⅱ中透明5～10min。
(五)封固:用树胶封固,先从二甲苯Ⅱ中取出切片,将组织外围的二甲苯迅速擦去,在滴上一滴树胶于组织片上,然后取干净的盖玻片,仔细加在封固剂上,慢慢压平, 使盖片位置适中。
切片封固后,放在温箱中烤干,或平置凉干后装盒。
he染色流程步骤HE 染色啊，这可是病理实验中的一项重要技术呢！就好像是给组织细胞精心打扮一番，让它们能更好地展现在我们眼前。
首先得准备好切片，这就像是给模特准备好展示的舞台。
切片要切得薄而均匀，就像裁衣服一样，得有好手艺。
然后把切片放到烤片机上稍微烤一下，让它能稳稳地待在那儿，就像给它定个型。
接下来就是染色的关键步骤啦！先把切片放到苏木精溶液里泡一泡，这苏木精就像是神奇的魔法药水，能让细胞核变得蓝汪汪的，特别好看。
就好像给细胞核穿上了一件蓝色的漂亮衣服。
染完细胞核，就得让细胞质也美起来呀。
这时候就要用到伊红溶液啦，把切片放进去，细胞质就会染上那鲜艳的红色，哇，一下子就生动起来了，就像给细胞质化了个美美的妆。
染完色可还没完事儿呢！还得经过一系列的脱水、透明步骤。
就好像给化好妆的模特做最后的整理，让一切都更加完美。
脱水呢，就像是把多余的水分挤出去，让切片变得更清爽。
透明呢，则像是给切片罩上一层薄薄的面纱，让它更有朦胧美。
最后一步就是封片啦！把切片用盖玻片封起来，就像是给模特穿上了一件华丽的外套，保护好它。
你说这 HE 染色是不是很神奇呀？就这么一步步的，把那些原本我们肉眼很难看清的组织细胞变得清晰又漂亮。
它就像是一个小小的魔法，让我们能更好地了解身体内部的奥秘。
想想看，如果没有 HE 染色，我们怎么能那么清楚地看到细胞的结构和形态呢？怎么能对疾病做出准确的诊断呢？它可是病理诊断的重要手段之一呢！所以啊，一定要好好掌握 HE 染色的流程步骤，这可关系到我们对生命的探索和了解呢！可不能马虎哟！这就像是学一门手艺，得用心去学，才能学好。
你说是不是呢？你要是学会了这一手，那可就厉害了，感觉就像掌握了打开生命奥秘大门的钥匙呢！。
HE染色方法与步骤吐血整理HE染色试剂配置A：0.5~1%的伊红酒精溶液：称取伊红Y0.5~1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。
以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。
B：苏木素染液配方：(配制3000ml，可按比列减少)苏木精6g无水乙醇100ml硫酸铝钾150g蒸馏水2000ml碘酸钠1.2g冰醋酸120ml甘油900ml配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。
C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。
染色流程(1)二甲苯（Ⅰ）15min(2)二甲苯（Ⅱ）15min（3）二甲苯：无水乙醇=1:12min(4)100%乙醇（Ⅰ）5min(5)100%乙醇（Ⅱ）5min(6)80%乙醇5min(7)蒸馏水5min(8)苏木精液染色5min(9)流水稍洗去苏木精液1-3s(10)1%盐酸乙醇1-3s(11)稍水洗10-30s(12)蒸馏水过洗1-2s(13)0.5%伊红液染色1-3min(14)蒸馏水稍洗1-2s(15)80%乙醇稍洗1-2s(16)95%乙醇（Ⅰ）2-3s(17)95%乙醇（Ⅱ）3-5s(18)无水乙醇5-10min(19)石炭酸二甲苯5-10min(20)二甲苯（Ⅰ）2min(21)二甲苯（Ⅱ）2min(22)二甲苯（Ⅲ）2min(23)中性树胶封固注：①第（11）、（12）步可省去，（13）步冲水时间需延长至20-30min。
②第（21）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。
*冷冻切片HE染色步骤：（1）冰冻切片固定10～30s（2）稍水洗1～2s（3）苏木精液染色（60℃）30～60s（4）流水洗去苏木精液5～10s（5）1%盐酸乙醇1～3s（6）稍水洗1～2s（7）促蓝液返蓝5～10s（8）流水冲洗15～30s（9）0.5%曙红液染色30～60s（10）蒸馏水稍洗1～2s（11）80%乙醇1～2s（12）95%乙醇1～2s（13）无水乙醇1～2s（14）石炭酸二甲苯2～3s（15）二甲苯（Ⅰ）2～3s（16）二甲苯（Ⅱ）2～3s（17）中性树胶封固。
HE染色操作流程HE染色（Hematoxylin and Eosin Staining）是一种常用的组织学染色方法，用于观察和诊断组织学切片。
HE染色通过染色剂HE染料的组合，使细胞核染成紫色，胞质染成粉红色，从而揭示组织的结构与形态。
HE染色的操作流程一般包括标本处理、脱水、透明化、分解蜡和染色五个步骤。
下面将详细介绍每个步骤的具体操作。
1.标本处理：首先，将切割好的组织标本放入10%中性缓冲福尔马林进行固定，一般固定时间为24-48小时。
固定后，将组织标本转移到70%乙醇中进行离子交换，使组织中的水分逐渐去除。
2.脱水：将固定的组织标本依次转移到浓度逐渐提高的乙醇溶液中，如80%乙醇、95%乙醇和绝对乙醇，每个乙醇浓度保持15-30分钟。
这个过程称为脱水，目的是逐渐去除组织中的水分，使组织内的乙醇浓度逐渐升高。
3.透明化：将脱水后的组织标本依次转移到透明剂中，如苯并三氮唑、次氯酸、二氯甲烷等。
每种透明剂浓度和时间要根据实验需求进行调整，这个步骤的目标是使组织中的乙醇慢慢溶解，透明度增强。
4.分解蜡：将透明后的组织标本转移到蜡纸中，加热到60-65°C的融点，使固定的组织标本逐渐融化。
蜡纸是由石蜡和植物油混合而成，有助于固定和保护组织的形态。
5.染色：将脱蜡的组织标本依次转移到碱性染料（如血红素）溶液中，染10-15分钟，然后洗净；接着将组织标本转移到酸性染料（如紫杉醇）溶液中，染5-10分钟，然后洗净。
紫杉醇染料使细胞核染色成紫色，血红素染料使细胞胞质染色成粉红色。
