多糖纯化层析填料精选

层析柱和填料使用规范原理凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，广泛用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离纯化、分子量的测定、脱盐、浓缩等。

本实验室主要有排阻层析和离子交换层析两种。

排阻层析利用生物大分子的相对分子质量差异进行层析分离。

层析介质内部具有立体网状结构，形成孔穴，较大的分子完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，流程短，首先流出；较小的分子则完全渗透进入凝胶颗粒内部，流程长，所以最后流出。

离子交换层析将具有交换能力的离子基团在固定相球形介质表面，这些离子基团可以与流动相中的离子发生可逆性离子交换反应而进行分离。

操作规程层析柱和凝胶填料是我们实验室的宝贵财富，为了方便大家使用和规范实验室操作，现将使用规范规定如下，请各位老师和同学务必严格按照操作规程。

1 使用前首先明确自己的分离目的，即要做哪一方面的分离，从而选择合适的凝胶填料，请大家务必查阅文献或者询问老师，同时根据自己的分离要求，选择合适长度和直径的层析柱；2 征得老师或者负责同学同意后方可进行操作（外室人员务必征求老师同意）；3 选择好层析柱和填料以后，严格按照填料的要求来操作，包括填料的溶胀、脱气、装柱，期间务必严格按照说明书操作；4 适当控制上样量,上样以前务必要过0.22µm滤膜；5 选择合适的流动相，根据胶的性质决定能否用泵加压；6 使用完毕后，请将层析柱做好处理（离子交换柱请用高浓度氯化钠溶液冲洗，最后用水冲洗），最后将层析柱堵好，以防干胶或者进气泡，同时请做好试验纪录，以便下一位同学用时方便查询使用情况；7 试验过程中所有用水或者溶液必须经过抽滤和脱气，严防气泡；8 若在使用过程中发生意外情况，请及时向负责同学反应，及时解决。

本规范解释权归本实验室，疑难问题请咨询老师或负责同学。

负责人：杨波刘斌2004-12-15。

植物多糖提取与纯化方法的步骤与技巧植物多糖是一类具有广泛生物活性的天然产物，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、免疫调节等多种药理作用。

