HE染色基本流程

HE（Hematoxylin & Eosin）染色基本流程苏木精—伊红染色法简称HE染色法，它是最常用的普通染色方法。

苏木精是阳离子染料，将细胞核内的嗜碱性物质染成蓝紫色。

伊红是阴离子染料，将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。

1、二甲苯脱蜡三道，每道30min2、无水乙醇两道，每道5min3、95%乙醇两道，每道5min4、80%乙醇5min5、70%乙醇5min6、50%乙醇5min7、蒸馏水3-5min8、苏木素染色液5-10min，根据染色结果和气温调整时间9、浸自来水冲洗多余的染色液10、0.5%盐酸酒精分色（70%酒精配制）3-10seconds11、水洗蓝化15-30min12、50%乙醇5min13、70%乙醇5min14、80%乙醇5min15、伊红染色液（95%乙醇配制）60seconds16、95%乙醇两道，每道5min17、无水乙醇两道，每道5min18、乙醇+二甲苯（1:1）5min19、二甲苯三道，每道5min20、中性树胶封片HE染色注意事项：1. 染色时调节pH值很重要。

如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。

因此，自来水中冲洗时间要长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。

染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

2. 切片染苏木精后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚（晰）而细胞质基本无色为佳。

如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。

3. 切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。

4. 在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。

5. 切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。

6. 最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。

组织固定及HE染色步骤
1、固定：刚取的新鲜组织块经福尔马林溶液固定48小时（一般固定2天）
2、用镶子取出放到大的蜡盒上，用刀片切成1*0.5厘米的小块，用小白蜡盒包上，放入80%
的乙醇中过夜
3、脱水：第二天早上8点，把蜡盒依次放入95% I的乙醇中（3h）— 95%II的乙醇中（3h）
—100% I的乙醇中（3h）— 100%II的乙醇中（过夜）
4、透明：第二天早8点从100%11的乙醇中取出小蜡盒放到二甲苯1、二甲苯II中各30 分钟
5、浸蜡：放入蜡缸中I、II、IIL中各浸泡30分钟
6、包埋
7、切片
8、烤片
HE染色
二甲苯 I （30min）—二甲苯II （30min）一100% I 的乙醇中（lOmin）一 100%II 的乙醇中（lOmin） 95%的乙醇中（5min）— 90%的乙醇中（5min）— 80%的乙醇中（5min）—自来水缸中浸泡5min —苏木精染核5min —水洗一1%的盐酸酒精分化一水洗一弱氨水返蓝一水洗一镜下观察一伊红染质（15min）—水稍洗一80%的乙醇、95%的乙醇I、95% 的乙醇II中各过一下即可一100% I的乙醇中（5min）— 100%II的乙醇中（lOmin）—二甲苯I （lOmin）一二甲苯II （lOmin）一中性树胶封片
免疫组化步骤
切片常规脱蜡至水洗预处理（热修复或酶消化）阻断3%的H202 PBS洗封闭加一抗（鼠或兔抗人） PBS洗加二抗（生物素标记IgG鼠或兔））PBS洗加三抗（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）PBS洗DAB（AEC或BCIP/NBT）显色水洗复染核水洗弱氨水返兰水洗脱水透明封片。

免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学（immunohistochemistry，简称IHC）是一种用于检测组织切片中特定蛋白质的方法，其原理是通过特异性抗体识别目标蛋白质并将其可视化。