最后用安全过滤垫将组织标本封装在玻片上，去除水分，然后用覆盖玻片进行固定。
HE染色试剂配置A：0.5~1%的伊红酒精溶液：称取伊红Y0.5~1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。
以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。
B：苏木素染液配方：(配制3000ml，可按比列减少)苏木精6g无水乙醇100ml硫酸铝钾150g蒸馏水2000ml碘酸钠1.2g冰醋酸120ml甘油900ml配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。
C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。
染色流程(1)二甲苯（Ⅰ）15min(2)二甲苯（Ⅱ）15min（3）二甲苯：无水乙醇=1:12min(4)100%乙醇（Ⅰ）5min(5)100%乙醇（Ⅱ）5min(6)80%乙醇5min(7)蒸馏水5min(8)苏木精液染色5min(9)流水稍洗去苏木精液1-3s(10)1%盐酸乙醇1-3s(11)稍水洗10-30s(12)蒸馏水过洗1-2s(13)0.5%伊红液染色1-3min(14)蒸馏水稍洗1-2s(15)80%乙醇稍洗1-2s(16)95%乙醇（Ⅰ）2-3s(17)95%乙醇（Ⅱ）3-5s(18)无水乙醇5-10min(19)石炭酸二甲苯5-10min(20)二甲苯（Ⅰ）2min(21)二甲苯（Ⅱ）2min(22)二甲苯（Ⅲ）2min(23)中性树胶封固注：①第（11）、（12）步可省去，（13）步冲水时间需延长至20-30min。
②第（21）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。
*冷冻切片HE染色步骤：（1）冰冻切片固定10～30s（2）稍水洗1～2s（3）苏木精液染色（60℃）30～60s（4）流水洗去苏木精液5～10s（5）1%盐酸乙醇1～3s（6）稍水洗1～2s（7）促蓝液返蓝5～10s（8）流水冲洗15～30s（9）0.5%曙红液染色30～60s（10）蒸馏水稍洗1～2s（11）80%乙醇1～2s（12）95%乙醇1～2s（13）无水乙醇1～2s（14）石炭酸二甲苯2～3s（15）二甲苯（Ⅰ）2～3s（16）二甲苯（Ⅱ）2～3s（17）中性树胶封固。
注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。
染色结果：细胞核蓝色，胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。
4．12切片脱水透明切片经HE染色后，要彻底脱水透明，才能用中性树胶封盖。
如果脱水不彻底，封片后呈白色雾状，镜下观察模糊不清，且容易褪色。
切片1-2级无水乙醇脱水，也可使用石碳酸二甲苯进行脱水。
石碳酸有较强脱水能力，但长时间可使切片脱色，因此要经过多次二甲苯以使石碳酸完全除去。
5.H-E染色评定标准：（1）切片完整，厚度4-6微米，厚薄均匀，无皱褶无刀痕；（2）染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。
4 染色结果编辑细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。
细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。
胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。
着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。
例如，很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。
胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。
Masson染色,用于显示组织中纤维的染色方法之一。
试剂：Regaud 氏苏木精：苏木精1g，95%酒精10ml，甘油10ml，蒸馏水80ml。
将苏木精加入蒸馏水内加温溶解,冷却后加入酒精和甘油,放数日后即可应用。
Masson丽春红酸性复红液：丽春红0.7g，酸性复红0.3g，蒸馏水99ml，冰醋酸1ml。
0.2%冰醋酸水溶液：冰醋酸0.2 ml，蒸馏水100 ml。
1%磷钼酸水溶液：磷钼酸1g，蒸馏水100 ml。
苯胺蓝水溶液：苯胺蓝2g，蒸馏水98 ml，冰醋酸2 ml。
1%光绿水溶液：光绿1g，蒸馏水100 ml。
Masson三色法步骤1．石蜡切片脱蜡至水。
2．铬化处理或去汞盐沉淀（甲醛固定的组织此步可略）。
3．依次自来水和蒸馏水洗。
4．用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5-10min。
5．充分水洗,如过染可盐酸酒精分化。
6．蒸馏水洗。
7．用Masson 丽春红酸性复红液5-10min。
8．以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。
9．1%磷钼酸水溶液分化3-5min。
10. 不经水洗,直接用苯胺蓝或光绿液染5min。
11．以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。
12．95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。
结果：胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色（如光绿液染色为绿色），胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，胞核黑蓝色。
