分子克隆实验标准步骤一、常规分子克隆实验流程：
二、分子克隆实验标准步骤（含实验编号）：
1.PCR扩增目的基因（编号Clone SOP-1）
以本实验室常用酶KOD-Plus-Neo（TOYOBO）为例
体系（50ul）：
10×KOD buf 5ul
dNTP(2mM) 5ul
Mg2+ 3ul
Primer1 1ul
Primer2 1ul
Template 50-200ng
KOD 0.5ul
ddH2O up to 50ul
程序：
95℃2min
98℃10s
58℃30s 35cycle
68℃2kb/min
68℃7min
12℃∞
2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2）
琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三角瓶中，按1%-1.5%的浓度加入相应体积的TBE或TAE缓液，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。
胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾干；②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。在距离底板上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。
③将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀
的胶层。④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用，没过胶面1mm以上。
3.试剂盒回收DNA片段（编号Clone SOP-3）
以本实验室常用DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例
使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，
12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）
②将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，
称取重量。
③向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlPN
溶液），60℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。
注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA 的能力较强。
④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，
12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
⑤向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），
12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
⑥重复操作步骤⑤。
⑦将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附
柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
⑧将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB或
ddH2O，室温放置2min。12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。
4.酶切反应（编号Clone SOP-4）
以本实验室常用酶FastDigest restriction enzymes（Thermo）为例
双酶切体系（若是单酶切则只用加一种酶）：
10×FastDigest® buffer or 10×FastDigest® Green buffer 5ul
FastDigest restriction enzyme 1 0.5-1ul
FastDigest restriction enzyme 2 0.5-1ul
DNA N
ddH2O up to 50ul 酶切体系混合均匀后置于37℃条件下反应，反应时间应大于30min，若是载体（2-3ug）至少酶切2小时。
5.酶切产物的回收（编号Clone SOP-5）
以本实验室常用Axygen® AxyPrep™ PCR Clean-Up Kit（Axygen）为例
①在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加入3个体积的Buffer PCR-A（若Buffer PCR-A
不足100ul，加至100ul），混匀后，转移到制备管中，将制备管置于2ml离心管中，12000g 离心1min，弃滤液。
②将制备管置回2ml离心管，加700ulBufferW2，12000g离心1min，弃滤液。
③将制备管置回2ml离心管，加400ulBufferW2，12000g离心1min，弃滤液。
④将制备管置回2ml离心管，12000g离心1min，将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，静置
2min。
⑤在制备管中央加25-30ulEluent或ddH2O，室温静置1min，12000g离心1min洗脱DNA。
6.重组反应（编号Clone SOP-6）
以本实验室常用NovoRec® PCR一步定向克隆试剂盒（Novoprotein）为例
体系：
10×重组缓冲液1ul
NovoRec®重组酶0.5ul
线性化载体N
插入片段N
ddH2O upto10ul
注：载体与目的片段的摩尔比在1:3-1:10之间
进行重组反应混匀后在37℃水浴锅中放置20至30分钟后取出置于冰上
立即进行转化
7.转化（编号Clone SOP-7）
①从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，迅速置于冰上缓慢解冻并分装。
②取出连接产物，加入到分装的感受态中，置于冰上孵育25min
③42℃热激90sec，置于冰上孵育2min，加入700ul，不含抗生素的LB培养基，180rpm37℃
培养45min。
④3000rpm离心1min，弃去大部分上清液体，留下约50-100ul，重悬沉淀，滴在已经加入玻
璃珠的LB平板（带有相应抗性）上，用玻璃珠涂抹均匀。
⑤倒出玻璃珠，LB平板置于37℃培养箱，过夜培养。
8.挑克隆摇菌与菌落PCR检测阳性克隆（编号Clone SOP-8）
①从37℃培养箱中取出过夜培养的平板，用镊子小心镊取高压灭菌后的枪头，以枪头的尖头
轻触单个克隆，然后将枪头尖分别在装有有150ulLB液体（带有相应抗性）的1.5mlEP管和菌落PCR反应体系中搅动几下。将装有培养基的EP管37℃220rpm培养3小时。
②菌落PCR：
20ul菌落PCR体系，以本实验室常用2×TSINGKE Master Mix为例：
2×MIX 10ul
Primer 1 0.5ul
Primer 2 0.5ul
菌
ddH2O 9ul
菌落PCR程序：
95℃3min
95℃30s
58℃30s 30cycle
72℃1-2kb/min
72℃5min
12℃∞