本文将介绍IHC实验的基本步骤和HE染色实验的步骤。

IHC实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。

2.抗原修复：将组织切片放入含有钠胼胝土缓冲液或其它抗原修复液中进行抗原修复。

可以选择使用高温或酶解等方法。

3.阻断非特异性结合：将组织切片浸泡在阻断液中，如BSA、牛血清蛋白等，以防止抗体与非特异性的蛋白质结合。

4.一抗孵育：将含有一抗的抗体溶液滴在组织切片上，孵育一段时间，使一抗与目标蛋白质发生特异性结合。

5.二抗孵育：选择与一抗宿主不同的二抗标记物，如荧光素、过氧化物酶等，将含有二抗的溶液滴在组织切片上进行孵育。

6.吸附剂清洗：将组织切片用洗涤缓冲液洗去未与标记物结合的二抗。

7.标记物检测：根据所选择的标记物，可以进行荧光显微镜观察、酶反应等，将目标蛋白质可视化。

8.盖片封装：将组织切片用适当的缓冲液封装至玻璃盖片上。

HE染色实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。

2.脱蜡：将组织切片放入甲醇中脱去石蜡包埋。

3. 染剂处理：将组织切片依次浸泡在嗜铬酸钾溶液中，漂洗后浸泡在碱性染剂中，如伊红（Eosin）染料。

4. 酸性染剂处理：将组织切片浸泡在酸性染剂中，如苏木红（Hematoxylin）染料。

5.脱染：将组织切片用酒精和醋酸溶液进行脱染。

6.脱水：将组织切片依次浸泡在酒精梯度中，脱去水分。

7.透明化：将组织切片逐渐浸泡在透明剂中，如苯酚乙醇、二甲苯等，使组织切片透明。

8.盖片封装：将组织切片用适当的透明剂封装至玻璃盖片上。

以上是免疫组织化学和HE染色实验的基本步骤。

通过这些步骤，可以标记和可视化组织切片中的特定蛋白质，进而获得研究和诊断所需的信息。

细胞HE染色的标准操作规程（SOP）SOP编号：SOP-YK-QT-019-1 页数：4制定人：审核人：批准人：（签名、日期）（签名、日期）（签名、日期）生效日期：颁发日期：修订登记：审查登记：一、目的是细胞水平的实验研究的基础。