体会与说明：1．控制好染色步骤。
2．组织固定起着很重要的作用，根据不同的固定液可延长或缩短染色时间。
3．0.2%冰醋酸水溶液洗，可使色调清晰鲜艳。
4．磷钼酸水溶液对丽春红、酸性复红有分化作用，分化时镜下控制，肌纤维和纤维素呈红色，胶原纤维呈淡粉红色即可。
天狼猩红染色[试剂配制](1)天狼星红饱和苦昧酸液O．5％天狼星红10ml，苦味酸饱和液90ml。
(2)天青石蓝液天青石蓝B1．25g．铁明矾1．25g，蒸馏水250ml。
溶解煮沸、待冷却过滤加入甘油30ml，然后再加入浓盐酸0．5ml。
[染色步骤](1)中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
(2)人大青石蓝液染5一lOmin。
(3)蒸馏水洗3次。
(4)天狼星红饱和苦昧酸浓染15-30min(5)无水乙醇直接分化与脱水。
Devil二甲苯透明，中性树胶封固。
[注意事项](1)细胞核里染色可以用Harris苏木素染色液谈染。
(2)染色封固后的切片，须及时用偏光显微镜进行观察和照相已保持鲜艳的色彩注：在偏光显微镜下可以观察到四种类型的胶原纤维。
l型胶原纤维：紧密排列，显示很强的双折光性，呈黄色或红色的纤维oll型胶原纤维：显示弱的双折光，呈多种色彩的疏松网状分布。
皿型胶原纤维：显示弱的双折光，呈绿色的细纤维。
lv型胶原纤维：显示弱的双折光的基膜，呈淡黄色。
免疫组化步骤（ABC法）1。
4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中过夜。
蜡块制作。
切片，贴片。
0.01MKPBS清洗5min×3后；2。
加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MKPBS 100ml＋30%过氧化氢）30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min×3；3。
加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100＋0.01MKPBS 100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MKPBS清洗5min×3；4。
加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋叠氮纳0.08g）稀释的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS洗5min×3；5。
加入0.01MKPBS稀释的的二抗，室温孵育2h。
0.01MKPBS洗5min×3；6。
加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次；7。
加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应；8。
梯度酒精脱水之后，封片，拍照。
免疫组化SP法步骤：SP(streptavidin-perosidase)法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法.按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。
按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。
一般的sp法步骤啊,具体如下：1.烤片，68℃，20分钟,2. 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min3.阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；4. 抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。
5. 正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗.6. 滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;8. DAB/ H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。
免疫组化（Elivision二步法）：（1）石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3’）。
（2）取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2×3’。
(注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定)（3）每张切片加1滴3% H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS冲洗3×3’。
（4）除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。
（5）PBS冲洗3×5’。
除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂（试剂A），室温下孵育20分钟。
PBS冲洗3×3’。
（6）除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B），室温下孵育30分钟。
PBS冲洗3×5’（7）除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液，显微镜下观察5分钟。
（8）苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。