因此，植物多糖的提取与纯化方法备受关注。

本文将介绍植物多糖提取与纯化的步骤与技巧，以帮助读者更好地了解和应用这些方法。

首先，植物多糖的提取需要选择适当的溶剂。

常用的提取溶剂包括水、醇类和酸碱溶液。

水是最常用的提取溶剂，因为植物多糖多为水溶性。

但有些植物多糖在水中溶解度较低，此时可以选择醇类溶剂如乙醇、丙醇等。

酸碱溶液的选择要根据不同的植物多糖来确定，一般来说，酸性条件有利于提取酸性多糖，碱性条件有利于提取碱性多糖。

其次，植物多糖的提取需要注意样品的准备。

样品的选择要根据植物多糖的来源来确定，可以是植物的根、茎、叶、果实等部位。

样品在提取前需要经过粉碎处理，以增加提取效果。

此外，样品的质量也会影响提取效果，因此要选择新鲜、干燥、无霉变的样品。

接下来是植物多糖的提取步骤。

一般而言，提取步骤包括浸提、过滤、浓缩和沉淀等。

浸提是将样品与提取溶剂接触一段时间，使植物多糖溶解到溶剂中。

过滤是将提取液中的固体颗粒去除，以获得澄清的提取液。

浓缩是将澄清的提取液进行浓缩，以减少体积。

沉淀是通过加入沉淀剂使植物多糖从溶液中沉淀出来，然后通过离心等方法将沉淀物收集。

在提取过程中，还需要注意一些技巧。

首先是浸提时间的控制，过短的浸提时间可能导致多糖未能充分溶解，过长的浸提时间可能导致多糖的降解。

因此，需要根据不同的植物多糖来确定合适的浸提时间。

其次是提取溶剂的选择和用量，溶剂的选择要根据植物多糖的特性来确定，用量要适量，既能保证提取效果又能节约溶剂。

此外，还可以采用超声波辅助提取、微波辅助提取等方法来提高提取效率。

提取完成后，还需要对提取液进行纯化。

纯化的目的是去除杂质，提高植物多糖的纯度。

常用的纯化方法包括醇沉、蛋白酶处理、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

醇沉是将提取液中的植物多糖用醇类溶剂沉淀出来，然后通过离心等方法将沉淀物收集。

一、实验目的1. 掌握多糖纯化的基本原理和方法。

2. 学习并运用DEAE-Sephadex A-50柱层析技术对多糖进行纯化。

3. 通过比色法测定纯化前后多糖的浓度，评价纯化效果。

二、实验原理多糖是一类重要的生物大分子，具有广泛的生物活性。

然而，天然多糖往往伴随着一些蛋白质、脂肪和色素等杂质，这些杂质会干扰多糖的结构鉴定和活性分析。

因此，对多糖进行纯化是研究多糖生物活性的关键步骤。

多糖的纯化主要包括以下步骤：1. 提取：采用热水浸提法或超声波辅助提取法等从植物、动物或微生物中提取多糖。

2. 净化：去除提取液中的蛋白质、脂肪和色素等杂质。

3. 纯化：利用DEAE-Sephadex A-50柱层析技术对多糖进行纯化。

4. 测定：通过比色法测定纯化前后多糖的浓度，评价纯化效果。

三、实验材料1. 实验药品：DEAE-Sephadex A-50柱层析材料、氨水、盐酸、无水乙醇、葡萄糖标准品等。

2. 实验仪器：层析柱、紫外可见分光光度计、离心机、移液器、容量瓶等。

四、实验方法1. 提取：称取一定量的多糖样品，加入适量蒸馏水，用超声波辅助提取法提取多糖。

提取液离心分离，取上清液作为待纯化样品。

2. 净化：将待纯化样品加入适量的氨水，调节pH值至7.0，静置一段时间。

离心分离，取上清液作为待纯化样品。

3. 纯化：将DEAE-Sephadex A-50柱层析材料预处理后，装入层析柱。

将待纯化样品上柱，用蒸馏水进行梯度洗脱。

收集洗脱液，利用紫外可见分光光度计检测洗脱液中的多糖含量。

4. 测定：配制葡萄糖标准溶液，绘制标准曲线。

将纯化后的多糖样品按照比色法进行测定，计算纯化前后多糖的浓度。

五、实验结果1. 提取：超声波辅助提取法提取多糖，提取率约为70%。

2. 净化：氨水处理去除蛋白质、脂肪和色素等杂质，纯化率约为90%。

3. 纯化：DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化，纯化率约为95%。

4. 测定：纯化前后多糖浓度分别为1.5 mg/mL和0.7 mg/mL，纯化效果良好。

多糖的纯化方法1、分部沉淀法常用的沉淀剂有甲醇、乙醇和丙酮2、季胺盐沉淀法常用的季胺盐是十六烷基三甲基铵溴化物（CTAB）及其碱（CTA--OH）和十六烷基吡啶（CPC），实验时必须控制多糖混合液的PH小于9及硼砂存在。

3、盐析法常用的盐析剂有硫酸铵、氯化钠、氯化钾、醋酸钾等。

4、金属络合法常用的络合剂有费琳溶液、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。

5、住层析（1)纤维素住层析：常用不同纯度乙醇水溶液由高而低进行洗脱，将各种多糖分离开来。

（2)纤维素阴离子交换柱层析此法适用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。

常用的交换剂为DEAE---纤维素和ECTEOLA--纤维素。

（3）凝胶住层析：常用的凝胶有葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）及DEAE---Sephadex。