二、准备1.器材：手术刀、剪、镊、止血钳、空针、解剖针和不锈钢或泥龙筛网、培养皿、小烧杯、吸管、离心管、三角瓶、棉球、血细胞计数板。

2.消毒：2.1工作台的消毒：操作前用紫外线照射30分或消毒液、酒精棉球擦拭消毒。

2.2器材的消毒：对解剖器械和器具高温高压消毒，对取材过程中要用到的培养液、平衡盐溶液以及蛋白酶消化液等用微孔滤膜过滤除菌。

2.3操作者的消毒：按外科手术要求洗手和着装。

肥皂水洗手后，消毒液洛本清擦拭，穿衣，戴帽子口罩和手套。

实验过程中怀疑被污染可用酒精擦拭。

3.取材及制备培养材料的基本步骤∶3.1切取或摘取欲培养的动物器官或大块组织，在培养液或平衡盐溶液中洗涤去除血污，剔除附带的脂肪组织、被膜结蒂组织及坏死组织。

必要时可借助显微镜，操作过程中不断给组织块滴加培养液或平衡盐溶液以保持湿润。

3.2将所取的组织块放在盛有培养液的培养皿中，解剖显微镜下将组织切成1mm3左右的小块用于植块培养。

3.3分离细胞培养，先在培养液或平衡盐溶液中剪碎组织，将组织连同培养液用吸管吸至离心管中静置，组织下沉后吸去上清。

加蛋白酶消化液密封，置37度或其他温度条件下消化15～45分，中途用手摇匀数次。

消化结束后吸去含酶溶液，加蛋白酶抑制剂或含血清的培养液终止蛋白酶活性。

用吸管或空针吸取液体吹打组织，以组织块刚好消散为宜。

3.4将制备好的细胞悬液用不锈钢网筛过滤，收集滤液。

如果未滤过的组织过多，可重复上述步骤3)然后再次过滤。

3.5离心滤过液，转速为800～1000r/min，时间为5～10min。

3.6弃上清，将细胞沉淀用少量细胞培养液重新制备为细胞悬液。

3.7细胞计数板计数细胞密度。

he染色流程HE染色是一种常用的生物化学实验技术，用于检测样本中的蛋白质是否存在或定性分析蛋白质的相对含量。

下面是HE染色的基本流程：样品制备：首先，需要准备待检测的蛋白质样品。

通常情况下，蛋白质样品需要先进行预处理，如去除杂质、分离纯化、浓缩等。

样品制备的目的是确保待检测的蛋白质样品质量可靠、浓度准确。

染色液配制：HE染色需要使用特殊的染色液，其中包含了对蛋白质有特异性反应的化学试剂，如考马斯亮蓝、甲醇、乙醇等。

根据具体的实验需求，需要选择适当的染色液和染色条件。

蛋白与染色液反应：将准备好的蛋白质样品与染色液混合，在适当的条件下反应，通常是室温或微温，使蛋白质与染色液发生特异性反应。

这个过程需要注意控制反应时间，通常在30分钟到1小时之内。

样品清洗：反应完成后，需要将染色的样品进行清洗，以去除未反应的物质和干扰因素。

这个过程通常需要使用缓冲液或生理盐水，以确保清洗的效果。

观察和结果分析：清洗后的样品需要进行观察和结果分析。

通常情况下，观察可以通过肉眼观察或使用生物显微镜进行，同时可以结合扫描或摄影进行数据记录。

结果分析需要根据具体的实验需求和检测的蛋白质种类进行判断，如通过光密度扫描或荧光分析等。

在HE染色的流程中，需要注意以下几点：样品制备过程中需要注意蛋白质的质量和浓度，以确保检测结果的可靠性。

在选择染色液时需要根据实验需求和蛋白质的特点进行选择，以避免干扰因素。

在反应过程中需要注意控制反应时间、温度和pH值等条件，以确保反应效果。

在样品清洗过程中需要注意选择适当的清洗液和清洗时间，以去除未反应的物质和干扰因素。

在结果分析过程中需要结合具体的实验需求和检测的蛋白质种类进行判断，以得出准确的结论。

总之，HE染色的流程包括样品制备、染色液配制、蛋白与染色液反应、样品清洗和观察和结果分析等多个步骤。

在实验过程中需要注意细节和条件控制，以确保检测结果的可靠性。

病理片HE染色步骤病理片HE染色步骤：烤片80度半小时(1)二甲苯（Ⅰ）5min(2)二甲苯（Ⅱ）5 min(3)二甲苯（III）5min(4)100%乙醇（Ⅰ）2min(5)90%乙醇（Ⅱ） 2 min(6)80%乙醇（III）2min(7)70%乙醇（IV）2 min(8) 流水冲洗5min(9) 苏木精液染色5 min(10) 流水稍洗去苏木精液1-3 s(11) 1%盐酸乙醇1-3 s(12)流水过洗至返蓝(13) 0.5%伊红液染色1-3 min(14) 蒸馏水稍洗1-2 s(15) 80%乙醇稍洗1-2 s(16) 95%乙醇（Ⅰ）2-3 s(17) 100%乙醇（Ⅱ）3-5 s(18) 二甲苯（Ⅰ）2 min(19) 二甲苯（Ⅱ）2 min(20) 二甲苯（Ⅲ）2 min(21) 中性树胶封固* 冷冻切片HE染色步骤：（1）冰冻切片固定10～30 s（2）水洗1～2 s（3）苏木精液染色（60℃）30～60 s（4）流水洗去苏木精液5～10 s（5）1%盐酸乙醇1～3 s（6）稍水洗1～2 s（7）促蓝液返蓝（8）流水冲洗15～30 s（9）0.5%曙红液染色30～60 s（10）蒸馏水洗1～2 s（11）80%乙醇1～2 s（12）95%乙醇1～2 s（13）无水乙醇1～2 s（14）石炭酸二甲苯2～3 s（15）二甲苯（Ⅰ）2～3 s（16）二甲苯（Ⅱ）2～3 s（17）中性树胶封固。

H-E染色评定标准：（1）切片完整，厚度4-6微米，厚薄均匀，无皱褶无刀痕；（2）染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。

HE染色操作常规流程
切好的片子应在60~70℃左右的烤箱中烘烤30分钟以上才能进行染色。

HE染色手工程序：
脱蜡
1、二甲苯Ⅰ（AR）5分钟
2、二甲苯Ⅱ（AR）5分钟
3、100%酒精Ⅰ（AR、无水乙醇）1分钟
4、100%酒精Ⅱ（AR、无水乙醇）1分钟
5、95%酒精（工业酒精或医用酒精）1分钟
6、80%酒精（工业酒精或医用酒精）1分钟
7、自来水浸洗1分钟
以上3~7称为进水过程。

染色
1、苏木素染液6分钟
2、水冼1分钟
3、0.5-1%盐酸酒精分化片刻（上下三次颜色由蓝变红）
4、自来水冲冼15分钟以上
（然后95%酒精片刻，主要是避免所带的水份稀释以下的伊红酒精，此步可免）
5、1%伊红酒精浸染1~2分钟
6、水冼1分钟
脱水、透明、封固
95%酒精Ⅰ1分钟
95%酒精Ⅱ1分钟
100%酒精Ⅰ1分钟
100%酒精Ⅱ1分钟
石炭酸二甲苯(1:3) 10秒钟
以上称为脱水。

