rProtein A层析填料说明书

国家生化工程技术研究中心（北京）地址：北京市海淀区中关村北二条1号中国科学院过程工程研究所西区 电话/传真：010- 82544957 邮编：100190Protein A 亲和介质（Protein A QZT 4FF ）产品说明书1. 产品简介Protein A 能特异性地与抗体的Fc 区结合，所以Protein A 亲和介质可用于抗体（单抗和多抗）的分离纯化，经过一步亲和层析，即可从腹水、血清和培养液等样品中得到高纯度的抗体。

Protein A QZT 4FF 亲和介质以自制的琼脂糖凝胶为基质，以重组Protein A 为配基，具有很高的物理化学稳定性，配基不易脱落，寿命长，使用方便，应用广泛。

2. 产品特性3. 使用方法Protein A QZT 4FF 广泛用于各种抗体的分离纯化。

层析操作通常包括装柱、平衡、进料、淋洗、洗脱、再生等步骤。

平衡：用5~10CV 的平衡缓冲液（20 mM PB+0.15M NaCl ，pH 7.0，添加适当浓度的NaCl 抑制非特异性吸附）平衡层析柱，至流出液电导和pH 不变（与平衡液一致）。

进料：样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。

固体样品可用平衡液溶解配制；低浓National Engineering Research Center forBiotechnology (Beijing)Add ：No.1 Bei er tiao, Zhongguancun, Haidian District, Beijing, ChinaTel/Fax ： 010- 82544957 Post code ：100190度样品溶液可用平衡液透析；高浓度样品溶液可用平衡液稀释。

为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或微滤（0.45μm ）处理。

进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。

淋洗：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。

洗脱：用洗脱缓冲液（20 mM 柠檬酸，pH 3.0-4.0；或0.1M 甘氨酸，pH 3.0；或20 mM 乙酸钠，pH 3.0-4.0；具体洗脱条件与抗体的结合强度和稳定性密切相关，效果不好时应进行洗脱缓冲液（种类和pH 或添加剂）的优化）洗脱，收集流出液。

编号：FC-MR1002 Protein A/G-Plus Beads 抗体纯化柱 使用（预装柱）1、 说明： protein A 与Protein G 的抗体结合结构域融合后的重组蛋白和4％浓度的琼脂糖树脂偶联制成。

由于采用了重组表达的Protein A/G ，并去除了其白蛋白结合区，基质能够特异性地结合多种免疫球蛋白的Fc 区段，作为亲和树脂，可用来纯化不同来源的抗体和抗体亚型，以及在免疫共沉实验中捕获免疫复合物。

本产品使用了多位点交联技术，稳定性好、特异性高并具有广谱结合力，每ml 基质可特异性结合6-10 毫克抗体。

2、 组分：50％ Protein A/G Agarose 悬液，PBS ，20％乙醇。

3、 储存条件：4℃保存，有效期一年；常温（15-25℃）运输；切勿冻结！4、 纯化步骤：4.1 取适量Protein A/G Agarose 悬液，装入层析柱，用10倍柱体积的PBS （或者TBS ，下同）洗涤平衡层析柱。

4.2含抗体的血清或其它体液高速离心后，将上清与等体积2×PBS 缓冲液混合，调整pH 以及离子浓度后，缓慢加入层析柱。

4.3 用10倍柱体积以上的PBS 洗涤，至流出液无蛋白检出。

4.4加入2倍柱体积0.1 M 柠檬酸（Citrate Acid, pH 2.7），夹住流出管，静置5分钟后收集穿出液，重复三次。

测定OD 280估算抗体浓度，如果所得抗体较多可以使用SDS-PAGE 检测纯度。

也可以选择0.1 M 甘氨酸（Glycine, pH 3.0）洗脱。

4.5 洗脱后的抗体加入2/5体积的1 M Tris ，pH 8.0中和，使用Millipore 蛋白浓缩管切换到所需缓冲液，通常为2×PBS 含有0.02% NaN 3以及1 mM EDTA 。

4.6浓缩到所需体积，加入50%甘油；测定效价后，分装并保存在-20℃，避免冻结。

5、树脂处理：5.1 层析柱中Protein A/G Plus Bead 使用后需要及时处理，酸洗脱抗体以后，使用10倍柱体积P BS 洗柱平衡到中性，20%乙醇溶液充分洗涤后，封闭上下两端，保存在4℃。