此法不适宜粘多糖的分离。

展开剂为各种盐溶液及缓冲液，它们的离子强度最好不低于0.02.（4)亲和层析：用凝集素（一般是蛋白质和糖蛋白）做亲和色谱来分离多糖。

（5）高压液相层析6、其他柱层析用活性炭及硅胶作载体的柱层来分离多糖；或用硼砂型的离子交换树脂分离中性多糖。

7、超过滤法多糖溶液通过各种已知的超过滤膜就能达到分离。

8、制备性区域电泳载体通常是玻璃粉黑木耳粗多糖C A A P 的脱除蛋白质纯化实验采用单独使用Sevage 法和酶法与Sevage 法结合交替进行法。

单独S e v a g e 法：氯仿、正丁醇按4 : 1比例混合后，加入C A A P 溶液中，充分振荡混均，再离心，除去中间层的蛋白质凝胶。

酶法与S e v a g e 法交替法：称取0.25g CAAP 充分溶于40ml 蒸馏水中，用Na2CO3 稀溶液调pH 值为7.5，加入胰蛋白酶0.013g，甲苯0.50ml，37℃恒温水解一定时间，再分别用自来水和蒸馏水透析，溶液浓缩后，再用S e v a g e 法处理。

如此反复交替处理7 次，测定每次处理后各样品的蛋白质含量。

多糖分离纯化1. 概述多糖是由许多重复单元组成的生物大分子，具有广泛的生物功能和应用价值。

多糖的分离纯化是从混合物中分离出目标多糖并提高纯度的过程。

本文将介绍多糖分离纯化的常用方法和技术，以及其在食品、药品和生物工程等领域的应用。

2. 多糖的分离方法多糖的分离方法主要包括溶剂沉淀、离子交换、凝胶过滤、超滤、逆流层析、电泳和气相色谱等。

下面将分别介绍这些方法的原理和应用情况。

2.1 溶剂沉淀溶剂沉淀是利用溶剂的物理性质，如极性和温度等，使多糖在溶液中发生相分离的方法。

通常采用醇类溶剂，如乙醇或异丙醇。

溶剂沉淀适用于多糖与其他溶质的溶解度差异较大的情况，但纯度较低。

2.2 离子交换离子交换是利用离子交换树脂上的功能基团与多糖分子间发生离子交换反应的方法。

树脂的功能基团可以选择性吸附或释放多糖分子。

离子交换适用于多糖的分子量差异较大的情况，例如海藻酸和壳聚糖的分离。

2.3 凝胶过滤凝胶过滤是利用凝胶的孔隙结构将分子按大小分离的方法。

多糖分子较大，可以被凝胶孔隙排除，而小分子可以通过凝胶透过。

凝胶过滤常用于多糖与其他小分子的分离，如蛋白质和核酸。

2.4 超滤超滤是利用超滤膜的孔隙结构将溶液分离的方法。

超滤膜的孔径可以根据需要选择，通常是分子量截留范围在1 kDa至100 kDa之间。

超滤适用于多糖与其他大分子的分离，如蛋白质和核酸。

2.5 逆流层析逆流层析是利用多糖与填料间的亲和作用进行分离的方法。

填料可以是具有特定亲和性的配体，如亲和树脂。

逆流层析适用于分子间相互作用较强的多糖分离。

2.6 电泳电泳是利用电场作用将分子按电荷和大小进行分离的方法。

多糖可根据电荷差异选择合适的电泳方法，如聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳。

电泳在多糖的分子量分析和负载量测定中广泛应用。

2.7 气相色谱气相色谱是利用样品在气相载体中的分配和迁移以实现分离的方法。

多糖需要经过甲硅烷衍生化处理后才可以进行气相色谱分析。

气相色谱适用于多糖的含量测定和结构分析。

火龙果多糖提取纯化及单糖组成检测作者：秦复霞来源：《南方农业·下旬》2016年第05期摘要目的：使用HPLC方法分析火龙果多糖的单糖组成。

方法：采用水提、Sevag脱蛋白及柱色谱层析等方法提取、纯化火龙果多糖，之后优化多糖TFA酸水解条件。

使用高效液相色谱PMP衍生化法测定火龙果多糖单糖组成。

结果：提取到火龙果多糖具有多糖类物质紫外-可见光特征吸收。

火龙果多糖最佳TFA酸水解条件为TFA浓度2 mol/L、水解温度120 ℃、水解时间6 h。

火龙果多糖主要由葡萄糖、果糖和阿拉伯糖组成。

关键词火龙果；PMP衍生化；单糖组成；液相色谱中图分类号：S668.9 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2016）15--03火龙果是仙人掌科（Cactaceae）三角柱属（Hylocereusundatus Britton et Rose）和蛇鞭柱属（SeleniereusMeja-lantous Britton et Rose）的果用栽培品种，其外观犹如鳞片状因而得名火龙果，又称青龙果、红龙果、仙人掌果等，是一种具有很高观赏性和营养价值的品种[1-2]。

