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标准操作规程目的：为了使Chromaflow层析柱装柱过程可重复，并能够得到较好的柱效，故建立此操作规范。
范围：配合ÄKTA process或Uvis-920手动系统进行有效的蛋白质纯化操作。
责任人：层析工序操作人员标准操作程序：1、方法描述1.1在位装填技术（packing-in-place）是专门针对Chromaflow层析柱的新型装柱方法，它利用特殊的喷嘴（nozzle）将填料装进柱体，因此在每次装柱和拆柱的过程中就不需要移动柱体和柱头。
本标准的操作流程可以适用于不同填料装于不同规格的Chromaflow层析柱中。
1.2本操作流程以填料Q-Sepharose BB为例，将其快速有效地装入Chromaflow 400层析中，柱高为30cm。
2、材料和设备Chromaflow 400层析柱（内径40cm，带有50µm不锈钢筛网）；装柱站（packing station）；不锈钢储罐2个（分别装纯水和胶悬液slurry）；10mm ÄKTAprocess系统或手动系统（Skid）；4路2通阀（10mm）；压力表（0-60psi）；TC接头卡箍和垫片若干；连接管道若干；压缩空气；50-70%浓度的Q-Sepharose Big Beads slurry（纯水中）；纯水和20%乙醇；1%丙酮水溶液（V/V），0.4 M NaOH和2 M NaOH水溶液.3、准备工作3.1 柱体调水平3.1.1配件连接将三通连接到MPT上，并在其他2个出口依次连接压力表和4路2通阀，在底部MPB上连接4路2通阀，将阀门的其他出口依次连接管道备用。
利用合适的管道和配件将柱子的nozzles和packing station（图2）以及水、slurry的储藏罐相连。
将packing station和压缩空气相连。
用20%乙醇侵润柱头和密封圈，以便调节柱头高度。
3.1.2 柱头高度调节关闭MPT和MPB，并将顶部和底部nozzle分别调至UNPACK和PACK位置（图1）。
Capto MMC
皇家药院
Captor MMC是一种耐盐的多模式的生物处理媒介，在使用填充床色谱法从大量的培养液中纯化蛋白质时可以作为捕获介质和中间纯化介质。
Capto MMC 在提高生产力的同时降低了生产成本：在高电导率下具有很高的动态载量；高容量的吞吐量；新的选择性；更小的操作单元。
1 生物处理媒介
生物处理媒介因为生产规模的色谱层析而得到发展。
所有的生物处理媒介均经验证方法进行生产，并且经过测试以满足生产的需求。
安全的订购和交付模式能够为规模生产需要的媒介提供可靠的供应。
法规支持文件(RSF)可用来协助工艺验证和提交给监管机构。
生物处理媒介可以覆盖从捕获到精纯的所有纯化步骤。
2 Capto MMC的特性
Capto MMC 具有多种官能团的配体，多种作用方式的官能团使配体具有不同于传统离子交换剂的选择性，且在高盐条件下仍具有结合蛋白质的活性。
Capto MMC与大分子间存在多种作用方式，其中最显著就是离子作用，氢键和疏水作用。
Capto MMC是为了提高介质在捕获和中间纯化步骤中的速度和通量而设计的。
通过提高高盐浓度下的容量和低反压条件下的流速，而减短生产周期和提供生产力。
该媒介以高流速的琼脂糖为基质，典型的大规模柱子(直径为1m，柱床高度为20cm)在顶板压力低于3bar时流速为600cm/h或者更高。
高交联度的琼脂糖
基质提供了很高的物理和化学稳定性。
容量、洗脱行为和压力/流速等特性不受层析过程常用溶液的影响。
Capto MMC和琼脂糖6快速的压力-流速特性比较，工作条件
3 方法设计和优化
设计和优化生物大分子分离方法的目的是确定实验条件，在尽可能短的时间和尽可能高的产品回收率的条件下提高目的分子的最大吸附量。