蛋白A(Protein A)酶联检测试剂盒(可拆卸)说明书产品目录编号# AB000109C此试剂盒包含检测生物药物内蛋白A (Protein A) 杂质所需要的全部组分。

请在操作之前仔细阅读此说明书。

本试剂盒只能用于科学研究，不能用于医学诊断。

背景资料在单克隆抗体药物的纯化过程中，以蛋白A（Protein A）为基础的亲合层析是广泛应用的纯化方法之一，单克隆抗体可以有效的在此步骤中得到纯化。

蛋白A 的最初来源是细菌（Staphylococcus aureus）细胞壁中的一个蛋白质，研究表明蛋白A 可能对人体有潜在的危害，它的生物学作用包括刺激人体多种细胞素（IFNγ, TNFα, IL-1α,IL-1β, IL-2, IL-4）的释放。

由于在蛋白A 亲合层析柱使用过程中会有微量的蛋白A 从层析柱上脱落下来，因此用精确灵敏的方法来确证单克隆抗体药物中蛋白A 的残留处于一个较低的和稳定的水平是单克隆抗体药物的质量标准之一。

蛋白A (Protein A) 酶联检测试剂盒是用来定量分析生物药物中蛋白A杂质的试剂盒。

首先，用不同浓度的蛋白A标准蛋白制作一条标准曲线，然后再根据标准曲线来分析生物药物中残留蛋白A的含量。

具体方法为：先将蛋白A标准蛋白或者待测样品适当稀释后加入已包被好抗蛋白A抗体的96孔平板中。

经过1.5小时的保温，蛋白A与已经固定在平板上的抗体结合形成抗原－抗体复合物。

此复合物被随后加入的生物素标记的抗蛋白A的抗体结合并进一步形成更高级的复合物，反应45分钟后洗去未结合的物质。

再加入链霉亲合素-辣根过氧化物酶复合物（Streptavidin-HRP Conjugate），静置30分钟。

因链霉亲合素可以与任何带生物素标记的抗体相结合，从而使链霉亲合素-辣根过氧化物酶复合物连接到平板上。

接下来冲洗掉未结合的物质，加入TMB底物。

固相上的酶催化底物产生颜色反应，待颜色反应一段时间后，终止反应。

用酶标仪在450 nm波长下测定其结果，此结果能间接地反应结合到平板上的蛋白A数量的多少。

蛋白a柱使用手册
蛋白A柱是一种亲和层析柱，常用于纯化含有Fc区域（浅链）
的抗体。

在使用蛋白A柱之前，需要将其活化。

活化方法：
1. 用20mM乙酰胺（pH5.0）或1M的乙酸钠（pH4.0）洗脱缓冲
液进行洗脱。

注意：洗脱缓冲液需要在使用前pH值平衡至目标 pH 值。

2. 在规定压力和流速下，将洗脱缓冲液穿过蛋白A柱。

3. 在一定的时间内保持连续流动，以确保蛋白A柱得到充分的
活化。

使用方法：
1. 使用浓盐缓冲液如2M NaCl或者制备完整抗体来预洗蛋白A 柱，以去除不特异性结合物。

2. 将条件适当的待纯化样品施加在蛋白A柱上，并以规定的压
力和流速连续流加至柱子中。

3. 使用洗脱缓冲液（例如50mM甲基胆碱（pH5.0）或50mM乙醯
丙酮（pH4.0）去除不特异性结合物，如有必要，可以多次洗脱。

4. 使用醋酸钠或氯化钠等适宜的缓冲液或乙酰胺调节pH，并用
其他相关方法如聚焦脱盐或超滤等方法对目标蛋白进行进一步的纯化
和浓缩。

注意事项：
1. 蛋白A柱床高度和采用的缓冲液类型都可能对柱子的效果有
所影响，因此，建议在第一次使用时检查各个实验条件的最佳化。

2. 在样品很少且需要高效纯化的情况下，可以使用前列腺素A2
或乳糖脱盐来洗脱蛋白A柱。

3. 需要牢记的是，使用蛋白A柱时必须要注意操作稳定，避免
各种缓冲液和样品的混合，避免浓度冲击和质量不稳定的问题，以确
保高产和高纯度的结果。

博格隆（上海）生物技术有限公司021-********耐碱Protein A Diamond耐碱Protein A Diamond是一种新型的由耐碱Protein A蛋白同高流速的琼脂糖基质通过环氧化学方式合成的亲和介质，填装后的层析柱可一次性纯化大量单克隆抗体。