火龙果原产于中美洲热带地区，后经移植至东南亚等国后传入我国广东、广西、台湾等地区。

因其富含植物性多糖、矿物元素、甾醇及维生素等营养物质[3]，具有增强人体机能、提高免疫力及美容养颜等功效，因此具有广阔的开发前景和利用价值，近年来得到国内外学者的广泛关注[4，5]。

本文对火龙果中富含的活性物质植物多糖进行提取、纯化，并采用高效液相色谱法鉴定了其单糖组成，为进一步加工利用火龙果资源提供了理论基础。

1 材料与方法1.1 仪器与试剂火龙果：购于农贸市场，产地海南。

纤维素酶、Sephadex LH-20、单糖对照品（葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖）：上海源叶生物科技有限公司。

三氟乙酸、重蒸酚、PMP：北京索莱宝科技有限公司。

乙腈为色谱纯。

薄层层析法分析多糖的成分薄层层析是一种微量而快速的层析方法。

最早是Izmailov和Schraiber在1938年采用氧化铝薄层分离了植物提取液。

层析是在吸附剂或支持剂均匀涂布的薄层上进行的，故称薄层层析。

为了使所要分析的样品各组分得到分离，必须选择合适的吸附剂。

硅胶、氧化铝和聚酰胺是广泛采用的吸附剂，硅藻土和纤维素是分配层析中最常用的支持剂，在吸附刘或支持剂中添加了适合的粘合剂再涂布，可使薄层粘牢在玻璃板（或涤纶片基）这类基底上。

硅胶G是一种添加了粘合剂的硅胶粉，约含12%-13%的石膏（CaSO4）,它可以把一些物质从溶液中吸附于自身的表面上，利用它对各种物质的吸附能力不同，再用适当的溶剂系统展层使不同的物质得以分离。

例如糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的分子量和羟基数有关，经过适当的溶剂展开后，糖在薄板上的移动速度是戊糖>己糖>双糖>三糖。

若用硼酸溶液市制硅胶G可改进分离效果。

对己分开的斑点显色，而将与它位置相当的另一个未显色的斑点从薄层上与硅胶G一起刮下，以适当的溶剂将糖从硅胶G上洗脱下来，就可用糖的定量测定方法各组分的含糖量。

薄层层析一般采用上行法，在具有密闭盖子的玻璃缸中进行，溶剂倒于缸底，简单地将薄板放入即可。

保证层析缸内有饱和的蒸气是实验成功的关键。

保证措施是在层析缸内壁衬一层浸湿溶剂的滤纸或缩小层析缸的容积。

因为层析时，溶剂会从薄层上蒸发，样品移动到一定距离的时间就会处长。

若所用溶剂系统由几个成分组成，挥发性较大的成分首先蒸发，就会使混合溶剂的组分改变，而溶剂的蒸发从薄板的中央向两边递减，致使溶剂前沿呈弯曲状，结果往往是使两边的Rf值大于中央位置的Rf值。

薄层层析与其它方法比有明显的优点：层析时间短，可以分离多种化合物，用样品量少（微克级），与纸层析相比要灵敏10-100倍，观察结果方便，显色方法甚至可以用腐蚀性显色剂。

操作方法1．制备硅胶G薄层板取硅胶G粉30g加75毫升0.1mol/L硼酸溶液，调匀后铺于洁净平整的玻板上，铺层后的薄板于100℃烘箱中烘干。

Heparin Sepharose 6 Fast Flow原理肝素是一种含硫酸酯的酸性多糖，将它偶联到交联及活化的琼脂糖凝胶上，该填料具有很高的物理化学稳定性。

肝素能和抗凝血因子Ⅲ、凝血因子、蛋白合成因子、脂蛋白、干扰素、核酸结合蛋白、限制内切酶、凝血酶及类凝血酶等生物大分子结合，所以肝素琼脂糖凝胶可以用于这类物质的纯化。

