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膜片钳讲课

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膜片钳技术讲座幻灯

膜片钳技术讲座幻灯

1. 膜片钳技术简介


1976 年 德 国 马 普 生 物 物 理 化 学 研 究 所 Neher 和 Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电 位的同时，记录到乙酰胆碱（Acetylcholine, ACh） 激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术 （patch clamp techniques）。 1980 年 Sigworth 等 获 得 10-100GΩ 的 高 阻 封 接 （Giga-seal），1981年Hamill和Neher等对该技术 进行了改进，引进了全细胞记录技术，从而使该 技 术 更 趋 完 善 ， 1983 年 10 月 ， 《Single-Channel Recording》一书的问世，奠定了膜片钳技术的里 程碑。

内向电流（Inward current） 从细胞外进入细胞内的正离子（如Na+ ）电流或从
细胞内流向细胞外的负离子（如Cl-）电流。

外向电流（Outward current）
从细胞内流向细胞外的正离子（如K+）电流或从细
胞外流向细胞内的负离子（如Cl-）电流。
3. 膜片钳系统中的电阻
膜电阻（Membrane resistance, Rm） 指脂质双分子层的跨膜电阻，反映离子是否容易 穿透细胞膜。在细胞膜离子通道关闭时， Rm很大， 可达几百MΩ。不同于膜电容， 各种细胞的Rm 变异 较大。 膜输入阻抗（Membrane input resistance, Rin） 对 Rm 的测量是通过对膜输入阻抗的测量间接得到 的。给细胞膜施加一系列刺激方波，测定跨膜电流， 根据欧姆定律即可求出Rin 。注意要在形成全细胞记 录时测定，在形成高阻封接时， Rin =Rseal。

膜片钳与ltp-ppt课件

膜片钳与ltp-ppt课件

LTP原理
电生理记录上反映为EPSP 或EPSC幅度的增加，即 LTP。
2211
记录电极
~
海马脑片LTP
海马脑片上电极的放置
2222
大鼠体重：180-240g
在体LTP
刺激电极: 采用针灸针，多为 双极电极 定位坐标(mm)：AP 8，LM 4， DV 3.2-3.5 记录电极：采用针灸针，为 单极电极 定位坐标(mm)： AP 4，LM 2， DV 3.2-3.5
1144
膜片钳技术的应用
细胞特性的研究 离子通道的鉴别 电压门控性离子通道的动力学特性研究 突触联系、突触传递的研究 疾病机制研究 药物筛选 其他
1155
突触可塑、学习记忆及其机制的研究
长时程增强（LTP）是评价学习记忆及其突触可塑的常用的电 生理指标。目前，海马脑片离体实验己经广泛用于学习记忆方面 的研究，利用膜片钳技术记录脑片LTP，可在细胞水平研究学习 记忆的机制。 当今从不同方面对突触LTP与学习记忆的关系进行了大量的研 究，其结果大致可概括为： 影响LTP的因素确实对学习研究过程产生明显的影响 影响学习过程的因素也影响LTP形成 诱导海马脑区的LTP形成可提高学习记忆活动，学习过程中伴 有海马脑区LTP的形成。
（1）一般电学性质：通过I-V关系计算单通道电导，观察通道有无整流。通过离子选 择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。 （2）动力学：开放时间、开放概率、关闭时间、通道的时间依赖性失活、开放与关闭 类型（簇状猝发样开放与闪动样短暂关闭），化学门控性通道的开、关速率常数等。 （3）通过对全细胞激活曲线或失活曲线的分析，可得到半数激活或失活电压Vh及斜率 因子K。 （4）药理学：阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响。 （5）综合分析得到最后结论。