1产品简述耐碱Protein A Diamond的配基通过大肠杆菌发酵获得，配基发酵及后续的纯化过程均无动物源产品，该配基专门用于生产具有耐碱性和高IgG载量的亲和介质。

其与传统的Protein A作用相同，都是与IgG的Fc区结合，一步纯化即可达到很好的效果。

新的耐碱Protein A配基，可用0.1-0.5M NaOH进行原位清洗，避免使用昂贵且具有腐蚀性的原位清洗试剂，可帮助企业节省成本，同时易于线性放大，这些优势使耐碱Protein A Diamond成为单克隆抗体纯化（临床应用）的理想选择。

耐碱Protein A Diamond的性质●基质高度交联琼脂糖●平均粒径75μm●配基重组耐碱Protein A（E.coli）●耦联方式环氧化学●化学稳定性Protein A介质常用的缓冲液中稳定●pH稳定性3-12●CIP稳定性0.1-0.5M NaOH●建议流速500cm/h●保存条件PBS，20％乙醇，4-8℃2推荐实验条件2.1缓冲液：结合缓冲液A:PBS洗脱缓冲液B:0.1M柠檬酸，PH2.7-3.62.2实验过程：2.2.15倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子2.2.2上少量抗体样品2.2.33-5倍柱体积的缓冲液A清洗柱子2.2.4线性洗脱，0-100%B洗脱10倍柱体积2.2.5收集洗脱产物，用1.0M Tris-HCl（pH9.0）进行中和（Tris-HCl体积约为洗脱产物的5-10%体积）2.2.63-5倍柱体积缓冲液B再生柱子2.2.73-5倍柱体积缓冲液A清洗柱子2.2.83-5倍柱体积0.1-0.5M NaOH原位清洗2.2.9用缓冲液A再次平衡柱子，以备下次使用为防止敏感抗体在低pH条件下发生变性，需通过预实验，优化洗脱的最佳pH，达到最好的洗脱效果，生产条件下选择逐步洗脱，可得到更高浓度的目标单克隆抗体，降低缓冲液的使用量，减少循环次数。

rProtein A/G Beads货号：R8281规格：2ml/5ml 保存：2-8℃指标性能基质4%琼脂糖微球配体重组蛋白A/G载量>30mg 人lgG/ml 介质粒径(µm)45-165最大流速0.1MPa,1bar pH 稳定范围3-10储存缓冲液20%乙醇储存温度2°C-8°C纯化流程：本产品分为两种应用：抗体纯化流程和免疫沉淀流程，免疫沉淀流程还分为直接法和间接法。

下面操作就从这三个方面详细介绍。

1、Buffer 的准备所用水和Buffer 在使用之前建议用0.22µm 或0.45µm 滤膜过滤。

结合/洗杂Buffer：0.15MNaCl，20mMNa 2HPO 4，pH7.0洗脱Buffer：0.1M 甘氨酸，pH3.0中和液：1MTris-HCl pH8.5交联Buffer：0.2M 三乙醇胺，pH8.2终止液：50mMTris，pH7.52、样品准备上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH 值，可以用结合/洗杂缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗杂缓冲液透析。

样品在上样前建议离心或用0.22µm或0.45µm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

3、抗体纯化流程操作方法1)将rProtein A/G Beads装入合适的层析柱，层析用5倍柱体积的结合Buffer进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。

2)将样品加到平衡好的rProtein A/G Beads中（保证目的蛋白与rProtein A Beads充分接触，提高目，收集流出液。

的蛋白的回收率）3)用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4)使用5-10倍柱体积的洗脱Buffer，收集洗脱液，即目的蛋白组分。