二甲苯Ⅰ透明1分钟
取出后用中性树胶（上海产，预先用二甲苯溶解，粘稠度适中即可）封固。

染色结果：
核：蓝黑色
胞浆：不同程度的粉红色
肌纤维：较深的粉红色
胶元纤维：淡红色
红细胞：桔红色。

(13)蒸惚水过洗 1-2 S80%乙醇常规HE 染色步骤(1)二甲苯(I ) 5-10 min(2)二甲苯(H) 5-10 min⑶95%乙醇(1 ) 1-3 min(4) 95%乙醇(11)1-3 min(6) 裁馆水 1 min(7) 苏木液染色 5-15 min(8 ) 流水稍洗去苏木液 1-3 S(9) 1%盐酸乙醇 (10)稍水洗 10-30 S(11)促蓝液返蓝 10-30 S(12)流水冲洗 10-15 min(14) 0.5%曙红液染色1-3 min1 min（1）冰冻切片固定 10 〜30 S95%乙醇（I ）注：①第（10） . （11）步可省去，（12）步冲水时间需延长至20-30mino ②第（20）步如果不川石炭酸二甲苯，可改川无水乙醇。

(16) 80%乙种稍洗1-2 S(18) 95%乙醇（11） 3-5 S(19) 无水乙醇 5-10 min(20) 石炭酸二屮苯 5-10 min(21) 二甲苯（I ） 2 min(22) 二甲苯（II ） 2 min(23) 二甲苯（m ） 2 min(24) 中性树胶対尚2-3 S*冷冻切片HE染色步骤:（2）稍水洗1-2 S （1）冰冻切片固定10 〜30 S(16) 二甲苯（II ） 2—3 S苏木粘液染色（60・C ）30 〜60 S流水洗去苏木耕液 5~10 S(6) (8) 1%盐酸乙醇 稍水洗促蓝液返蓝流水冲洗 （9） 0.5%曙红液染色 （10）熬他水稍洗 (11) 80%乙醇 (12) 95%乙醇 (13) 无水乙醇 (14) 石炭酸二甲苯(15) 二甲苯（I ）1~3 S5 〜10 S15 〜30 S30 〜60 S(17) 中性树胶封固。

注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。

染色结果：细胞核蓝色、胞质、肌纤维、胶療纤维和红细胞呈深浅不一的红色。

4. 12切片脱水透明切片经11E染色后.要彻底脱水透明，才能用中性树胶封盖，。

HE染色程序1．取材与固定:一般取0。

5立方米，基本不用再次修形。

置于4%甲醛溶液中，至少固定24小时.室温保存即可。

2．水洗:视组织块大小而定。

一般与固定时间相等或至少水洗24小时。

3．脱水：70％酒精（过夜或2h）→80%酒精（过夜或1h）→90％酒精（1h）→95%酒精Ⅰ（1h）→95%酒精(1h）Ⅱ→100％酒精Ⅰ(1h)→100％酒精Ⅱ（1h)，梯度酒精脱水注:当酒精浓度逐渐升高时，特别是100%的酒精，注意观察组织块情况，不能脱水脱过了，如果拖过了，切片时，组织易碎.如果水脱的不彻底，则浸蜡时,蜡不能完全浸入，也会影响后期切片.4、透明：二甲苯Ⅰ（10min）→二甲苯Ⅱ(10min) 。

5、浸蜡：58℃ 1。

5-2h （一般用新蜡)6、包埋：叠好的蜡槽,一般深1cm，宽1cm，长7cm，放4个组织块为宜。

注:包埋一般采用旧蜡,避免产生气泡.包埋时用来夹取组织块的镊子，要同时放在蜡箱里预热。

先向蜡槽内倒蜡，然后用预热的镊子夹取浸蜡缸中的组织，放到蜡槽底部,尽量避免漂浮.包埋后，就不要挪动蜡槽了,否则组织漂浮在蜡槽的表面。

7、常规切片，一般组织3-5微米，神经组织切7微米.展片温度为52摄氏度。

捞片时刻直接从95％的酒精中取载玻片直接捞片，不必擦干载玻片上的酒精.捞好片后，置于37度温箱恒温干燥过夜.8、切片脱蜡：二甲苯Ⅰ（5min）→二甲苯Ⅱ（8min），9、水化：100％酒精（1min）→90％酒精（1min)→80%酒精（1min）→70％酒精(1min)10、水洗2-5min11、苏木素染色15-20min12、水洗至灰黄色13、分化：1％盐酸酒精分化30s至桃粉色，14、水洗返蓝：2-3h15、伊红染色：15min16、脱水：70％酒精(10s)→80%酒精（20s）→90%酒精（30s）→95％酒精（1min）→100％酒精（2min）→100％酒精(2min)17、二甲苯透明：二甲苯Ⅰ（5min）→二甲苯Ⅱ（5min）18、中型树胶封片,镜检。

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