在结合蛋白时，Capto MMC的作用类似于弱阳离子交换剂。
因为允许在高
电导率条件下吸附蛋白，所以可能不需要为了提高填料的结合能力而去筛选最优化的加载电导率。
然而加载电导率可能会影响吸附选择性。
Capto MMC在高电导率条件下对蛋白的有效捕获的特性在许多情况下会限制提高盐浓度以洗脱蛋白质的方法的使用。
通常可以通过联合改变pH、缓冲液浓度和洗脱盐而摸索到最优的洗脱条件。
为了建立最优的洗脱方案，实验设计是一种研究多种参数对蛋白回收率的影响的有效方法，实验设计方法的例子如应用说明11-0035-48所述，或者可以应用最优化的梯度洗脱方法。
4 建议的纯化方案
使培养液的pH比目标蛋白的等电点低0.5~2.0个pH。
需要根据具体的目标分子确定精确的pH。
使用与培养液相同pH的起始缓冲液平衡柱子；上样；用起始缓冲液洗去未结合的样品；按照以下方式洗脱目标蛋白：
4.1 通过使用低于目标蛋白等电点0.5、1.5、2.5个pH的缓冲液或者使用pH梯度缓冲液筛选最优洗脱pH。
如果需要可以将目标蛋白开始洗脱的pH作为基础进行优化。
4.2 在步骤1确定的pH条件下，使用0.5、1.0、1.5M的盐溶液筛选洗脱的盐浓度。
4.3 如果需要进一步优化，可以提高缓冲盐的浓度，如从50Mm~250mM。
4.4 如果目标蛋白仍然以级分的不对称峰洗脱，可以更换洗脱盐，如NaCl改为NH4CL。
4.5 尿素和有机修饰剂等添加剂某些蛋白的回收率。
5 通量的优化
优化方案主要需要考虑产品回收率和吞吐量之间的关系。
使用实际给料过程的前沿分析检测对目标蛋白的动态结合能力。
由于在样本应用程序中，动态结合能力是流速的函数，突破能力必须通过各种不同的停留时间来定义（流速），以显示最佳的吞吐量水平。
6 放大
在实验室规模的方法得到优化之后，可以按比例进行放大。
6.1 根据载量的需要选择柱床体积。
6.2 选择一个直径合适的柱子使柱床高度能达到10~45cm之间，为了充分利用Capto MMC，在大规模生产时我们建议柱床的高度为20cm或更高。
6.3 在进行放大实验时，在增加柱子直径和体积流量的同时通常都会保持柱床高度和流速恒定。
然而，在优化方案时会优先选择小的柱体积，这是为了节省样品和缓冲液，如优化动态结合能力等参数时会选择比最终高度更低的柱子高度。
只要保留时间是恒定的，目标分子的结合能力就保持不变。
其它的因素如关键杂质的清洗会随着柱床高度的改变而改变，需要在最终柱床高度进行验证。
滞留时间近似等于柱床高度与流速的比值。
7 实验室规模柱子的填装
以下是关于实验室规模柱子的填装的说明：10cm柱床高度的Tricorn 5/100, Tricorn 10/100, XK 16/20；40cm的XK 16/70。
需要更详细的了解Tricorn的填装，可以查看相关资料。
7.1 填装Tricorn 5/100 and 10/100
7.1.1材料：Capto MMC；玻璃过滤漏斗；塑料勺；过滤瓶；量筒；20%乙醇
媒介的量：所需的Capto MMC可以通过以下公式计算：柱子的横截面积(cm2)×柱床高度(cm) ×压缩因子（媒介的沉降体积/填装后媒介的体积）。
压缩因子近似等于1.15。
例如：柱床高度为10cm的Tricorn 5/100需要的沉降媒介体积为：0.78 ×10×1.15=9ml。
准备悬浮液：悬浮液的体积等于沉降媒介体积除以悬浮液的浓度。
填装的时候，悬浮液的浓度应该达到60%。
平衡所有的物料至室温，将玻璃过滤漏斗安装到过滤瓶上。
将填料倾倒至漏斗并用20%乙醇洗涤(每1ml填料使用6ml的20%乙醇)。
将沉降的填料转移至烧杯加入适量的20%的乙醇。
为了最终得到一个准确的柱床高度，悬浮液过夜静置或3000rpm离心3min后，使用量筒进行测量，度数前应等待5min。
也可以先使用过量的填料装住然后再移去多余的填料。
7.1.2 填装步骤
1.