5)依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4度保存，防止填料被细菌污染。

rProtein A/G Beads使用说明货号：R8250规格：5ml保存：2-8℃产品介绍：rProtein A/G Beads是将rProtein A/G高密度定向偶联到琼脂糖凝胶微球表面，该产品具有更高的抗体结合能力和较低的蛋白非特异吸附率，洗脱条件更均一，一步纯化即可从血清样品中分离出纯度大于90%的抗体。

rProtein A/G Beads产品性能：指标性能基质4%琼脂糖微球配体重组蛋白A/G载量>30mg人lgG/ml介质粒径(µm)45-165最大流速0.1MPa,1barpH稳定范围3-10储存缓冲液20%乙醇储存温度2℃-8℃Protein A和Protein G对不同抗体的结合能力：种属亚型Protein A Protein G Protein A/GHuman IgA varible—++IgD———IgE———IgG1++++++++++++IgG2++++++++++++IgG3—++++++++IgG4++++++++++++IgM varible—++ Avian egg yolk IgY———Cow++++++++++ Dog++++++++++ Goat—++++++++ Guinea pigIgG1++++++++++IgG2++++++++++ Hamster+++Horse Total IgG++++++++++ Koala—+Liama—+Monkey(rhesus)++++++++++++Mouse IgG1+++++++ IgG2a++++++++++++ IgG2b+++++++++IgG3++++++++IgM variable——Pig++++++++++ Rabbit Total IgG+++++++++++Rat IgG1—+++ IgG2a—++++++++ IgG2b—++++ IgG3+++++Sheep Total IgG+/-++++ ++++=结合能力强； ++=结合能力中等； —=结合能力弱或没有结合纯化流程：本产品分为两种应用：抗体纯化流程和免疫沉淀流程，免疫沉淀流程还分为直接法和间接法。

Protein A亲和介质（Protein A QZT 4FF）产品说明书1. 产品简介Protein A能特异性地与抗体的Fc区结合，所以Protein A亲和介质可用于抗体（单抗和多抗）的分离纯化，经过一步亲和层析，即可从腹水、血清和培养液等样品中得到高纯度的抗体。

Protein A QZT 4FF亲和介质以自制的琼脂糖凝胶为基质，以重组Protein A为配基，具有很高的物理化学稳定性，配基不易脱落，寿命长，使用方便，应用广泛。

2. 产品特性3. 使用方法Protein A QZT 4FF广泛用于各种抗体的分离纯化。

层析操作通常包括装柱、平衡、进料、淋洗、洗脱、再生等步骤。

平衡：用5~10CV的平衡缓冲液（20 mM PB+0.15M NaCl，pH 7.0，添加适当浓度的NaCl抑制非特异性吸附）平衡层析柱，至流出液电导和pH不变（与平衡液一致）。

进料：样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。

固体样品可用平衡液溶解配制；低浓度样品溶液可用平衡液透析；高浓度样品溶液可用平衡液稀释。

为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或微滤（0.45μm）处理。

进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。

淋洗：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。

洗脱：用洗脱缓冲液（20 mM 柠檬酸，pH 3.0-4.0；或0.1M 甘氨酸，pH 3.0；或20 mM 乙酸钠，pH 3.0-4.0；具体洗脱条件与抗体的结合强度和稳定性密切相关，效果不好时应进行洗脱缓冲液（种类和pH 或添加剂）的优化）洗脱，收集流出液。

洗脱后，应立刻用碱性缓冲液（如1M Tris/HCl, pH 9.0）将收集到的抗体溶液中和到抗体稳定的pH ，避免抗体失活，维持抗体的生物活性。

再生、原位清洗：介质使用数次（5-10次，具体次数与原料的种类和来源及实验要求有关）后，需要对介质进行再生、在位清洗。

（1）用0.1M 的乙酸或0.1M 的乙酸/20%乙醇淋洗柱子3-5CV ，然后用缓冲液洗到中性即可重复使用；（2）也可用0.05M NaOH+1M NaCl 或6M 盐酸胍淋洗柱子3-5CV ，并用3~10 CV 的纯水冲洗，然后用缓冲液洗到中性即可重复使用。

使用说明书产品编号：rPA-C-01产品规格：1 mL稳定性：层析填料于20 %乙醇中保存：4~8℃◆产品简介本制品可直接用于从血清、腹水中纯化IgG 抗体，或是用于纯化含Fc片段的重组蛋白。