膜片钳技术原理及相关基本知识ppt课件

膜片钳技术原理及相关基本知识ppt课件

冲动，最终形成嗅觉或味觉。
• 机械门控通道
一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏 感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多 的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后
者仅发现于内皮细胞和心肌细胞
• 水通道
2003年诺贝尔化学奖：
Pete Agre、 Roderick MacKinnon
失活 状态
Inactive
state
复活
recovery 静息 状态
resting state
二、门控特性(Gating)：
失活状态不仅是通道处于关闭状态， 而且只有在经过一个额外刺激使通道从 失活关闭状态进入静息关闭状态后，通 道才能再度接受外界刺激而激活开放。
失活
inactivation
开放 状态
.
20
History of Ion Channel Study
• 1955年，Hodgkin和Keens应用电压钳(Voltage
clamp)在研究神经轴突膜对钾离子通透性时发现， 放射性钾跨轴突膜的运动很像是通过许多狭窄空洞 的运动，并提出了“通道”的概念。
• 1963年，描述电压门控动力学的Hodgkin-Huxley模
善，真正开始了定量研究，建立了H－H模型（
膜离子学说),是近代兴奋学说的基石。
.
19
• 1948年，Katz利用细胞内微电极技术记录到了
终板电位；1969年，又证实N－M接触后的Ach 以“量子式”释放，获1976年Nobel奖。
• 1976年 ，德国 的Neher 和Sakmann 发明Patch
激活
activation
open state
.

膜片钳PPT课件

膜片钳PPT课件
2021
（二） 受体:细胞膜或细胞内能与某些化学物质(递质、调质、激素) 特
异性结合并产生生物效应的特殊分子。细胞膜上涉及到离子通道的主要受体：
Glu能离子型受体
激动剂
拮抗剂
AMPA
GluR1 Glu
CNQX
GluR2 AMPA
GluR3
GluR4
Kainate
GluR5 Glu
CNQX
GluR6 KA
• 配制切片液及灌流液ACSF，冻存切片液至冰水混合态 • 二元气饱和ACSF • 动物麻醉、断头、取脑、切片 • ACSF中孵育脑片至少30min • 拉制玻璃电极 • 脑片入记录槽，持续ACSF灌流1-3ml/min • 低倍镜定位，IR-DIC镜选择靶细胞
2021
23
• 玻璃微电极充灌电极内液(预配)，并固定于电极夹持器 • 维持电极正压，入液，补偿液接电位 • 操纵电极尖端至靶细胞上方，压之有凹痕（快） • 撤正压，予负压，予半量钳制电压，GΩ（1min 内）封接
1. 结构研究：生化确定蛋白质氨基酸序列+X线衍 射确定结构+……
2.功能研究：电生理技术（膜片钳） +……
3.结构和功能相结合：电生理技术（膜片钳） +转 基因技术+……
2021
3
电流钳----测电压
向细胞内注入恒定或变化的电流，记录相应膜电位变化
电压钳----测电流
为负反馈系统。注入电流，同时钳制电压于固定的某值，此时注入电流恰 好与离子通道开放产生的离子流大小相等，方向相反，以此得知该离子流大 小及方向。
后予全量钳制电压
• 补偿C-fast，破膜 • 补偿C-slow，稳定10-15min

膜片钳讲课学习资料

膜片钳讲课学习资料
术 枪乌贼巨突轴动作电位 1963年诺贝尔医学或生理学奖 1980－1981年 Neher、sakeman 膜片钳技术 1991年诺贝尔医学或生理学奖
电压钳技术（voltage clamp )
钳制细胞膜电位于指定水平（反馈电 路）
改变电压敏感性离子通道的开放或关 闭
欧姆定律：Im＝g×Vm 膜电导（膜对离子通透性，g） 膜电位（Vm） 膜电流（ Im)
液压三维操纵器
accueil
techniques
Electrodes
culture
tranches
electrodes
equipement
scellement
accueil
techniques
culture
全细胞记录示意图
tranches
electrodes
equipement
scellement
Human Liver Fibroblasts
Human Aortic Endothelial Cells
[5, 13, 14]
细胞准备：来源于动物
双酶酶解分离法（胶原酶＋蛋白酶） 心脏冰盐水主动脉逆行插管 langendoff灌流装→置台氏液 无钙台氏液→低钙胶原酶台氏液灌流 剪成1mm大小心肌碎片→蛋白酶孵化
膜片钳技术简介
丁仲如
Molecules vs. circuits
Bilayer
= capacitor
Ion gradient = battery Channel = conductance
Out
GK CM
EK
In
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Structure of Na+ Channel