*图为含有交互转换的抗坏血酸的肝磷脂多糖的结构（A）和D-葡萄糖残基（B）分离操作结合缓冲液：20mM Tris-HCl, pH 8.0或者10mM 磷酸钠, pH7.0洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl, 1~2M NaCl, pH 8.0或者10mM 磷酸钠,1~2M NaCl, pH7.01，用10倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。

2，上样。

3，用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合物质都被冲洗出柱子。

紫外吸光A280nm处监测。

4，用5-10倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。

使用连续的或者阶梯式的梯度洗脱，洗脱缓冲液的浓度从0%-100%。

使用注意1，通过改变缓冲液的pH值或者离子强度来修饰肝磷脂的选择性。

洗脱时使用连续的或者阶梯式的洗脱方式，用NaCl,KCl或者硫酸铵溶液，浓度可以高达1.5~2M。

2，对于凝血因子而言，肝磷脂作为亲和配基，在结合缓冲液中含有一个低浓度的0.1M的NaCl是合适的。

3，如果增加盐离子浓度的梯度产生一个令人不满意的结果，使用肝磷脂（1~5mg/ml）在洗脱缓冲液中作为一个竞争性试剂。

净化1，用0.5个柱体积的2M的NaCl冲洗10分钟去除离子键结合蛋白。

2，通过用4倍柱体积的0.1M NaOH溶液冲洗柱子1~2小时去除沉淀物或变性蛋白或用2倍的柱体积的6M的盐酸胍冲洗柱子30~60分钟，或者用2倍柱体积的6M的尿素冲洗30~60分钟。

3，用4倍柱体积的0.1%~0.5%的TritonX-100冲洗1~2小时，去除疏水键结合的蛋白质。

多糖提取纯化化学修饰和抗氧化性研究进展【摘要】本文综述了多糖提取、纯化、化学修饰和抗氧化性研究的最新进展。

首先介绍了多糖的提取方法和纯化技术，包括传统和现代技术。

接着总结了多糖的化学修饰方法，探讨了不同修饰对多糖性质的影响。

然后重点分析了多糖的抗氧化性能研究，揭示了多糖作为天然抗氧化剂的潜力。

最后探究了多糖的抗氧化机制，为进一步研究奠定了基础。

结论部分强调了多糖提取纯化化学修饰和抗氧化性研究在保健品、药物和食品工业中的重要性，并指出未来研究方向。

本文总结了目前的研究进展，为多糖的应用和开发提供了理论支持和实验依据。

【关键词】多糖、提取、纯化、化学修饰、抗氧化性、研究进展、重要性、未来研究方向、总结1. 引言1.1 研究背景多糖是一种具有广泛应用前景的生物高分子化合物，它具有多种生物活性和功能特性。

多糖来源广泛，包括植物、动物和微生物等，其中以植物多糖应用最为广泛。

多糖提取纯化、化学修饰和抗氧化性研究已经成为当前研究领域的热点之一。

1.2 研究目的多糖是一类重要的生物大分子，具有多种生物活性和应用潜力。

多糖的提取、纯化、化学修饰和抗氧化性能研究是当前研究领域中备受关注的热点问题。

本文旨在系统总结多糖提取纯化化学修饰和抗氧化性研究的最新进展，探讨多糖在抗氧化领域中的应用潜力和机制，为深入理解多糖的生物活性和开发多糖的抗氧化功能食品提供科学依据。

通过研究多糖的提取方法、纯化技术、化学修饰方法以及抗氧化性能，可以为多糖在医药、食品、化妆品等领域的进一步应用奠定基础。

通过研究多糖的抗氧化机制，可以揭示多糖在抗氧化过程中的作用机制，为优化多糖的抗氧化性能提供理论依据。

通过本文的研究，旨在推动多糖提取纯化化学修饰和抗氧化性研究的发展，促进多糖在抗氧化领域的应用与推广。

1.3 研究意义多糖的提取纯化和化学修饰可以提高多糖的纯度和活性，从而更好地发挥其生物功能。

通过优化提取和纯化技术，可以降低多糖样品中的杂质和有害物质含量，保证多糖的质量和稳定性，为后续的研究和应用打下基础。