8 装柱效果的评价
通过测定柱效来检查装柱的质量。
在装柱和柱子的工作寿命之间应定期测定柱效，特别是柱子的分离性能降低的时候。
柱子效果的最好的表达方式是在同等高度条件下的理论塔板（HEPT）和非对称因子（As），使用1%的丙酮溶液作为样品，可以很容易的检测出以上两者的值。
氯化钠也可以作为检测物质，使用2M、0.5M的氯化钠水溶液作为洗脱液。
注解：计算出来的塔板数会随着检测条件的变化而变化，它只能作为一个参考值。
保持测试条件和设备的稳定对于结果的可比性是非常重要的。
溶质、溶剂、洗脱液、上样体积、流速、液体通路、温度等的变化都会对结果造成影响。
为了达到最佳的效果，上样体积应为柱床最大体积的 2.5%，流速应为15~30cm/h。
如果定义一个与柱效相关的验收极限，柱子的理论塔板数可以作为柱子使用的验收标准。
理论塔板（HETP）和不对称因子（As）的测量方法：
HETP=L/N N=5.54×(V R/W h)2
L为柱床高度（cm）
N为理论塔板数
V R为从进样开始至峰最高值的洗脱体积
W h为1/2最高峰处的峰宽
折合板高常作为柱效比较的参数。
可通过以下公式计算：HETP/d
d为填料的粒径，指导性原则：<3通常都可以接受。
吸收峰应该是对称，不对称因子应尽可能接近与1（08~1.5之间均可以接受）。
峰形的改变常常是柱床发生改变的第一个迹象。
不对称因子的计算方法：A S=b/a
a为10%峰高处的半峰宽（前）
b为10%峰高处的半峰宽（后）。
以丙酮为标志物，通过紫外检测的计算HETP和A S的经典方法，如下图所示。
9 保养
为了能使Capto MMC在工作寿命期间保持最好的分离效果，按以下步骤进行保养。
9.1 平衡
在装柱之后或进行层析操作之前，使用至少5个柱床体积的起始缓冲液冲洗，或者直到流穿的电导和pH值保持不变。
9.2 再生
每次分离后，用高离子强度的溶液洗脱可逆性的结合物（例如2M NaCL的缓冲液），此外将pH调至10~11。
使用至少5个柱床体积的起始缓冲液冲洗，或者直到流穿的电导和pH值保持不变。
9.3 原位清洗
原位清洗是指除去柱子再生之后仍残留的脂肪、内毒素、沉淀或变性蛋白质等污渍。
在用粗料液上样的时候常会带来这样的杂质。
定期的原位清洗能够防止污渍在柱床的堆积，还可以保持Capto MMC的载量、流速和常规性能。
应根据污渍类型的不同设置特定的原位清洗步骤。
原位清洗的频率取决于环境和料液的情况，但是对于捕获来说，建议每次循环后都进行一次原位清洗。
9.4 消毒
为了除去柱子中的微生物，建议使用0.5~1.0M NaOH 洗涤1h。
原位清洗步骤中的针对沉淀和疏水性结合的蛋白或脂蛋白所采取的步骤能有有效去除清污和消毒。
9.5 储存
将不使用的填料在4~30 o C储存于容器中，确保容器的密闭的。
填装的柱子应使用20%乙醇平衡以防止细菌的生长。
储存的填料在使用之前应先使用至少五个柱床体积的缓冲液平衡。