【医学PPT课件】1991年诺贝尔生理医学奖-膜片钳技术

【医学PPT课件】1991年诺贝尔生理医学奖-膜片钳技术

• 应用膜片钳技术可证明受体的存在并进行受体分 型，即通过快速换液装置加相应的激动剂、拮抗 剂及变构性调制剂，记录膜单通道的离子电流， 并根据受体的动力学及其它特性来证明所要检测 的受体。
• 膜片钳技术扩展了电生理技术的应用范围，如以 往因技术缘故难以研究哺乳动物的小细胞或脆性 很大的细胞，而今用膜片钳技术则可进行研究。
膜片钳技术原理图
Electrophysiology-Apparatus
Faraday cage
Microscope
CCD Camera
Vibration Isolation Table
Micro-Manipulators Remote Controller
Amplifiers
Electrophysiology-Apparatus
DAD-VC system
MicroManipulators
CCD Camera
Patch clamp
膜片钳法的各种模式
• 首先建立的单通道记录法（single channel recording）是细胞吸附式（cell-attached mode），其 后又建立了膜内面向外模式（inside-out）和膜外面 向外（outside-out）的模式。后来，又分别建立了开 放细胞吸附内面向外模式（open cell-attached insideout mode）和穿孔囊泡外面向外模式（perforated cell-attached inside-out mode）。全细胞记录法是指 在常规的方法的基础上，附加穿孔膜片（perforated patch）的模式。
1991年诺贝尔生理医学奖
膜片钳技术
主讲人：唐国奎
获奖者简介
Neher出生于1944年，德 国人

膜片钳技术讲座幻灯

膜片钳技术讲座幻灯
膜片钳技术讲座
2002年11月20日
第一部分 膜片钳技术基本概念
第二部分
离子通道基本知识
第一部分
膜片钳技术的基本概念
主要内容
1. 膜片钳技术简介
2. 膜片钳系统中的电位（电压）与电流
3. 膜片钳系统中的电阻
4. 膜片钳系统中的电容
5. 膜片钳系统中的串联电阻和电容补偿 6. 膜片钳系统中的漏减功能 7. 膜片钳系统中的信号滤波

ρ l ρ cot(φ /2) Rp ＝Rshank＋Rtip＝ ＋ （ 1 － 1） π rs2 π rt rs
ρ为电极内液的电阻率，l为杆部长度；rs 为圆锥形的 起始半径（μm）；rt为电极尖端半径（μm）；φ为电 极尖端圆锥形的角度。

串联电阻（Series resistance, Rs）和 通路电阻（接触电阻）（Access resistance, Ra）
漏电阻（Leak risistance, RL） 又叫被动反应电阻（Passive resistance），亦即 稳态电阻（Steady-state resistance）。是指细胞膜在 某一钳制电位下离子通道恒定开启时细胞膜的阻抗。 在不同的钳位电压下， RL是不同的。计算公式为：

RL = ΔV/kΔI = ΔW/kΔD

膜片钳记录技术创立以来，记录方式的变化
经典记录模式： 贴附式（Cell-attached 或 on cell) 内膜向外式(Inside-out) 外膜向外式(Outside-out) 全细胞记录方式(Whole-cell recording) 发展记录模式： 穿孔膜记录方式（Perforated patches） 穿孔囊泡记录方式（Perforated vesicles） 高阻封接巨膜片记录方式（Gigaseal-Macropatch） 松散封接记录方式 (Loose patch clamp) 细胞内灌流记录方式(Intracellular perfusion patch) 巨大切割膜片钳记录方式（Giant excised patches）

膜片钳原理技 术PPT课件

膜片钳原理技 术PPT课件
27
kv2.1
2 nA
100 ms
Fig. Representative current of Kv2.1 channel in stable transfected HEK293 cell line. Whole–cells currents evoked during 250ms depolarizing voltage steps 10mv to rest potentials between –50 and +40mV from a holding potential of –50mV.
膜片钳原理技术
1
整体概述
概况一
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概况二
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概况三
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2Leabharlann 片钳简介345
6
膜片钳记录方式
7
8
膜片钳几种基本工作方式
9
Cell-attached recording
29
Fig. Effects of 10 µM
galantamine
on
I-V
relationship (B) and the
activation curve (C) of IK(DR) and IK(A).
In (B), each point represents
mean SEM of 7 cells for
(B) Rivastigmine caused both hyperpolarizing shifts of the steady-state inactivation of IK(A) and IK(DR) by 11 mV and 27 mV, respectively. n = 5.