1 mL 填料从人血清中单次纯化可获得大于55 mg的IgG抗体，纯度达95 %以上，且操作简便、稳定、重复性好。

本制品使用的rProtein A是通过基因工程重组蛋白的方法表达获得，由于重组表达的rProtein A极大程度上地去除了除Fc端以外的其他非特异性结合位点，因而特异性更好，亲和性更强。

◆rProtein A预装柱纯化IgG抗体步骤以下实验方法适用于从兔血清或鼠腹水中纯化IgG抗体，不同来源的IgG与Protein A的结合能力不同，具体情况请参考表1。

1. 将兔血清或鼠腹水样品（推荐上样量2 mL样品/mL柱，具体上样量根据样品不同估算）装入截留分子量3.5 KDa透析带中，于4 ℃冰箱中对1× PBS（pH 7.4）透析过夜；2. 将rProtein A预装柱固定好，用10倍柱体积1×PBS（pH 7.4）平衡层析柱，建议流速为 1 mL/min；3. 将透析好的样品从层析柱上端加入，建议流速为1 mL/min，为了获得更好的抗体结合效果可将流穿液再上样，重复2遍（或者是将样品1次性加入层析柱后置于摇床上，轻轻摇动，结合30 min）；4. 样品结合后，用20倍柱体积1×PBS(pH 7.4)洗涤层析柱，建议流速为1 mL/min，切勿让层析柱滴干；5. 洗脱IgG，向层析柱上端加入洗脱液（100 mM甘氨酸，pH 2.7），用预先加有100 μL中和缓冲液（1M Tris，pH 9.0）的4 mL Ep接收，2 mL /管，共收集10倍柱体积，进行10 % SDS-PAGE 电泳，确定IgG样品所在管，回收样品（图1）。

6. 向层析柱加入5倍柱体积再生缓冲液（100 mM甘氨酸，pH 2.0），再加入10倍柱体积ddH2O清洗层析柱。

NMab TM Pro Protein A亲和层析介质产品使用说明书文件编号：NM-W-DF-0603版本号：A2NMab TMPro 层析介质使用说明产品简介Protein A 亲和层析是利用Protein A 配基与目标抗体具有专一结合力作用从而达到分离纯化抗体的目的。

Protein A 亲和层析大大简化抗体下游分离纯化工艺，成为抗体分离纯化的标准。

目前市场上的Protein A 亲和层析介质主要分为以多糖（琼脂糖、葡聚糖、纤维素）为基质和以合成高分子（聚丙烯酸酯，丙烯酰胺）为基质两大类。

琼脂糖基质在溶胀状态下具有网状结构，比表面积大，因而亲和载量比较高，但机械强度不高、耐压低。

随着上游发酵技术的进步，抗体表达量越来越高，下游亲和捕获成为抗体生产瓶颈，因此对下游Protein A 亲和层析介质的载量要求越来越高。

为了因应这一需求，纳微科技以琼脂糖为基球，利用特有的微球改性技术以增强其机械强度，并结合自主产权的Protein A图1. NMab TM Pro Protein A 亲和层析介质电镜图配基技术，在NMab TM Protein A 的基础上成功开发出比其具有更高载量的NMab TM Pro Protein A 亲和层析介质。

除了高载量外，NMab TM Pro 延续了其优良的结合特异性、耐碱性以及压力-流速特性，是抗体客户降低单抗纯化成本的最佳选择。

下表1是NMab TM Pro Protein A 层析介质的基本性质参数。

相较市场同类产品有如下独特优势：(a) 载量高：一般单抗项目平均动态载量约60-80 mg/mL ；(b) 耐碱性强：0.5 M NaOH 浸泡下24小时载量只下降20%；(c) 配基脱落低：小于20 ppm ；(d) 宿主蛋白（HCP ）残留低：一般在1000 ppm 以内，表现不亚于Prism A ； (e) 回收率高：大于90%；(f) 纯度高：亲和洗脱液纯度99 %以上；(g) 压力流速好：明显强于传统4FF/6FF 系列介质；表1. 纳微科技NMab TM Pro Protein A 亲和层析介质技术参数压力流速曲线测试不同流速下压力变化如下，此压力-流速特性可满足工业生产上对填料流速要求，优于传统4FF/6FF 软胶系列填料。