膜片钳技术数据处理与分析课件

膜片钳技术数据处理与分析课件
通道开放
单通道电流基线的确认 如果通道开放时电流向上，则基线在最下面的位置
基线
Patch clamp training class
PPTA学p习r. 2交3-流25, 2014
4
膜片钳实验数据的处理
Patch clamp training class
PPTA学p习r. 2交3-流25, 2014
5
值中所占的比例较大。
（4）RC (8-coincident-pole)：用于时域数据。 （5）RC ( single-pole)：用于时域数据。 （6）8-pole Butterworth：用于频域数据。 （7）8-pole Chebyshev：用于频域数据。
Patch clamp training class
打开Analyze/Adjust/Baseline （1）Subtract mean of（去除均值法）：适用于去除直流偏移。 （2）Subtract slope of（去除斜率法）：适合于去除持续线性漂移。 （3）Subtract fixed value（去除固定值法）：适用于去除直流偏移。数值有正负之 分。 （4）Adjust manually（手工调零法）：适合于单通道电流的基线或基线漂移无规律。
Patch clamp training class
PPTA学p习r. 2交3-流25, 2014
16
膜片钳实验数据的处理
信号采集后的滤波
Patch clamp training class
PPTA学p习r. 2交3-流25, 2014
17
膜片钳实验数据的处理
Clampfit滤波类型
Lowpass
信号幅度不发生大的变化，而噪声幅度却降低为原来的1/√N。
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enregistré.
膜片钳记录四种模式
全细胞记录：whole cell recording 单通道模式 cell attached 外面向外：outside out 内面向外：inside out

Patch clamp configurations
OUTSIDE-OUT
WHOLE-CELL
Structural
• Biochemistry • Molecular biology • Structural (x-ray, etc.
离子通道研究简史
1903年 Einthoven 第一份体表心电图 1952年Hodgken、Huxley 电压钳技术 枪乌贼巨突轴动作电位 1963年诺贝尔医学或生理学奖 1980－1981年 Neher、sakeman 膜片钳技术 1991年诺贝尔医学或生理学奖

膜片钳系统组成
膜片钳负反馈放大器 Data/digital
adapter 玻璃微电极操纵系统 Pclamp 软件系统：发放脉冲、采 集数据、分析数据
accueil
techniques
culture
tranches
electrodes
equipement
scellement
Les Appareils
Na+
Ca2+
Catio n
Kir 2P TTX-s TTX-r S, C, D, F A, B, E G, H, I Pacemak er
16 15 6 4 4 3 3 4
Ca2+ channel diversity
Na+ channel diversity
K+ channel diversity

细胞准备：其它来源
来源于培养细胞：直接蛋白酶消化 来源于人心肌手术标本剪刀剪碎，蛋 白酶＋胶原酶孵化

电极要求





尖端1－2μm（加热拉制） 电阻2－4欧姆（双步拉制） 尖端光滑（热抛光） 电极内充填（电极内液）细胞内液 尖端无气泡、灰尘 电极内有银丝与膜片钳系统相连接 电极由液压三维操纵器操纵（精确致μm）

Molecular diversity of voltage-dependent ion channels
Ion K+ Name Kv Eag KCNQ SK Slo Gene s 27 8 5 4 3 Physiologically defined currents Neuronal delayed rectifier; A-current Cardiac fast ‘delayed rectifier’ M-current; cardiac slow ‘delayed rectifier’ Low conductance Ca2+-dependent High conductance Ca2+- and voltagedependent Inward rectifiers, G protein-activated Leakage (resting potential) Neurons, adult skeletal muscle, glia Cardiac muscle, some sensory neurons High voltage-activated (L-type) High voltage-activated (N, P/Q, R-types) Low voltage-activated (T-type) Cardiac muscle, some neurons
Functional
• Current clamp (record membrane potential) • Voltage clamp (record ionic currents) Macroscopic 2-electrode Whole-cell patch clamp Microscopic (single channels) Cell-attached Inside-out Outside-out • Gating current • Spectroscopy
谢谢！
Human Atrial Cardiomyocyte
Human Ventricular Cardiomyocyte
Human Liver Fibroblasts
Human Aortic Endothelial Cells
[5, 13, 14]
细胞准备：来源于动物
双酶酶解分离法（胶原酶＋蛋白酶） 心脏冰盐水主动脉逆行插管 langendoff灌流装置台氏液 → 无钙台氏液→低钙胶原酶台氏液灌流 剪成1mm大小心肌碎片→蛋白酶孵化→ 过滤 冰箱保存备用（大约可成活12小时）
1 ms
K+ channel
Na+ channel
O Depolarization O Depolarization I
C
C
Voltage
Conductance
10 ms
1 ms
钾通道电流电压曲线
Current-voltage curves
i
G / Gmax 1.0 pA 15 10 5
p
I=Npi
膜片钳技术简介
丁仲如
Molecules vs. circuits
Bilayer = capacitor
Ion gradient = battery Channel = conductance
Out
GK EK
CM
In
Structure of Na+ Channel
Methods for studying ion channels
CELL-ATTACHED
INSIDE-OUT
Pull
Suction
Pull
Cell-attached patch-clamp recording
Whole-cell patch-clamp recording
单通道记录
记录单个离子通道开放或关闭 通道门控动力学分析 开放时间 概率 单通道电导测定
mV
40 ENa
Voltage
0
-40 Vrest EK GNa GK
-80 Conductance
40
mS cm2 0 Stimulus
2 ms
电压钳技术



首次记录了动作电位及离子通道电流 Hodgken－Huxley电压门控动力学模型 缺点： 双微电极，要求细胞大，细胞小不能进行 背景噪声大（1000pA） 无法记录单个离子通道（1－2pA）

电压钳技术（voltage clamp )
钳制细胞膜电位于指定水平（反馈电 路） 改变电压敏感性离子通道的开放或关 闭 欧姆定律：Im＝g×Vm 膜电导（膜对离子通透性，g） 膜电位（Vm） 膜电流（ Im)

电压钳技术
Action potential – squid giant axon
10 ms
Na+ channel
Energy levels C
2
C O I
1000 2000 1000
O I
Rate constants
C
O
10
I
C
20
O
10
I
20000
Voltage
Current through single channels
Current through many channels
液压三维操纵器
accueil
techniques
culture
tranches
electrodes
equipement
scellement
Electrodes
accueil
techniques
culture
tranches
electrodes
equipement
scellement
全细胞记录示意图

Patch clamp recording
Glass microelectrode
Suction
1 µm
"Giga-seal"
Cytoplasm
Ion channels
Cell membrane
膜片钳技术
利用一个微电极同时完成膜片或全细 胞电位的监测、钳制和膜电流的记录 通过膜电流的变化分析个体或群体离 子通道分子的电活动 精度：电流1pA（10－9A） 时间：10mS 空间：1μm
Open channel block
Closed Open Blocked
C
O OB
B
Ball-and-chain model for inactivation
Closed Open Inactivated
C
O I
膜片钳技术
要求电极与细胞良好封接 减少电极尖端与细胞膜之间产生漏流， 以减少背景噪音 措施：小膜片；电极双步拉制；尖端 热抛光； 50M欧姆 负压吸引：偶然发现，使阻抗达109欧 姆（giga seal ）
nA 15 10
K Na
0.5 50 100 -100 -50
K Na
50 100
5
-100
-50 -5 -10 -15
-5 -10 -15
-100
-50
0 mV
50
100
化学门控通道
膜片钳技术进展
与分子生物学结合研究离子通道不同 的亚基 与PCR技术结合研究单个细胞电生理及 某种表达产物的PCR研究 与绿色荧光蛋白标记显像技术结合 活体组织直接行膜片钳研究